הפרוטוקול שלנו מתאר מערכת אמינה למדידת התכווצות בקרדיומיוציטים ראשוניים אנושיים בוגרים. המערכת שלנו היא שיטת הקלטה אופטית לא פולשנית בעלת תפוקה בינונית, המודדת באופן רציף התכווצות מתאים מרובים במקביל, ומאפשרת מעקב בזמן אמת אחר השפעות התרופה. השיטות שלנו תומכות בגילוי מולקולות חדשות עם הפרופיל הרצוי ביותר לתיקון אי ספיקת לב.
הוא גם מספק גישה פרה-קלינית לחיזוי סיכוני התכווצות הנגרמים על ידי תרופות. כדי להתחיל, הניחו פתק כיסוי זכוכית בודד בכל באר של צלחת תרבות בת שמונה בארות. הכינו חמישה מיקרוגרם למיליליטר של למינין על ידי הוספת 800 מיקרוליטר של למינין רקומביננטי אנושי 521 מלאי ל 7.2 מיליליטר של תמיסה B וערבבו היטב.
הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת למינין מדוללת למרכז תלוש הכיסוי. מכסים את הצלחת ועורמים אותה במקרר בארבע מעלות צלזיוס. לדלל dimethyl sulfoxide או DMSO פי 1000 בתמיסה C כדי ליצור תמיסת רכב 0.1% DMSO.
כדי לבדוק את התרכובת בפי אחד, 10, 100 ו-1000 מהחשיפה הטיפולית שלה של 0.001 מיקרומולרית, יש להמיס את התרכובת ב-DMSO בריכוז של מילימולרית אחת. דלל את תמיסת תרכובת הבדיקה של DMSO באופן סדרתי עם DMSO כדי לייצר שלושה מלאים נוספים. לבסוף, לדלל כל תרכובת בדיקה מלאי 1000 הישן ב 50 מיליליטר של תמיסה C כדי לקבל ריכוזי בדיקה סופיים.
הוסף את פתרון הרכב ותמיסות של ריכוזי מיקרומולר סופיים של התרכובת למזרקים של 50 מיליליטר. חברו את המזרקים למערכת זרימת הכבידה, ואז הפעילו את מערכת זרימת הכבידה. מוציאים מהמקרר צלחת בת שמונה בארות המכילה מכסה מצופה למינציה, ומניחים את חלקת הכיסוי בתא הקלטה נקי.
מחזירים את הצלחת למקרר עד לציפוי הבא. שאפו תמיסה B מהבקבוקון המוגדל כדי להגיע לנפח הקטן ביותר מבלי לאבד תאים. לאחר מכן שחררו 200 מיקרוליטר של תמיסת התא לתא מיקרוסקופ ההקלטה המותקן על במה של מיקרוסקופ הפוך ואפשרו לתאים להתיישב על החלקת הכיסוי למשך חמש דקות.
לאחר מכן, פתח את שדה הראייה במיקרוסקופ וקבע אם צפיפות התא מספקת לתחילת ריצת הניסוי. לאחר סיום הציפוי, אזנו את התאים למשך חמש דקות על ידי ניקוב רציף שלהם עם תמיסה C באמצעות מערכת זילוח זרימת הכבידה. כוונן את היניקה כראוי, הפעל את תיבת בקרת הטמפרטורה ואת צלחת החימום והגדר אותם לספק 35 מעלות צלזיוס.
ואז על מגרה שדה עם זוג חוטי פלטינה ממוקם משני הצדדים של החדר, לעורר את התאים עם מתח suprathreshold בתדר קצב הרץ אחד. הגדר את המשרעת של הדופק המגרה בוולט אחד והגדל אותו עד שהקרדיומיוציטים יתחילו לייצר מחזורי התכווצות-הרפיה. בחר תאים בריאים עם מורפולוגיה בצורת מוט ופסיעות ברורות, ולאחר מכן התאם את שדה הראייה והתמקד בהבאת תאים מתכווצים רבים ככל האפשר לתצוגה.
לאחר מכן, הציג את התמונות הדיגיטליות של התאים בתוך תוכנת הרכישה של מערכת רישום התכווצות אופטית. בעת בחירת אזור העניין או החזר ההשקעה, הימנע מאזורים מחוץ למיקוד ומאזורים קרובים לקצה התאים. התחל את הניסוי כדי להעריך את השפעות התרכובת.
תוכנת הרכישה תנהל את איסוף הנתונים. תצוגה ותיוג של ריכוזי הבדיקה וזמן הטיפול באופן אוטומטי. החל ריכוזי בדיקה אם ההתכווצות נשארת באמפליטודה יציבה לאורך כל תקופת הרכב הבסיסית.
פסילת תאים המציגים ריצה או ריצה. בצע ניתוח לא מקוון באמצעות תוכנת הניתוח ומאקרו מותאם אישית כדי לחשב ממוצע של הנתונים. התוכנה מחשבת ומדווחת על מדדים שונים מנתוני דינמיקת הסרקומר המיוצרים על ידי תוכנת הרכישה.
כמת את ההשפעות המורכבות של הבדיקה על משרעת ההתכווצות הממוצעת ביחס למצב בקרת הרכב הבסיסי הספציפי של כל קרדיומיוציטים. בטא את התוצאות הממוצעות כממוצע פלוס/מינוס SEM והפק גרף המתווה את השפעת הריכוז של תרכובת הבדיקה על משרעת ההתכווצות. לאחר מכן התאם את עקומת תגובת הריכוז למשוואת הגבעה כדי לגזור ערכי IC50 ו- EC50.
לאחר מכן, זהה את ההתכווצות שלאחר מכן כהתכווצות משנית ספונטנית חולפת של הקרדיומיוציטים המתרחשת לפני ההתכווצות הסדירה הבאה ומייצרת התכווצות לא תקינה ולא מסונכרנת. זהה כשל התכווצות כחוסר היכולת של הגירוי החשמלי לגרום להתכווצות. דמיינו את השונות קצרת הטווח, או STV, ואת האלטרננים בחלקות פואנקרה של השתנות משרעת התכווצות.
חשב את ה- STV עם 20 הארעיים האחרונים של כל תקופת ריכוז של מאמר בקרה ובדיקה. לאחר מכן זהה אלטרנים כמעברי משרעת התכווצות קצרים וארוכים החוזרים על עצמם. כדי לחשב את ההיארעות של פרו-הפרעות קצב, נרמלו את ערכי ה-STV לערך בקרת הרכב של כל תא, התוויית לאחר התכווצות, כשל התכווצות, STV ואלטרננים ובטאו אותם כאחוז משכיחות התאים המציגים כל אחד מהאותות.
השלם את הפרופיל המכניסטי הרב-פרמטרי עם חישוב הזמן לשיא, דעיכה ל-30% ואז 90% הרפיה, זמן ל-90% הרפיה, אורך סרקומר בסיסי, זמן ל-50% שיא, גובה שיא, אורך סרקומר בשיא ההתכווצות, מהירות התכווצות מקסימלית ומהירות הרפיה מרבית. לאחר מכן בטאו פרמטרים אלה ביחס למצב הבקרה הבסיסי הספציפי של כל קרדיומיוציטים והציגו אותם בגרף בתרשימי תגובת ריכוז. מחקר זה מראה אימות של מדידת התכווצות קרדיומיוציטים אנושיים, ואת ההשפעה של גירוי בטא-אדרנרגי.
לא היו מעברי התכווצות ספונטניים בקרדיומיוציטים אנושיים, והקרדיומיוציטים מגיבים לגירוי חשמלי חיצוני עם מחזורי התכווצות-הרפיה, כמו גם לאיזופרוטרנול, אגוניסט בטא-אדרנרגי. האיזופרוטרנול מייצר עלייה תלוית ריכוז בהתכווצות, ואופיינו גם השפעותיו על הקינטיקה של התכווצות חולפת. לאחר מדידת התכווצות, אנו יכולים לבצע מדידה של סידן חולף עם מחוון פלואורסצנטי.
נתונים אלה מסייעים לקבוע אם שינוי בהתכווצות דורש שינוי בדינמיקה של סידן. השיטה שלנו סוללת את הדרך לחוקרי לב לפתח הבנה טובה יותר של הפיזיולוגיה והפרמקולוגיה של קרדיומיוציטים אנושיים, לבסס מבנה, פעילות ויחסים של תרופות חדשות, ולחקור את מנגנון הפעולה שלהם.
