ברצוננו להודות לד&quot;ר. Leslayann Schecterson, יואן ואנג, אנדרס Barria וגברת Ximena Optiz-Araya לסיוע ראשוני עם פרוטוקול הגדרת למתן פלסמידים. עבודה זו נתמכה על ידי NIH / NIDCD מענק DC013841 (JTS).

כל הנהלים אושרו על ידי אוניברסיטת נורת &#39;ווסטרן טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדות, וביצעו בהתאם המוסדות הלאומיים לבריאות הנחיות לטיפול ושימוש של חיות מעבדה. 1. טיפול ביצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת ביצים מופרות מספק מקומי. שמור ביצים על 13 מעלות צלזיוס במקרר לא יותר מ 5 ימים לפני הדגירה. עוברי הכדאיות יורדת באופן משמעותי לאחר שבוע 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוגית כל ביצה עם אתנול 70% לפני ההגדרה בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע 1-2 תריסר ביצים על צדם בחממה עם הטמפרטורה מוגדר 38 ° C ב לחות 50%. זה מבטיח מיקום העובר הנכון electroporation ואת הכדאיות האופטימלית, בהתאמה. הערה: לאחר 48-52 שעות של הדגירה, הביצים יהיו בבית המבורגר המילטון (HH) שלב ~ 12-13 ומוכן electroporation. </li></ol> 2. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסמיד מיXing <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μL של 0.1% ירוק מהיר (0.1% ב 18 MΩ deionized ו מזוקקים H 2 O [DDH 2 O]) עבור כל 7 μL של תערובת DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור שיתוף electroporation של פלסמידים מרובים, לערבב פלסמידים ביחס 1: 1. ריכוז ה- DNA הסופי צריך להיות 5-8 מיקרוגרם / μL. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילוי הזרקת פיפטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך pipettes על משיכה micropipette. ממלאים את פיפטה עם 1-2 פלסמידים μL באמצעות מחט 28G מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור קצה פיפטה 10 - 20 מיקרומטר באמצעות מלקחיים. השתמש במיקרוסקופ כדי לסייע בקביעת גודל קצה פיפטה שבור. צרף את פיפטה לבעלים פיפטה של ​​picospritzer. </li></ol></li></ol> 3. חלון הערה: הליך החלונות פורסם לפני 13 . עיין באיגוד 13 למידע חזותי נוסף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגבו את כל המכשירים ואת אזור העבודה עם 70%אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את המספר הרצוי של ביצים להגדיר מתוך האינקובטור (בין 6-10), לעזוב בטמפרטורת החדר, בנפרד ביצים ספוג עם אתנול 70% שוב. ביצים להישאר קיימא לפחות 2 שעות לאחר הסרת חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הביצה על גבי אור אור כדי לזהות את המיקום העובר. מעגל את מרכז האזור הכהה ( כלומר , עובר) עם עיפרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט 19G, לתקוע חור בקצה הסופי של הביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקעו חור נוסף ליד המעגל המצויר על הצד המחודד של הביצה. הסר חתיכה קטנה של קליפת החיצונית (כ 16 מ&quot;מ 2 ) עם מחט 19G ולאחר מכן להסיר חתיכה קטנה של קליפת הביצה הפנימית (כ 8 מ&quot;מ 2 ) עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מזרק 3 מ&quot;ל מצויד מחט 19G, למשוך 1.5-2.5 מ&quot;ל של אלבומין מהביצה דרך חור קהה סוף. הקפד זווית המחט למטה ב 45 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את החור הקצה בקצה עם חתיכת סרט קטנה (1 ס&quot;מ x 1 ס&quot;מ). לכסות את המעגל נמשךד החור השני עם קלטת (2.5 ס&quot;מ x 4 ס&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מספריים מעוקל (חיתוך קצה = 2.5 ס&quot;מ), לחתוך חלון בתוך המעגל. מספריים צריך להיות מקביל קליפה ואת הקוטר של החלון צריך להיות פחות מ 2 ס&quot;מ. </li></ol> 4. הזרקה פלסמיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את picospritzer. הגדר את הלחץ 18 psi ואת משך עד 5 μs. הפעל את טנק אוויר מנורה עבור מיקרוסקופ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון 30 מ&quot;ל המניות של דילול 1:10 של חנות קנה דיו הודי מעורבב סטרילי פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). חנות ב 4 ° C. הזרקת דיו הודית היא צעד חשוב כדי לקבל הדמיה טובה יותר של העובר עוף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים מזרק 1 מ&quot;ל עם פתרון דיו הודי מדולל. צרף מחט 27G ו לגרש כל הבועות כי הם נמצאים מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחט רק מתחת לממברנה חלמון ~ 2 - 3 מ&quot;מ מן העובר להזריק ~ 0.2 מ&quot;ל של דיו הודית בעדינות מתחת לעובר. לַעֲשׂוֹתלא להזריק יותר מ 0.5 מ&quot;ל של דיו הודית כפי שהוא עשוי להקטין את הישרדות העובר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הביצה בחלון על בעל ביצה מתחת למיקרוסקופ לנתיחה. השתמש ההגדלה הגבוהה ביותר עבור הדמיה הטובה ביותר של האתר הזרקה פלסמיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להסיר את הממברנה על אזור ההזרקה. אזורי שמיעה שמיעה של אינטרסים ( כלומר , NM ו- NL) נובעים Rhombomeres 5 ו 6 (R5 / R6). R5 / R6 ממוקמים סמוך לאוטוציסט (מבנה עוברי בחוליות המתפתח באוזן הפנימית), המשמשים כציוני דרך עבור זריקות פלסמיד R5 / R6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להנמיך את פיפטה מלא DNA לתוך הצינור העצבי שמעל אזור R5 / R6 ובין otocysts באמצעות micromanipulator. סכמטי של מיקום אידיאלי מוצג באיור 1 א . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לחץ אוויר (18 psi, 5 μs משך) מן picospritzer להוציא את ה- DNA של הצינור העצבי. </li></ol> 5. Electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את tהוא הנוכחי / מתח ממריץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו מזרק 3 מ&quot;ל עם PBS ו לצרף את מסנן מזרק. הוסף 1-2 טיפות של PBS על העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להנמיך את האלקטרודה דו קוטבית לעובר באמצעות micromanipulator עם האלקטרודה השלילית מעל האתר ההזרקה (המדיאלי) ואת האלקטרודה חיובית לרוחב R5 / R6 ( איור 1 א ). הימנע מגע ישיר עם העובר. השתמש אלקטרודות דו קוטבית שבו חומר האלקטרודה הוא אירידיום פלטינה. התאם את המרווח בין הטיפים 0.5 מ&quot;מ עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מתח הנוכחי / מתח, דופק 20 פעמים ב 50 V עבור 1 אלפיות השנייה במרווחים של 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר electroporation, להוסיף טיפה אחת של PBS על פני השטח חשוף. בעדינות להסיר את האלקטרודה ולנקות אותו עם רקמה מעבדה 70% אתנול. סגור את החלון לחשוף את העובר עם קלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית ביצה עם סוג פלסמיד מוזרק ואת תאריך הצוהר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום ביצים בחזרה לתוך חממה עם הצד החלון למעלה. דגירה על 38 מעלות צלזיוס עם 50לחות עד לשלב ההתפתחות הרצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם וקטור טט על הוא electroporated לשליטה הזמנית של ביטוי גנים, להחיל Doxycycline (Dox) כל 24 שעות כדי לעורר ביטוי גנטי (ראה סעיף 6). </li></ol> 6. Tet על מערכת עבור שליטה זמנית של ביטוי גנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פלסמידים הבאים: PCAGGS-T2TP: טרנספוזאז להביע פלסמיד. PT2K-CAGGS-rtta-M2: פלסמיד כי ביציבות מבטא את חלבון דוקס מחייב. PT2K-BI-TRE-EGFP: פלסמיד המכיל מקדם דו-כיווני דו-כיווני (TRE), המביא לידי ביטוי את הכתב של EGFP ואת הגן השני המעניין. הערה: שלוש פלסמידים לעיל צריך להיות שיתוף electroporated ביחס 1: 1: 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרון המניות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים Dox סטרילי PBS לייצר פתרון 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​המניות. חנות ב -20 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישום Dox: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעורר את האקספרסיביותN של הגן של עניין במהלך שלבי התפתחות מסוימים, להחיל Dox כל 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר החלת Dox, לקחת את הביצה החוצה, לפתוח את החלון, פיפטה 50 Dox μL על הממברנה chorioallointoic, לסגור את החלון והכניס את הביצה בחזרה לתוך החממה. </li></ol></li></ol> הכנת אזור הניתוח לפרוסות גזע המוח הערה: הסעיפים הבאים (7 - 9) והנהלים פורסמו לפני 14 . עיין בפניות אלו לקבלת מידע חזותי נוסף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון אגר (40 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​agarose, כלומר 4% ב DDH 2 O). יוצקים פתרון אגר לתוך צלחת פטרי ולאפשר לו לחזק בטמפרטורת החדר. חנות מכוסה צלחת אגר במקרר לשימוש עתידי במהלך חיתוך גזע של רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רציף בועה מלאכותית של המוח השדרה (ACSF) עם 95% O 2 ו 5% CO 2 (pH 7.2-7.4 ו osmolarity: 295-310 mOsm / L).</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את אזור העבודה ואת vibratome עם EtOH 70% ולשטוף את הלהב עם מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים משטח קליטת נוזל נקי על אזור העבודה עם כלי הניתוח המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את צלחת אגר מתוך המקרר, לחתוך קוביית אגר קטן (10 מ&quot;מ x 10 מ&quot;מ x 8 מ&quot;מ). דבק את גוש אגר אל הבמה של החדר vibratome-sllicing באמצעות סרגלינג זמין מסחרית. </li></ol> 8. בידוד של עוף אודיורי המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הביצה באתר החלון מוקלט. לנקב את שק הממברנה עם אזמל ולהסיר את הראש של העוף עוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף את העוף במספריים חדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את קצה הלהב מעט אחורי לעיניים. חתך דרך הגולגולת על קו האמצע מקורי אל הזנב. החל לחץ קל בהתאם לגיל העובר. עוברים מבוגרים דורשים יותר לחץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לדחוף הצידה עור ונוצות לחשוף את הגולגולת ולאמת לחתוך קו האמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגשת בקשהלחץ trong, פרוסת החלק מקורי של הגולגולת עם סכין גילוח. מיד מקום להב האחורי לעיניים לחתוך דרך הגולגולת כולה ורקמת המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך חתכים midline ל-לרוחב עם מספריים באזור הזנב של הגולגולת, שרירי הצוואר הקדמי מעט על שני צידי הראש.לגלות המוח והמוח על ידי משיכת משם הגולגולת ורקמות עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים רקמות המצורפות גזע המוח עם מספריים ולהסיר את גזע המוח, אשר חופשיים חופשי מן הגולגולת. </li></ol> 9. הכנת פרוסות גזע עבור ויוו Electrophysiology או הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להצמיד את המוח דרך tecta אופטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח הקטן על ידי חיתוך peduncles עם מספריים, לחשוף את הרצפה של החדר הרביעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פינצטה, להסיר את כל רקמות קרום וכלי הדם משטח גזע המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחסום את גזע המוח, לעשות חתך אופקית בקצה מקורי ביותר של הרצפה של הארבעההחדר, רק הזנב אל קליפת המוח. הפוך חתכים לרוחב בניצב דרך tecta אופטי לבודד את גזע המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כמות קטנה של דבק סופר על שלב vibratome ישירות מול בלוק אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את גזע המוח על חוט השדרה באמצעות פינצטה ומניחים אותו על דבק סופר עם הצד מקורי למטה בצד הגבי לכיוון להב vibratome. הסר דבק עודף עם רקמות מעבדה או נייר סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים ACSF חמצן לתוך שלב vibratome. הגדר את הלהב vibratome בזווית 20-22 מעלות. התחל vibratome ב-תנודה משרעת מקסימלית. להזיז את הבמה כלפי הלהב כך החלק העליון של הרקמה מקביל עם הלהב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר במהירות להב אל רקמת המוח. להאט את הלהב במידה ניכרת לפני מגע הלהב עם רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסת רקמה עם המהירות האיטית ביותר האפשרית קדימה. לאחר להב הוא דרך כל החלק רקמות העטרה, בעדינות להסיר את הפרוסה באמצעות פיפטה העברת/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחתון את הבמה 200-300 מיקרומטר ו פרוסת שוב. חזור על עד ציוני דרך אנטומיים של גרעיני השמיעה להיות גלוי, למשל, באזור neuropil הגב / הגחון נפרדת של NL ואת המיקום המדיאלי של NM ביחס NL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשמור על פרוסות ACFS. זה יכול להיעשות בטמפרטורת החדר (22 מעלות צלזיוס) או ליד תנאים פיזיולוגיים (~ 41 מעלות צלזיוס) באמצעות אמבט מים חמים. הערה סדר חיתוך. הפרוסה הראשונה מתאימה לאזור הזנב ביותר של רקמות הפרוסה האחרונה מתאימה לאזור מקורי ביותר. זה מייצג בצורה גסה את הארגון הטונוטופי של גזע המוח השמיעתי, מאזורי קידוד נמוכים לתדר גבוה, בהתאמה. </li></ol>

<ol>
	<li>Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sound+localization+in+mammals.">Mechanisms of sound localization in mammals.</a> Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).</li><li>Anderson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+timing+is+linked+to+speech+perception+in+noise.">Neural timing is linked to speech perception in noise.</a> J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).</li><li>Shannon, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speech+recognition+with+primarily+temporal+cues.">Speech recognition with primarily temporal cues.</a> Science. 270 (5234), 303-304 (1995).</li><li>Carr, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+development+of+time+coding+systems.">Evolution and development of time coding systems.</a> Curr Opin Neurobiol. 11 (6), 727-733 (2001).</li><li>Carr, C. E., Soares, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+convergence+and+shared+computational+principles+in+the+auditory+system.">Evolutionary convergence and shared computational principles in the auditory system.</a> Brain Behav Evol. 59 (5-6), 294-311 (2002).</li><li>Rubel, E. W., Parks, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken:+tonotopic+organization+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris.">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 164 (4), 411-433 (1975).</li><li>Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken:+ontogeny+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris.">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 166 (4), 469-489 (1976).</li><li>Schecterson, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrkB+downregulation+is+required+for+dendrite+retraction+in+developing+neurons+of+chicken+nucleus+magnocellularis.">TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis.</a> J Neurosci. 32 (40), 14000-14009 (2012).</li><li>Chesnutt, C., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-based+short-hairpin+RNA+interference+in+the+chicken+embryo.">Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo.</a> Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).</li><li>Oertel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+of+timing+in+the+brain+stem+auditory+nuclei+of+vertebrates.">Encoding of timing in the brain stem auditory nuclei of vertebrates.</a> Neuron. 19 (5), 959-962 (1997).</li><li>Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+auditory+brain-stem+nuclei+in+the+chick+hindbrain.">Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain.</a> Dev Biol. 224 (2), 138-151 (2000).</li><li>Cramer, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+signaling+promotes+axon+segregation+in+the+developing+auditory+system.">EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system.</a> Dev Biol. 269 (1), 26-35 (2004).</li><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies.">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. (8), e306 (2007).</li><li>Sanchez, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+culture+of+chicken+auditory+brainstem+slices.">Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li><li>Jhaveri, S., Morest, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+architecture+in+nucleus+magnocellularis+of+the+chicken+auditory+system+with+observations+on+nucleus+laminaris:+a+light+and+electron+microscope+study.">Neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the chicken auditory system with observations on nucleus laminaris: a light and electron microscope study.</a> Neuroscience. 7 (4), 809-836 (1982).</li><li>Matsui, R., Tanabe, Y., Watanabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+adeno-associated+virus+vector+efficiently+transduces+neurons+in+the+embryonic+and+post-embryonic+chicken+brain.">Avian adeno-associated virus vector efficiently transduces neurons in the embryonic and post-embryonic chicken brain.</a> PLoS One. 7 (11), e48730 (2012).</li><li>Koppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+nerve+terminals+in+the+cochlear+nucleus+magnocellularis:+differences+between+low+and+high+frequencies.">Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies.</a> J Comp Neurol. 339 (3), 438-446 (1994).</li><li>Hyson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+interaural+time+differences+in+the+chick+brain+stem.">The analysis of interaural time differences in the chick brain stem.</a> Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).</li><li>Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+hearing+in+the+chicken+embryo.">Emergence of hearing in the chicken embryo.</a> J Neurophysiol. 96 (1), 128-141 (2006).</li><li>Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+auditory+evoked+responses+in+the+cochlea+and+cochlear+nuclei+of+the+chick.">The development of auditory evoked responses in the cochlea and cochlear nuclei of the chick.</a> Brain Res. 63, 59-74 (1973).</li><li>Woolf, N. K., Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+auditory+function+in+the+cochlea+of+the+mongolian+gerbil.">The development of auditory function in the cochlea of the mongolian gerbil.</a> Hear Res. 13 (3), 277-283 (1984).</li><li>Walsh, E. J., McGee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+development+of+auditory+nerve+and+cochlear+nucleus+neuronal+responses+in+kittens.">Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens.</a> Hear Res. 28 (1), 97-116 (1987).</li><li>Uziel, A., Romand, R., Marot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cochlear+potentials+in+rats.">Development of cochlear potentials in rats.</a> Audiology. 20 (2), 89-100 (1981).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ב electroporation אובו היא שיטה להביע או להפיל גנים של עניין על מנת לנתח את תפקוד הגן vivo 8 , 9 . בעובר עוף, היא שיטה חדשנית להבעת גנים מקודדים פלסמיד לתוך אזורים שונים גזע המוח השמיעתי 8 . כדי להבטיח ביטוי אופטימלי, נדרש?...

קידוד עצבי מהיר של צליל הוא חיוני עבור פונקציות השמיעה נורמלי. אלה כוללים יכולות לוקליזציה צליל 1 , דיבור באפליה רעש 2 , ואת ההבנה של אותות תקשורת רלוונטיים אחרים רלוונטיים 3 . נוירונים אנלוגיים הממוקמים בגזע המוח השמיעתי של שני avians ו יונקים הם מאוד מיוחדים עבור קידוד עצבי מהיר 4 . אלה כוללים את גרעין העוף magnocellularis (NM), גרעין laminaris (NL) ואת האנלוגים יונקים שלהם, גרביים שבלול anteroventral (AVCN) ואת המדיום מעולה זית (MSO), בהתאמה. עם זאת, מנגנוני התפתחות המסדירים קידוד עצבי מהיר הם הבינו היטב את המוח השמיעתי. לכן, כדאי ללמוד גנים ספציפיים אשר אחראים על קידוד עצבי מהיר על מנת להבין טוב יותר את הביטוי, הרגולציה והפונקציה שלהם ב- auפיתוח דיטורי. העובר בפיתוח עוף הוא כלי מחקר יעיל ומבוסס ללמוד שאלות ביולוגיות בסיסיות של פיתוח מערכת השמיעה 6 , 7 . ההתקדמות המולקולרית האחרונות התייחסו לשאלות ביולוגיות אלה בעובר המתפתח על ידי הבעת או דפיקות גנים של עניין על מנת לנתח את תפקוד הגן vivo 8 , 9 . לחקור את התפקיד הרגולטורי של גנים ספציפיים היא התקדמות משמעותית בהבנת הפתולוגיות הקשורות גירעונות השמיעה. כאן, אנו מציגים electroporation אובו של גנים מקודדים פלסמיד לתוך המוח גזע עוף שמיעה שם קידוד עצבי מהיר של צליל מתרחשת 10 . על ידי מיקוד שמיעתי אזורים שמיעתי הקשורים rhombomeres 5 ו 6 11 , 12 (R5 /R6), אנו מראים שליטה מרחבית של transfection פלסמיד ב NM ו NL. בנוסף, אנו מראים הרגולציה הזמנית של הביטוי על ידי אימוץ טקט על וקטור המערכת. זהו הליך נוגד תרופה המבטא את הגנים של עניין בנוכחות doxycycline (Dox) 8 .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fertilized white leghorn chicken eggs</td>
			<td>Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>052-0500-900</td>
			<td>Picospritzer III, single or dual channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current/voltage stimulator</td>
			<td>Grass Technologies</td>
			<td>SD9</td>
			<td>SD9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfil syringe needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF28G67-5</td>
			<td>28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1280</td>
			<td>MP Series: Non-Electrical Pressure Applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulating microelectrode</td>
			<td>FHC</td>
			<td>PBSA1075</td>
			<td>PBSA1075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air tank/regulator</td>
			<td>NU Laboratory Services</td>
			<td></td>
			<td>Air dry 300 CF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>F7258-25G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear plastic tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9891-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg refrigerator</td>
			<td>Vissani Wine Refrigerator</td>
			<td></td>
			<td>13.3-16.1&#176; C (56-61&#176; F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Hova-Bator</td>
			<td></td>
			<td>37.8&#176; C (100&#176; F), ~50% humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4.35E+15</td>
			<td>SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold-light source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4.36E+15</td>
			<td>CL6000 LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>Model: MM-3</td>
			<td>2 Micromanipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-86-10</td>
			<td>Thick-walled borosilicate (dimensions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mL, 3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD Precision Glide&#160;</td>
			<td></td>
			<td>27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>No. 5 Super Fine Dumont</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg holder</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td></td>
			<td>Clay base works as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td></td>
			<td>Model P-97</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Ultra Cruz</td>
			<td>sc-358811</td>
			<td>PVDF 0.22 &#956;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in ovo electroporation in the chicken auditory brainstem

Electroporation היא שיטה המציגה גנים של עניין לתוך אורגניזמים ביולוגיים רלוונטיים כמו עוף העוף. זה כבר זמן רב כי העובר עוף הוא מודל מחקר יעיל לחקר תפקודים ביולוגיים בסיסיים של פיתוח מערכת השמיעה. לאחרונה, העובר עוף הפך חשוב במיוחד בחקר ביטוי גנים, רגולציה הפונקציה הקשורים השמיעה. ב electroporation אובו ניתן להשתמש כדי למקד אזורים המוח השמיעתי אחראי על פונקציות שמיעה מיוחדות מאוד. אזורים אלה כוללים את גרעין העוף magnocellularis (NM) ואת גרעין laminaris (NL). NM ו נוירונים NL נובעים מבשרי מובהק של rhombomeres 5 ו 6 (R5 / R6). כאן, אנו מציגים electroporation אובו של גנים מקודדים פלסמיד ללמוד מאפיינים הקשורים גנים באזורים אלה. אנו מראים שיטה לשליטה מרחבית וזמנית של ביטוי גנים המקדמים גם רווח או הפסד של פנוטיפ פונקציונליEs. על ידי מיקוד שמיעתי אזורים שמיעתי הקשורים R5 / R6, אנו מראים transfection פלסמיד ב NM ו NL. הרגולציה הזמנית של ביטוי גנים יכולה להיות מושגת על ידי אימוץ מערכת וקטורית. זהו הליך תרופתי מעורר אשר מבטא את הגנים של עניין בנוכחות doxycycline (Dox). ב ov electroporation טכניקה - יחד עם או ביוכימיים, פרמקולוגיים, או מבחני תפקודית vivo - מספק גישה חדשנית ללמוד פיתוח נוירון השמיעה תופעות פתופיזיולוגיות הקשורות.

אנו מראים כאן כי ב electroporation אובו מאפשר ביטוי גנים במערכת ביולוגית המתפתחת בדרך כלל. גנים מקודדים פלסמיד מוזרקים בפוקוס לתוך הצינור העצבי שמעל R5 / R6. דוגמה סכמטית של האלקטרודה ופיפטה מיקומים יחסית סמנים אנטומיים חשובים מוצג בתרשים 1A</stron...

Watch this Scientific Journal Video about In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem at JoVE.com

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

נוירונים גזעיים של גזע המוח של avians ויונקים הם מיוחדים עבור קידוד עצבי מהיר, תהליך בסיסי עבור פונקציות השמיעה הרגילה. נוירונים אלה נובעים מבשרי ברורים של המוח האחורי עובריים. אנו מציגים טכניקות ניצול electroporation להביע גנים במוח האחורי של עוברים עוף ללמוד תפקוד הגן במהלך פיתוח השמיעה.

ב Electrooration Ovo ב המוח עוף שמיעה

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

in-ovo-electroporation-in-the-chicken-auditory-brainstem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

8.4K Views.  Northwestern University.  נוירונים גזעיים של גזע המוח של avians ויונקים הם מיוחדים עבור קידוד עצבי מהיר, תהליך בסיסי עבור פונקציות השמיעה הרגילה. נוירונים אלה נובעים מבשרי ברורים של המוח האחורי עובריים. אנו מציגים טכניקות ניצול electroporation להביע גנים במוח האחורי של עוברי...

Video: In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

העברה יעילה ג&#39;ין בצ&#39;יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות:<em&gt; אקס-אוב</em&gt; גישת Electroporation

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental manipulations in ovo/in vivo makes the chicken embryonic retina a versatile and very efficient experimental model. Although the chicken retina is easy to target in ovo by intraocular injections or electroporation, the effective and exact concentration of the reagents within the retina may be difficult to fully control. This may be due to variations of the exact injection site, leakage from the eye or uneven diffusion of the substances. Furthermore, the frequency of malformations and mortality after invasive manipulations such as electroporation is rather high.
This protocol describes an ex ovo technique for culturing whole retinal explants from chicken embryos and provides a method for controlled exposure of the retina to reagents. The protocol describes how to dissect, experimentally manipulate, and culture whole retinal explants from chicken embryos. The explants can be cultured for approximately 24 hr and be subjected to different manipulations such as electroporation. The major advantages are that the experiment is not dependent on the survival of the embryo and that the concentration of the introduced reagent can be varied and controlled in order to determine and optimize the effective concentration. Furthermore, the technique is rapid, cheap and together with its high experimental success rate, it ensures reproducible results. It should be emphasized that it serves as an excellent complement to experiments performed in ovo.

This protocol describes a method to dissect, experimentally manipulate and culture whole retinal explants from chicken embryos. The explant cultures are useful when high success rate, efficacy and reproducibility are needed to test the effects of plasmids for electroporation and/or reagent substances, i.e., enzymatic inhibitors.

Explants רשתית שלם מעוף עוברים לטיפולי Electroporation וכימיים מגיב

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

העברת גנים לתוך האיברים השמיעתיים עוף ידי<em&gt; ב אובו</em&gt; מיקרו electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and molecular level. To alter intracardiac hemodynamics, fertilized chicken eggs are incubated in a humidified chamber to obtain embryos of the desired stage (HH17). Once this developmental stage is achieved, the embryo is maintained ex ovo and hemodynamics in the embryonic heart are altered by partially constricting the outflow tract (OFT) with a surgical suture at the junction of the OFT and ventricle (OVJ). Control embryos are also cultured ex ovo but are not subjected to the surgical intervention. Banded and control embryos are then incubated in a humidified incubator for the desired period of time, after which 2D ultrasound is employed to analyze the change in blood flow velocity at the OVJ as a result of OFT banding. Once embryos are maintained ex ovo, it is important to ensure adequate hydration in the incubation chamber so as to prevent drying and eventually embryo death. Using this new banded model, it is now possible to perform analyses of changes in the expression of key players involved in valve development and to understand the role of hemodynamics on cellular responses in vivo, which could not be achieved previously.

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

For the first time we present here a reproducible banding procedure to alter hemodynamics in the developing heart ex ovo. This is achieved by partially constricting the outflow tract (OFT).

רומן<em&gt; אקס אובו</em&gt; טכניקת פסים לאלטר ופרמטרים המודינמיים intracardiac במערכת עוף עוברי

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

העובר Microinjection ו Electroporation ב chordate<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

ב Electrooration Ovo ב המוח עוף שמיעה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

העברה יעילה ג'ין בצ'יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות:

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

Explants רשתית שלם מעוף עוברים לטיפולי Electroporation וכימיים מגיב

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח

העברת גנים לתוך האיברים השמיעתיים עוף ידי

רומן

העובר Microinjection ו Electroporation ב chordate

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence