בשיטות אובו ואקס אובו לחקר התפתחות האוזן הפנימית של העופות

גיל, זיהום ותרופות אוטוטוקסיות עלולים לגרום לניוון תאי השערה של האוזן הפנימית, מה שמוביל אצלנו לירידה בשמיעה. אצל בעלי חוליות שאינם יונקים, כגון אפרוח, תאי השערה יכולים להתחדש. הטכניקות המתוארות כאן עושות שימוש בעלות התועלת של עבודה על עוברי אפרוחים, בקלות השגת העוברים ובפיתוח אקסו טוב של צמחי רקמות.

הבנת ההתפתחות וההתחדשות של שערות האוזן הפנימית של העופות יכולה לספק תובנות חשובות לגבי ליקוי שמיעה וטיפולים פוטנציאליים, ותרבית צמחים יכולה להיות חשובה להערכת ההשפעות האוטוטוקסיות של תרופות שונות. לפני תחילת הניסוי, רכשו ביצים טריות, ונקו אותן עם 70% אתנול כדי למנוע זיהום. לדגור על הביצים במשך 3.5 עד 4 ימים, ב 37 עד 38 מעלות צלזיוס עם 45% לחות.

לאחר הדגירה, מקם מחדש את העובר לחלק העליון של החלמון, על ידי הנחת ביצית על צדו במשך חמש דקות. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי ליצור חור קטן בחלק העליון והקצה הקהה של הביצה כדי שמחט של 21 מדים תעבור דרכה. בעזרת מזרק של חמישה מיליליטר ומחט של 21 מיליליטר, מוציאים שני מיליליטר של האלבומין מחור בקצה הבוטה של הביצה.

מכסים את החור בקצה הקהה באמצעות סרט שקוף. כדי לגרום לחלון הביצה להדביק את הסרט השקוף לחלק העליון של קליפת הביצה. החזיקו את המחטים ממיקרו-הזרקה מנימי זכוכית סטנדרטיים באמצעות מושך פיפטה אנכי.

לאחר המשיכה, נתקו את קצה הנימים באמצעות מלקחיים עדינים כדי לקבל קוטר קצה של כ-50 מיקרומטר עם קצה מחודד. עבור ניסוי נוקאאוט הגנים, ערבבו את שלושת המבנים, כלומר פלסמיד המנחה, pcU6.1sgRNA, T2KeGFP, T2TP ביחס של אחד לאחד עם מיקרוגרם אחד של חלבון SP Cas9, 30% סוכרוז וצבע ירוק מהיר ב-0.1%, ונפח סופי של 10 מיקרוליטרים. בעת אלקטרופולציה של פלסמידים מרובים, ודא שהריכוז הסופי של הדנ"א הוא לפחות ארבעה מיקרוגרם למיקרוליטר.

בעזרת מספריים קפיציים לחתוך פתוח סביב חלון באורך שני סנטימטרים ו 1.5 ס"מ רוחב, ולחשוף את העובר. לאחר מכן השתמש במלקחיים כדי לפתוח את הקרומים הכוריוניים מעל העובר, ולאפשר גישה לעובר. להזריק כ-200 ננוליטר נפח של תערובת תמיסות DNA כדי למלא את שלפוחית השקית.

כדי לקבוע את יעילות ה- RNA המנחה בצע בדיקת אנדונוקלאז T7. יש להוסיף לעובר טיפות מלח של 0.719% כדי להוריד את ההתנגדות החשמלית ולמנוע התחממות יתר. לאחר מכן, מניחים את האלקטרודה החיובית דרך החור שנעשה בצד הבוטה של הביצה, ומתמרנים את האלקטרודה כך שהיא תהיה מתחת לחלמון.

מניחים את האלקטרודה השלילית מעל האוטוציסטה המלאה. כדי להעביר את הפלסמיד לתוך שלפוחית otic עם electroporation, להשתמש מחולל פולסים מרובע, ולהחיל חמש פולסים של 25 וולט במשך 100 אלפיות השנייה כל אחד, 50 אלפיות השנייה זה מזה. קבע את התנאים באופן אמפירי בהתבסס על מערך אלקטרופורציה בודד.

לאחר אלקטרופורציה, לחות את העובר על ידי הוספת כמה טיפות של 0.719% מלוחים. אטמו מחדש את הביצה בנייר דבק שקוף, וחזרו לאינקובטור הלח בטמפרטורה של 37 עד 38 מעלות צלזיוס להמשך הדגירה. יש לחטא את שולחן הניתוחים, שלב המיקרוסקופ והסביבה באמצעות 70% אתנול וחום, או לעקר באלכוהול את ציוד המיקרו-דיסקציה, כולל מספריים קפיציים מינימליים, מיקרו קורט ושני זוגות מלקחיים עדינים.

הכינו את צלחות הדיסקציה הכוללות צלחת פטרי זכוכית עם בסיס סיליקון שחור, צלחת פטרי מפלסטיק 90 מילימטר וצלחת פטרי בקוטר 60 מילימטר. שמור על PBS מקורר או תמיסת מלח מאוזנת של Hanks הידוע גם בשם HBSS מוכן לנתיחות. מפצחים בעדינות את הביצה לתוך צלחת פטרי בקוטר 90 מילימטר.

לאחר מכן לזהות את האוזן החיצונית של הגוזל, ולהעביר את הראש לצלחת פטרי 60 מ"מ מלא PBS קר כקרח. לאחר מכן, כוון את העובר כאשר החלק העליון של המקור פונה פנימה, והחזק את המקור באמצעות אחד ממלקחיים מספר חמש. הוציאו את העיניים בעזרת המלקחיים השניים מספר חמש.

לאחר מכן, מרוסטרל לקאודל, חותכים לאורך הגולגולת לאורך קו האמצע שלה, ומוציאים את המוח החוצה. הוסיפו עוד PBS קר כקרח, או HBSS, ואתרו את שני האוטוליטים של הלגנה כמבנים מבריקים בקצה צינור השבלול, וקרוב לקו האמצע. כדי לבודד שתי אוזניים פנימיות, חותכים בין שתי הלגנות, והרבה מעל ומתחת לאזור.

ואז תחת תאורה אלכסונית לדמיין את קווי המתאר של האוזן הפנימית, ולהסיר רקמות חיצוניות ואת הפרוזדור. העבירו את השבלול המבודד לצלחת בסיס מסיליקון שחור עם PBS קר כקרח. יש לקלף את כמוסת השבלול הסחוסית באמצעות מספר חמש מלקחיים כדי להשיג את צינור השבלול.

לאחר מכן אתרו את השכבה הגלית או הטגמנטום של צינור השבלול, והסירו אותה באמצעות מלקחיים מספר 55 כדי לחשוף את הפפילה הבזיליארית או BP. לאחר מכן, הסר את הממברנה הטקטוריאלית כדי לחשוף תאי שערה ותאים תומכים באמצעות מלקחיים מספר 55. עבור תרבית ממברנה של הפפילה הבזילרית, קח צלחת תרבית רקמה של שש בארות, וסדר ממברנת תרבית אחת לכל באר. ציירו כמה מדיות בפיפטה של 200 מיקרוליטר, ואז שאפו את צמח הפפילה הבזילרי המנותח עם חיץ HBSS X אחד.

מעבירים את הצמח על קרום, ומכוונים אותו כך שהפאפילה הבזילרית פונה כלפי מעלה, והשיער ותאי התמיכה נראים מלמעלה. ברגע שהדגל ממוקם לשאוף את חיץ HBSS לאט מפני השטח של קרום התרבית. בתהליך זה יתחבר האקסצ'ר לקרום התרבית.

מלא את הבאר של צלחת שש הבאר על ידי הוספת 1.2 מיליליטר של מדיום הנשר המתוקן של דולבקו, או מדיה תרבותית DMEM, בין תוסף הממברנה לדופן הבאר. כדי להכין את תרבית הקולגן של צינור השבלול, הוסיפו שלוש טיפות של תערובת קולגן טרייה לכל באר של צלחת ארבע בארות, והעבירו את צינור השבלול המנותק לכל טיפת קולגן. דגרו את הצלחת במשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ו-5% פחמן דו-חמצני כדי לרפא את מטריצת הקולגן.

לטיפול במולקולה קטנה של התרביות, החליפו את מדיית התרבית ב-700 מיקרוליטרים של מדיה בתוספת המודולטור הפרמקולוגי, כגון פניצילין, ודגרו על הצלחות כפי שהוכח קודם לכן. החלף 50% מהתקשורת התרבותית מדי יום. לאחר זמן הדגירה המתאים, הסר את מדיית התרבית, והשתמש בצמחים לבדיקות במורד הזרם.

במערך האלקטרופורציה, מיקום האלקטרודה הנכון הביא לביטוי GFP גבוה יותר באוזן הפנימית בשני איברי שיווי המשקל, ופפילה בזילרית שמיעתית המאשרת טרנספקציה. קריספר Cas9 תיווך נוקאאוט גן Atoh1 באוזן הפנימית, הביא לאובדן תאי שיער. נוקאאוט של הגן Atoh1 באמצעות אובו-אלקטרופורציה ואחריו דגירה עד ש-E10 הראה התפתחות מופחתת של תאי שיער בהשוואה לבקרת פלסמידים ריקים.

אף על פי שאלקטרופורציה היא פסיפס, תאי בקרה אלקטרופואטיים הצליחו ליצור תאי שערה. בדגימות אלקטרופורציה של Atoh1 gRNA, תאים חיוביים של חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים מעולם לא הראו את הסמנים של התפתחות תאי שיער. תרבית האיברים של הפפילה הבזילרית במטריצה תלת-ממדית, כגון, קולגן וכתם עם נוגדנים כנגד אנטיגן תאי שיער סיפקו שימור מצוין של מורפולוגיה של רקמות למשך עד חמישה ימים.

ארגון תאי השערה והתאים התומכים נשמרו בתנאי תרבית אלה. ניתן לשמור על תרביות האיברים על הממברנה עד חמישה ימים תוך שמירה על שלמות צרור השיער. ניתן לראות זאת בתמונה הייצוגית על ידי לוקליזציה של חלבון קישור הקצה, פרוטוקדהרין 15.

כדי לחקור את התפתחות חבילת השיער, הדמיה ברזולוציה גבוהה יותר, כגון, מיקרוסקופיית סופר-רזולוציה או מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת יכולה לספק מידע נוסף. תנאים סטריליים צריכים להישמר לאורך כל ההליך. בזמן האלקטרופורציה, יש לוודא שהעוברים אינם מתייבשים.

כאשר מעכבים פרמקולוגיים, ניתן להפחית את הריכוז כדי להתגבר על כל קטלניות. ניתן לקחת גם עוברים וגם צמחים לניסויים בהדמיה. או על ידי ביצוע מיקרוסקופ וידאו בזמן אמת, או מיקרוסקופ אלקטרונים קונפוקלי אור סטטי, כפי שמוצג בפרוטוקול.

בהתחשב בקלות ובנגישות של שימוש בצמחים באוזן הפנימית של אפרוחים, אנו יכולים להשתמש במדיום באמצעות סינון הוכחות כדי לזהות מולקולות חדשות החיוניות להתחדשות תאי השיער.