Le microglia derivate da iPS rappresentano una fonte biologicamente rilevante di microglia umana per la sperimentazione in vitro e sono uno strumento importante per studiare la biologia delle microglia in salute e malattia. Presentiamo un semplice protocollo di differenziazione della microglia che richiede un uso minimo di fattori di crescita e raggiunge un'elevata purezza e resa. Inoltre, dimostriamo un test di fagocitosi completamente umanizzato.
Le cellule simili a microglia derivate da iPSC sono molto sensibili all'evaporazione dei mezzi. Dovresti evitare di usare i pozzetti nell'angolo della piastra di coltura cellulare e riempire tutti i pozzi vuoti con acqua per migliorare la sopravvivenza. Una volta che le cellule staminali pluripotenti indotte, o iPSC, hanno raggiunto l'80% di confluenza, dissociare le colonie lavando con un millilitro di DPBS e aggiungendo un millilitro di un reagente di dissociazione per due minuti a 37 gradi Celsius.
Rimuovere le colonie utilizzando un sollevatore di cellule raschiando più volte per creare una sospensione a singola cellula. Raccogliere la sospensione e trasferirla in un tubo conico da 15 millilitri contenente nove millilitri di DPBS. Quindi centrifugare le cellule a 500 volte g per un minuto, rimuovere il surnatante e risospendere in un millilitro di mezzo di corpo embrioide o EB.
Prendi 10 microlitri di cellule e diluisci uno a due con il blu di tripano. Contare le cellule su un emocitometro e, in base al conteggio delle cellule, diluire lo stock cellulare a una diluizione finale di 10.000 cellule per 100 microlitri. Per le celle di placcatura, aggiungere 100 microlitri di celle diluite per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti a fondo rotondo a bassa aderenza.
Centrifugare la piastra a 125 volte g per tre minuti e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per quattro giorni. Il secondo giorno, utilizzando una pipetta multicanale, sostituire il vecchio mezzo EB con un nuovo mezzo. Per generare precursori primitivi dei macrofagi, o PMP, rivestire i pozzetti di una piastra a sei pozzetti aggiungendo un millilitro di soluzione di rivestimento Matrigel ghiacciata.
Quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per due ore o durante la notte. Il quarto giorno di differenziazione EB, utilizzando una punta per pipetta da un millilitro, trasferire gli EB ai pozzetti rivestiti Matrigel. Pipettare su e giù per rimuovere gli EB dal pozzo.
Quindi tenere la piastra inclinata per consentire agli EB di depositarsi sul bordo del pozzo. Una volta che tutti gli EB si sono sistemati, pipettare delicatamente e sostituire il vecchio mezzo, mantenendo l'EB sul bordo del pozzo con tre millilitri di terreno completo PMP appena preparato. Distribuire uniformemente le celle nei pozzetti mescolando manualmente la piastra da un lato all'altro e da una parte all'altra.
Quindi incubare la piastra per sette giorni per consentire agli EB di attaccarsi al fondo del pozzo. Dopo sette giorni, ispezionare gli EB al microscopio a campo chiaro con un ingrandimento quattro volte superiore per assicurarsi che siano attaccati al fondo dei pozzetti. Eseguire un mezzo cambio medio e il giorno 21, sostituire il mezzo completo con tre millilitri di mezzo completo PMP.
Il giorno 28, cerca le celle rotonde denominate PMP nel surnatante. Quindi raccogliere il mezzo contenente i PMP utilizzando una pipetta da 10 millilitri e un pipetter automatico senza disturbare gli EB. Trasferire i PMP nel mezzo in un tubo conico da 15 millilitri.
Centrifugare i PMP raccolti a 200 volte g per quattro minuti e aspirare il surnatante prima di risospenderli in uno o due millilitri di cellule simili alla microglia o mezzo basale IMG. Quindi contare le cellule sull'emocitometro come descritto in precedenza. Centrifugare il resto delle cellule e diluire i PMP alla concentrazione desiderata.
Quindi placcare le cellule a una densità da 10 alla quinta cella per centimetro quadrato su piastre trattate con colture cellulari utilizzando il mezzo completo IMG appena preparato. Per il saggio di fagocitosi delle cellule vive, placcare da 20 a 30 volte 10 al quarto PMP in una piastra a 96 pozzetti e 100 microlitri di mezzo completo IMG e seguire il processo di differenziazione per 10 giorni. Il giorno del test, rimuovere 40 microlitri di mezzo per pozzetto e aggiungere 10 microlitri della soluzione di colorazione nucleare.
Incubare il piatto per due ore. Scongelare i sinaptosomi marcati sul ghiaccio e sonicare delicatamente usando un sonicatore ad acqua per un minuto. Ancora una volta, posizionare immediatamente i sinaptosomi sul ghiaccio.
Diluire i sinaptosomi marcati nel mezzo completo IMG a un microlitro di sinaptosomi per 50 microlitri di mezzo. Per il controllo negativo, preparare 60 micromolari Cytochalasin D in mezzo completo IMG per inibire la polimerizzazione dell'actina e quindi la fagocitosi. Quindi aggiungere 10 microlitri di questa soluzione a ciascun pozzetto per una concentrazione finale di 10 micromolari e incubare per 30 minuti.
Rimuovere la piastra dall'incubatore e incubare a 10 gradi Celsius per 10 minuti. Mantenere la piastra sul ghiaccio e aggiungere 50 microlitri di terreno contenente sinaptosomi. Centrifugare la piastra a 270 g per tre minuti a 10 gradi Celsius e mantenere la piastra sul ghiaccio fino all'acquisizione dell'imaging.
Inserire la piastra in un lettore di imaging cellulare vivo e selezionare i pozzetti da analizzare. Quindi selezionare un obiettivo 20X. Quindi, regolare la messa a fuoco, il diodo a emissione luminosa o LED, l'intensità, il tempo di integrazione e il guadagno dei canali di campo luminoso e blu.
La fluorescenza del sinaptosoma dovrebbe essere trascurabile al momento iniziale. Selezionare il numero di singole tessere da acquisire in un montaggio per pozzetto. Acquisire 16 piastrelle al centro del pozzo, immaginando circa il 5% dell'area totale del pozzo.
Impostare la temperatura su 37 gradi Celsius e l'intervallo di tempo desiderato per l'imaging. Quindi, apri il software di analisi. Quindi apri l'esperimento che contiene le immagini e fai clic sull'icona Riduzione dati.
Nel menu, selezionate Cucitura immagini in Elaborazione immagini per creare un'immagine completa dalle singole tessere quattro per quattro nel montaggio con i parametri descritti nel testo del testo. Definire una soglia di intensità utilizzando i canali DAPI e RFP per queste immagini. Apri un'immagine e fai clic su Analizza.
In Analisi selezionare Analisi cellulare e in Canale di rilevamento selezionare un'immagine cucita nei canali DAPI o RFP. Quindi, vai alla scheda Maschera primaria e conteggio e stabilisci un valore di soglia e valori di dimensione dell'oggetto che selezionano correttamente i nuclei cellulari nel canale DAPI o il segnale del sinaptosoma nel canale RFP. Per contare il numero di nuclei, vai al menu Riduzione dati e, in Analisi immagine, seleziona Analisi cellulare.
Anche in questo caso, vai alla scheda Maschera primaria e conteggio e, in Canale, seleziona le immagini cucite DAPI e usa i parametri descritti nel manoscritto di testo. Quindi, vai alla scheda Metriche calcolate e seleziona Conteggio celle. Quindi, per ottenere l'area del segnale del sinaptosoma, vai al menu Riduzione dati e, in Analisi, seleziona Analisi cellulare.
Anche in questo caso, vai alla scheda Maschera primaria e conteggio e, in Canale, seleziona Immagini cucite RFP e usa i parametri dettagliati nel testo manuscritto. Quindi, vai alla scheda Metriche calcolate e seleziona Area somma oggetti. Nella scheda Riduzione dati, fare clic su OK per consentire al software di analizzare tutte le immagini acquisite.
Una volta analizzate le immagini, esportare i valori Area somma oggetti e Conteggio celle per ogni punto temporale. Quindi dividere l'area della somma degli oggetti per il conteggio delle celle per calcolare l'area normalizzata per punto temporale. Se si confrontano più trattamenti o genotipi, calcolare l'indice di fagocitosi utilizzando l'equazione data.
Le iPSC indifferenziate mostrano una morfologia compatta della colonia con bordi ben definiti. Le iPSC dissociate hanno formato aggregati sferici chiamati EB e crescono di dimensioni fino al quarto giorno di differenziazione. Quando gli EB sono placcati per la generazione di PMP, si attaccano alle piastre rivestite di Matrigel e uno strato di cellule si diffonde e circonda gli aggregati sferici.
Il giorno 28, le cellule rotonde con un grande rapporto citoplasma / nucleo appaiono nella sospensione. Si raccomanda vivamente di coltivare iPSC in piastre rivestite con Laminin 521 anziché Matrigel, a causa della maggiore resa in PMP nelle piastre rivestite con Laminin 521. Dopo l'esposizione dei PMP al mezzo IMG, le cellule acquisiscono una morfologia simile alla microglia con un piccolo citoplasma in presenza di processi allungati.
Inoltre, l'identità della microglia è stata verificata mediante colorazione immunofluorescente. Tipicamente, più del 95% delle cellule esprime IB1 e circa il 90% delle cellule esprime P2RY12 e TMEM119. L'analisi Western blot ha confermato che iPSC ha derivato motoneuroni più bassi per i marcatori sinaptici espressi dai sinaptosomi umani, la sinaptofisina e la proteina di densità postsinaptica 95.
Nel controllo rispetto al punto temporale iniziale, entro 10 ore, il segnale fluorescente rosso era robusto, poiché la maggior parte dei sinaptosomi era stata inghiottita ed erano localizzati in compartimenti intracellulari acidi. Nelle IMG trattate con citocalasina D, una forte riduzione del segnale rosso per zero e 10 ore ha indicato che il segnale rilevato deriva da eventi fagocitari. L'area dei sinaptosomi inghiottiti è aumentata con il tempo fino a 16 ore.
Tuttavia, l'area del segnale rosso dalle cellule trattate con citocalasina D non è aumentata con il tempo. Le cellule simili alla microglia derivate da iPS possono essere utilizzate per varie applicazioni, tra cui la fagocitosi e la risposta infiammatoria nello studio delle malattie dello sviluppo neurologico e neurodegenerative.
