שימוש באנזימים כזרזים בתגובות יכול להפחית את כמות האנרגיה הדרושה לתגובה, ולהפחית תוצרי לוואי רעילים. עם זאת, השימוש באנזימים בתעשייה מוגבל, כי אנזימים אינם יציבים והוא יכול להיות יקר. פרוטוקול זה יכול להפחית את משך הזמן שלוקח לקבוע אם התנאים מזיקים לפעילות האנזים, או אם שינויים באנזים הגדילו את יציבותו.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא דורשת פחות שעות אדם מאשר מראי יציבות אנזימים מסורתיים. בנוסף, פרוטוקול זה יכול לשמש עם מגוון רחב של אנזימים כי זה יכול לשמש עם כל תגובה המשחררת או סופג חום. כדי להתחיל, להכין 0.1 מאגר נתרן אצטט טוחן.
מידה 800 מיליליטר של מים מזוקקים ב 1, 000 מיליליטר סיים את הבקבוק. לאחר מכן, לשקול 8.2 גרם של אצטט נתרן נטול מים, ולהוסיף אותו לקוסם. מניחים את הסקילר על צלחת ערבוב.
מניחים מוט ערבוב לתוך המק, ומדליקים את צלחת הערבב כדי לערבב אותה עד להמסה מוחלטת. כאשר אצטט נתרן נטול מים מומס לחלוטין, השתמש במד pH מכויל כדי למדוד את ה- pH של הפתרון. השתמש פיפטה להוסיף 1 חומצה הידרוכלורית טוחנת או נתרן הידרוקסיד בהתאם כדי לקבל את ה- pH הרצוי ב 4.6.
מוסיפים מים מזוקקים לתוך המזווה עד שהנפח הכולל מגיע ל-1,000 מיליליטר. כדי להכין את פתרון האנזים, בצילינדר בוגר 15 מיליליטר, למדוד 8 מיליליטר של חיץ אצטט נתרן טוחן 0.1. לאחר מכן, מוסיפים את תמיסת החיץ לצינור חרוטי 15 מיליליטר עם אנזים, ומנערים במרץ עד שהאנזים מתמוסס.
הוסף פתרון מאגר נוסף עד שאמצעי האחסון הכולל יגיע ל- 10 מיליליטר. יש לאחסן את תותב האנזים ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. כדי להכין את פתרון המצע, לשקול את המצע, ולמקם אותו לתוך זכוכית 100 מיליליטר.
השתמש גליל מדורג כדי למדוד 20 מיליליטר של פתרון החיץ, ולאחר מכן להוסיף אותו זכוכית. מניחים את המק על צלחת ערבוב, וממקם מוט ערבוב מגנטי לתוך המק. מפעילים את החום, ומתאימים את מהירות ההתערבבות בהתאם.
אפשר ערבוב להמשיך עד המצע נמס. יוצקים את פתרון המצע לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר, ומוסיפים את מאגר אצטט נתרן שהוכן בעבר, עד נפח הכולל הוא 45 מיליליטר. לנער את הצינור כדי לערבב.
אחסן את פתרון המצע בטמפרטורת החדר עד לשימוש. במחשב, פתח את ITC Run ולחץ על תוכנית ההתקנה. לחצו על קצב ערבוב והגדירו ל-350 סל"ד.
בדוק את גודל המזרק הוא ב 50 microliters. הגדר את הטמפרטורה ל 55 מעלות צלזיוס, ולחץ לעדכן. המתן לפחות שעה אחת לפני שתמשיך, כדי לאפשר מספיק זמן עבור מכשיר ITC להתחמם או להתקרר לפי הצורך.
לפני טעינת האנזים, ודא שתא הייחוס טעון ב-350 מיקרוליטרים של מים מזוקקים. כדי לנקות את תא המדגם, מלא את מזרק הטעינה ב- 500 מיקרוליטרים של תמיסת ניקוי של 2 אחוזים. בזהירות להכניס את המחט לתוך תא המדגם, למלא את התא, לאט להסיר את הנוזל באמצעות אותו מזרק.
השלך את הנוזל לתוך מקור. חזור על שלב זה פעמיים עם 2 אחוז פתרון ניקוי, שלוש פעמים עם 70 אחוז אתנול, ולאחר מכן לשטוף עשר פעמים עם מים מזוקקים. לאחר ניקוי תא הדגימה, מלאו את מזרק הטעינה ב-450 מיקרוליטרים של תמיסת אנזימים.
בזהירות להכניס את המחט כל הדרך לתחתית תא המדגם, ולאט לאט ללחוץ על הבוכנה עד לקו 100 microliter כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר. לאחר מכן, לשטוף את 50 מזרק טיטרציה microliter עם מים מזוקקים שלוש פעמים על ידי הצבת קצה המחט לתוך המים לאט לקחת את המים לתוך המזרק, ולאחר מכן מחלק את המים לתוך מיכל פסולת. יש לשטוף בתסיכת המצע שלוש פעמים כדי להסיר שאריות מים.
לאחר מכן, למלא את מזרק ציטריות עם פתרון מצע על ידי ציור הפתרון עד המזרק מלא ללא בועות אוויר. כאשר המזרק עדיין בתסמת המצע, הסר את הבוכנה, ואפשר לכ-2 מיקרוליטרים של אוויר להיכנס לראש המזרק, ולהכניס מחדש את הבוכנה. הסר את ידית הבורט של ה- ITC, מקם את המזרק בתוך ידית הבורט והברג עד להדק.
נגב את קצה מזרק התיסוס עם רקמה נטולת מוך, ולאחר מכן מקם בזהירות את ידית הבורט לתוך מכשיר ITC, ונעל אותו במקומו. עבור התקנת הניסוי, בחר טיטריות מצטברת. לחץ על הכנס כדי להגדיר את הזריקות.
התאימו את מרווח ההזרקה ל-5, 400 שניות, נפח ההזרקה ל-4 מיקרוליטר ומספר הזריקות לארבע. לחץ על אישור כדי לאשר את ההגדרות. בתיבת האקוויוויבלציה, בחר שיווי משקל אוטומטי וחום צפוי גדול.
הגדר את תוכנית הבסיס ההתחלתית ל- 300 שניות. כדי להתחיל את הריצה, לחץ על סימן ההתחלה לצד קצב ערבוב ולאחר מכן לחץ על התחל, הממוקם ליד סימן מפתח הברגים. שמור את הקובץ ואפשר לכלי לפעול.
כדי לנתח נתונים, פתח את הקובץ בניתוח ננו. לחץ על נתונים ובחר עמודות נתונים. בחר את כל הנתונים, העתק ולאחר מכן הדבק את הנתונים ב- Microsoft Excel.
התאם תוכנית בסיסית 0 על-ידי הוספת הערך הנדרש ב- 300 שניות כדי להפוך אותה ל- 0. החל תיקון זה על העמודה כולה של ערכי קצב החום. לאחר מכן, תרשים תרשים של ערכי המינימום או המקסימום כנגד הזמן שבו הערך התרחש במהלך ההקצבה.
בפרוטוקול זה, עקבות נתונים ITC של פעילות לקטאז מוצג עם ארבע זריקות רציפות של לקטוז לתוך פתרון לקטאז ב pH 4.6 חיץ ב 55 מעלות צלזיוס, 45 מעלות צלזיוס, 35 מעלות צלזיוס, ו 25 מעלות צלזיוס. בקרת אנזים לא בוצעה ב 55 מעלות צלזיוס לחום של ערבוב. עבור כל זריקה של אנזים, יש חום אקסותרמי ראשוני של ערבוב, ולאחר מכן, הידרוליזה אנדותרמית לקטאז של לקטוז מתרחשת עד שהתגובה הושלמה, וקצב החום חוזר לקו הבסיס.
שיא אנדותרמי מינימום בעקבות כל זריקה, הוא קצת פחות מאשר הזריקה הקודמת בגלל הירידה של פעילות אנזימטית. כצפוי, יציבות האנזים עבור כל זריקה פוחתת עם עליית הטמפרטורה. ניסוי הבקרה מראה שפעילות לקטאז ב-25 מעלות צלזיוס הייתה ירידה של 8 אחוז בפעילות האנזים, עקב דילול לאחר ארבע זריקות.
בהתחשב בזריקה הרביעית מראה ירידה של 73 אחוזים בהתמדה, אובדן בפועל של פעילות האנזים היה אפוא 65 אחוזים. לכן, דילול לקטאז נבע מכל זריקה, היה השפעה קטנה יחסית של 11 אחוז על פעילות האנזים. חשוב כי המאגר המשמש כדי להפוך את האנזים ופתרונות מצע מותאמים קרוב ככל האפשר.
חוסר התאמה של pH או ריכוז יכול לגרום לחום גדול יותר של ערבוב אשר יכול להסוות את חום התגובה. אתה יכול ליישם פרוטוקול זה כדי לחקור אנזימים ולקבוע את יציבותם על ידי מדידת קצב החום ששוחרר או נספג במהלך תגובה.
