Микроглия, полученная из iPS, представляет собой биологически значимый источник микроглии человека для экспериментов in vitro и является важным инструментом для исследования биологии микроглии в здоровье и болезнях. Мы представляем простой протокол дифференциации микроглии, который требует минимального использования факторов роста и достигает высокой чистоты и урожайности. Кроме того, мы демонстрируем полностью гуманизированный анализ фагоцитоза.
Микроглиоподобные клетки, полученные из iPSC, очень чувствительны к испарению среды. Вы должны избегать использования колодцев в углу тарелки для культивирования клеток и заполнять все пустые колодцы водой, чтобы улучшить выживаемость. После того, как индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, или IPSCs, достигли 80%-ной конфлюции, диссоциируют колонии, промывая одним миллилитром DPBS и добавляя один миллилитр реагента диссоциации в течение двух минут при 37 градусах Цельсия.
Вытесняйте колонии с помощью клеточного лифтера, соскребая несколько раз, чтобы создать одноклеточную суспензию. Соберите суспензию и переложите их в 15-миллилитровую коническую трубку, содержащую девять миллилитров DPBS. Затем центрифугируют клетки в 500 раз г в течение одной минуты, удаляют супернатант и повторно суспендируют в одном миллилитре эмбрионального тела, или EB, среды.
Возьмите 10 микролитров клеток и разбавьте один-два трипан-синим. Подсчитайте клетки на гемоцитометре и, основываясь на количестве клеток, разбавьте клеточный запас до окончательного разведения 10 000 клеток на 100 микролитров. Для гальванических ячеек добавьте 100 микролитров разбавленных ячеек на скважину в пластину с низким адгезией с круглым дном из 96 лунок.
Центрифугируйте пластину в 125 г в течение трех минут и инкубируйте при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение четырех дней. На второй день, используя многоканальную пипетку, замените старую полу-EB среду на свежую среду. Для получения примитивных предшественников макрофагов, или PMP, покрывают колодцы шестилуночной пластины, добавляя один миллилитр ледяного раствора для покрытия Matrigel.
Затем инкубируют пластину при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение двух часов или на ночь. На четвертый день дифференциации ЭБ, используя наконечник пипетки в один миллилитр, перенесите ЭБ в скважины, покрытые матригелем. Пипетка вверх и вниз, чтобы выбить ЭБ из колодца.
Затем держите пластину наклоненной, чтобы позволить ЭБ расположиться на краю колодца. После того, как все ЭБ успокоятся, аккуратно пипетку и замените старую среду, сохранив ЭБ на краю скважины тремя миллилитрами свежеприготовленной полной среды PMP. Равномерно распределите ячейки в колодцах, вручную перетасовывая плиту из стороны в сторону и назад спереди.
Затем инкубируйте пластину в течение семи дней, чтобы позволить ЭБ прикрепиться к дну колодца. Через семь дней осмотрите ЭБ под световым полевым микроскопом с четырехкратным увеличением, чтобы убедиться, что они прикреплены к дну скважин. Выполните половину среднего изменения, а на 21-й день замените полную среду тремя миллилитрами полной среды PMP.
На 28-й день ищите круглые клетки, называемые PMP в супернатанте. Затем соберите среду, содержащую PMP, используя 10-миллилитровую пипетку и автоматический пипетку, не нарушая ЭБ. Переведите PMP в среде в 15-миллилитровую коническую трубку.
Центрифугируйте собранные PMP в 200 раз г в течение четырех минут и аспирируйте супернатант, прежде чем повторно приостановить их в одном-двух миллилитрах микроглиоподобных клеток или базальной среды IMG. Затем подсчитайте клетки на гемоцитометре, как описано ранее. Центрифугируют остальные клетки и разбавляют PMP до нужной концентрации.
Затем нанесите клетки с плотностью от 10 до пяти клеток на квадратный сантиметр на обработанных культурой клеток пластинах с использованием свежеприготовленной полной среды IMG. Для анализа фагоцитоза живых клеток внесите от 20 до 30 раз от 10 до четвертого PMP в 96-луночную пластину и 100 микролитров полной среды IMG и следуйте процессу дифференцировки в течение 10 дней. В день анализа удалите 40 микролитров среды на лунку и добавьте 10 микролитров раствора для ядерного окрашивания.
Высиживать тарелку в течение двух часов. Разморозьте меченые синаптосомы на льду и аккуратно обработайте ультразвуком с помощью водяного ультразвука в течение одной минуты. Опять же, немедленно поместите синаптосомы на лед.
Разбавляют меченые синаптосомы в полной среде IMG на один микролитр синаптосом на 50 микролитров среды. Для отрицательного контроля готовят 60 микромоляров цитохалазин D в полной среде IMG для ингибирования полимеризации актина и, следовательно, фагоцитоза. Затем добавьте 10 микролитров этого раствора в каждую лунку для конечной концентрации 10 микромоляров и инкубируйте в течение 30 минут.
Выньте тарелку из инкубатора и высиживайте при 10 градусах Цельсия в течение 10 минут. Выдержите пластину на льду и добавьте 50 микролитров среды, содержащей синаптосомы. Центрифугируйте пластину в 270 раз г в течение трех минут при 10 градусах Цельсия и держите пластину на льду до получения изображения.
Вставьте пластину в считыватель изображений живых клеток и выберите скважины для анализа. Затем выберите объектив 20X. Затем отрегулируйте фокусировку, светодиод или светодиод, интенсивность, время интеграции и усиление яркого поля и синих каналов.
Флуоресценция синаптосом должна быть незначительной в начальной точке времени. Выберите количество отдельных плиток, которые будут приобретены при монтаже на скважину. Приобретите 16 плиток в центре скважины, получив примерно 5% от общей площади скважины.
Установите температуру на уровне 37 градусов Цельсия и желаемый временной интервал для визуализации. Затем откройте программное обеспечение для анализа. Затем откройте эксперимент, содержащий изображения, и щелкните значок Сокращение данных.
В меню выберите «Сшивание изображений» в разделе «Обработка изображений», чтобы создать полное изображение из четырех на четыре отдельных плитки в монтаже с параметрами, описанными в текстовой рукописи. Определите порог интенсивности, используя каналы DAPI и RFP для этих изображений. Откройте изображение и нажмите «Анализировать».
В разделе Анализ выберите Клеточный анализ, а в разделе Канал обнаружения выберите сшитое изображение в каналах DAPI или RFP. Затем перейдите на вкладку Основная маска и счетчик и установите пороговое значение и значения размера объекта, которые правильно выбирают ядра клеток в канале DAPI или сигнал синаптосомы в канале RFP. Чтобы подсчитать количество ядер, перейдите в меню «Уменьшение данных» и в разделе «Анализ изображений» выберите «Клеточный анализ».
Снова перейдите на вкладку Основная маска и счетчик и в разделе Канал выберите сшитые изображения DAPI и используйте параметры, описанные в текстовой рукописи. Затем перейдите на вкладку Вычисляемые метрики и выберите Количество ячеек. Затем, чтобы получить площадь сигнала синаптосомы, перейдите в меню «Уменьшение данных» и в разделе «Анализ» выберите «Клеточный анализ».
Снова перейдите на вкладку Основная маска и счетчик и в разделе Канал выберите Сшитые изображения RFP и используйте параметры, описанные в текстовой рукописи. Затем перейдите на вкладку Вычисляемые метрики и выберите Область суммы объектов. На вкладке «Сокращение данных» нажмите кнопку «ОК», чтобы позволить программному обеспечению анализировать все полученные изображения.
После анализа изображений экспортируйте значения «Область суммы объектов» и «Количество ячеек» для каждой точки времени. Затем разделите площадь суммы объектов на количество ячеек, чтобы вычислить нормализованную площадь за точку времени. При сравнении нескольких методов лечения или генотипов рассчитайте индекс фагоцитоза, используя данное уравнение.
Недифференцированные iPSC показывают компактную колониальную морфологию с четко определенными краями. Диссоциированные ИПСК образовывали сферические агрегаты, называемые ЭБ, и росли в размерах до четвертого дня дифференциации. Когда ЭБ покрываются для генерации PMP, они прикрепляются к пластинам, покрытым Матригелем, и слой клеток распространяется и окружает сферические агрегаты.
На 28 день в суспензии появляются круглые клетки с большим соотношением цитоплазмы к ядру. Настоятельно рекомендуется культивировать иПСК в пластинах с покрытием Laminin 521 вместо Matrigel из-за более высокого выхода PMP в пластинах с покрытием Laminin 521. После воздействия PMP на IMG-среду клетки приобретают микроглиоподобную морфологию с небольшой цитоплазмой при наличии вытянутых отростков.
Кроме того, идентичность микроглии была проверена иммунофлуоресцентным окрашиванием. Как правило, более 95% клеток экспрессируют IB1 и примерно 90% клеток экспрессируют P2RY12 и TMEM119. Анализ вестерн-блот подтвердил, что iPSC получил более низкие двигательные нейроны для экспрессированных синаптосом человека синаптических маркеров, синаптофизина и белка постсинаптической плотности 95.
В контрольной группе по сравнению с начальной временной точкой к 10 часам красный флуоресцентный сигнал был устойчивым, так как большинство синаптосом были поглощены и локализованы в кислых внутриклеточных компартментах. В IMG, обработанных Цитохалазином D, сильное снижение красного сигнала в течение нуля и 10 часов указывало на то, что обнаруженный сигнал является результатом фагоцитарных событий. Площадь поглощенных синаптосом увеличивалась со временем до 16 часов.
Однако площадь красного сигнала от клеток, обработанных Цитохалазином D, со временем не увеличивалась. Микроглия, полученные из iPS, могут быть использованы для различных применений, включая фагоцитоз и воспалительную реакцию при изучении заболеваний нервного развития и нейродегенеративных заболеваний.
