מה שהכי מרגש בפרוטוקול שלנו הוא שהוא מאפשר לכל מעבדה להתחיל לעבוד באמצעות פרוטוקולי למידה עמוקה אלה לפילוח כמויות גדולות של נתוני cryo-ET. היתרון העיקרי של זרימת העבודה שלנו הוא ש-Dragonfly מספקת סביבה חישובית ברמה מקצועית לאימון רשתות עצביות מרובות מחלקות לסגמנטציה, וזה באמת יכול להאיץ באופן דרמטי את תהליך הפילוח שלך. פילוח תמונות לוקח זמן ללמוד, לכן הקפד לבדוק את הכלים וללמוד את הקשרים העיקריים כדי לעזור באמת לייעל את זרימת העבודה שלך לאורך זמן.
לאחר הגדרת התוכנה, המשך בייבוא התמונות על-ידי מעבר אל קובץ ובחירה באפשרות ייבוא קבצי תמונה. לאחר מכן לחץ על הוסף, נווט אל קובץ התמונה, לחץ על פתח ובחר הבא ולאחר מכן סיום. צור סולם עוצמה מותאם אישית על-ידי מעבר אל כלי עזר ובחירה במנהל יחידות המימד.
לחץ על סימן החיבור בפינה השמאלית התחתונה כדי ליצור יחידת ממד חדשה. בחר תכונה בעוצמה גבוהה ונמוכה בכל הטומוגרפיות המעניינות. תן ליחידה שם וקיצור ושמור את יחידת הממד המותאמת אישית.
כדי לכייל תמונות לסולם העוצמה המותאם אישית, לחץ לחיצה ימנית על ערכת הנתונים בעמודה Properties בצד ימין של המסך ובחר Calibrate Intensity Scale. לאחר מכן, עבור אל הכרטיסייה הראשית בצד שמאל של המסך וגלול מטה אל קטע הבדיקה. בעזרת כלי הבדיקה המעגלית בקוטר מתאים, לחצו על כמה מקומות באזור הרקע של הטומוגרפיה והקליטו את המספר הממוצע בעמודת העוצמה הגולמית.
חזור על הפעולה עבור סמני פידוקיאל ולחץ על כיול. במקרה הצורך, התאימו את הניגוד כדי שמבנים יהיו גלויים שוב בעזרת הכלי אזור באזור פילוס החלון בכרטיסייה הראשית. בצד שמאל של הכרטיסייה הראשית, גללו מטה לחלונית עיבוד התמונה.
לחץ על מתקדם והמתן לפתיחת חלון חדש. בחלונית Properties, בחר בערכת הנתונים לסינון והצג אותה בלחיצה על סמל העין משמאל לערכת הנתונים. לאחר מכן, השתמש בתפריט הנפתח מלוח הפעולות כדי לבחור השוואת היסטוגרמה עבור הפעולה הראשונה.
בחר הוסף פעולה, לחץ על גאוסיאן ושנה את ממד הליבה לתלת-ממד. הוסף את הפעולה השלישית ולאחר מכן בחר בטל חידוד והשאר את הפלט עבור פעולה זו. החל את האיזון על כל הפרוסות ותן לסינון לפעול, ולאחר מכן סגור את חלון עיבוד התמונה כדי לחזור לממשק הראשי.
כדי לזהות את אזור האימון, עבור אל לוח מאפייני הנתונים על-ידי הסתרת ערכת הנתונים הלא מסוננת על-ידי לחיצה על סמל העין משמאל לו. לאחר מכן, הצג את ערכת הנתונים החדשה שסוננה. באמצעות ערכת הנתונים המסוננת, זהה אזור משנה של הטומוגרפיה המכיל את כל התכונות המעניינות.
כעת צור תיבה מסביב לאזור העניין על-ידי גלילה מטה אל הקטגוריה צורות ובחירה באפשרות צור תיבה בצד הימני של הכרטיסיה הראשית. בחלונית עם ארבע תצוגות, השתמש במישורים הדו-ממדיים השונים כדי לכוון או לגרור את קצות התיבה כך שתקיף רק את אזור העניין בכל הממדים. ברשימת הנתונים, בחר את אזור התיבה ושנה את צבע הגבול לצפייה קלה יותר על-ידי לחיצה על הריבוע האפור לצד סמל העין.
כדי ליצור החזר השקעה מרובה (ROI), בחר בכרטיסיה סגמנטציה, לחץ על חדש בצד שמאל וסמן את האפשרות צור כהחזר השקעה מרובה (ROI). ודא שמספר השיעורים תואם למספר התכונות המעניינות בתוספת שיעור רקע. תנו שם לנתוני האימון מרובי ה-ROI וודאו שהגיאומטריה תואמת לערכת הנתונים לפני שתלחצו על 'אשר'. לאחר מכן, גלול בין הנתונים עד לגבולות האזור הארוז.
בחר את Multi-ROI בתפריט מאפיינים בצד ימין. לחץ פעמיים על שם המחלקה הריק הראשון בהחזר ההשקעה המרובה כדי לתת לו שם. לצביעה באמצעות המברשת הדו-ממדית, גללו מטה אל כלי דו-ממד בכרטיסייה 'סגמנטציה' משמאל ובחרו מברשת עגולה.
לאחר מכן בחר Adaptive Gaussian או Local OTSU מהתפריט הנפתח, צייר על-ידי החזקת מקש שמאל פלוס לחיצה, ומחק על-ידי החזקת מקש Shift שמאל פלוס לחיצה. לאחר שכל המבנים סומנו, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על מחלקת הרקע בהחזר ההשקעה המרובה ובחר הוסף את כל הווקסלים ללא תווית למחלקה. לאחר מכן, צור החזר השקעה חדש מסוג יחיד בשם Mask.
ודאו שהגיאומטריה מוגדרת לערכת הנתונים המסוננים ולאחר מכן לחצו על 'החל'. בכרטיסיה מאפיינים משמאל, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על התיבה, בחר הוסף ל- ROI והוסף אותה ל- ROI של המסיכה. כדי לחתוך את נתוני האימון באמצעות המסיכה, עברו לכרטיסייה מאפיינים ובחרו הן את נתוני האימון, החזר השקעה מרובה והן את החזר ההשקעה על המסכה על ידי החזקת שליטה ולחיצה על כל אחד מהם.
לאחר מכן, לחץ על הצטלבות מתחת לרשימת מאפייני הנתונים במקטע פעולות בוליאניות. תן לערכת הנתונים החדשה שם כקלט אימון חתוך וודא שהגיאומטריה תואמת לערכת הנתונים המסוננת לפני שתלחץ על אישור. ייבא את נתוני האימון לאשף הפילוח על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על ערכת הנתונים המסוננים בכרטיסיה מאפיינים ובחירה באפשרות אשף הפילוח. לאחר פתיחת חלון חדש, חפש את הכרטיסיה קלט בצד שמאל.
לחץ על ייבוא מסגרות מהחזר השקעה מרובה ובחר את קלט האימון החתוך. כדי ליצור מודל רשת עצבית חדש, לחץ על לחצן הפלוס בצד ימין בכרטיסיית הדגם. בחר U Net מהרשימה, בחר 2.5 D וחמש פרוסות למידות קלט ולאחר מכן לחץ על צור.
כדי לאמן את הרשת, לחץ על רכבת בפינה השמאלית התחתונה של חלון Seg Wiz. לאחר השלמת אימון היחידה, השתמש ברשת המאומנת כדי לפלח מסגרות חדשות, ליצור מסגרת חדשה ולחץ על חזוי. לאחר מכן לחץ על החץ למעלה בפינה השמאלית העליונה של המסגרת החזויה כדי להעביר את הפילוח למסגרת האמיתית.
לתיקון החיזוי, הקישו Control תוך כדי לחיצה על שתי מחלקות כדי לשנות את הפיקסלים המפולחים של מחלקה אחת לשנייה. בחרו בשתי המחלקות וצבעו בעזרת המברשת כדי לצבוע רק פיקסלים השייכים לאחת מהמחלקות. תקן את הפילוח בחמש מסגרות חדשות לפחות.
לאימון איטרטיבי, לחץ שוב על לחצן Train ואפשר לרשת להתאמן עוד 30 עד 40 אפיקים נוספים. בשלב זה, להפסיק את האימונים ולהתחיל סבב נוסף של אימונים. כאשר אתה מרוצה מביצועי הרשת, פרסם את הרשת על-ידי יציאה מאשף הסגמנטציה.
קופצת תיבת דו-שיח השואלת אילו דגמים לפרסם. בחר את הרשת המצליחה, תן לה שם ולאחר מכן פרסם אותה כדי להפוך את הרשת לזמינה לשימוש מחוץ לאשף הסגמנטציה. תחילה, בחרו בערכת הנתונים המסוננים בחלונית Properties כדי להחיל אותה על טומוגרפיית האימון.
בחלונית Segmentation משמאל, גלול מטה למקטע עם AI. ודא שערכת הנתונים הנכונה נבחרה. בחר את הדגם שפורסם לאחרונה בתפריט הנפתח ולאחר מכן לחץ על פלח ולאחר מכן על כל הפרוסות.
כדי להחיל על ערכת נתוני הסקה, ייבא את הטומוגרפיה החדשה ועבד אותה מראש כפי שהודגם קודם לכן. בלוח הסגמנטציה, עבור לקטע עם AI. ודא שהטומוגרפיה המסוננת החדשה היא ערכת הנתונים שנבחרה, בחר את המודל שאומן בעבר, לחץ על המקטע ובחר כל הפרוסות.
נקה במהירות את הרעש על-ידי בחירה תחילה באחת המחלקות שיש בהן רעש מפולח ותכונת העניין. לאחר מכן, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על Process Islands, בחר Removed by Voxel Count, ולאחר מכן לחץ על Select a Voxel Size. התחל עם ספירות קטנות ובהדרגה להגדיל את הספירה כדי להסיר את רוב הרעש.
לתיקון סגמנטציה, הקישו Control תוך כדי לחיצה על שתי מחלקות כדי לצבוע פיקסלים השייכים למחלקות אלה בלבד. הקישו Control תוך כדי לחיצה ועוד גרירה בעזרת כלי הפילוח כדי לשנות פיקסלים מהמחלקה השנייה למחלקה הראשונה, והקישו Shift תוך כדי לחיצה ועוד גרירה כדי להשיג את התוצאה ההפוכה. יחידה בת חמש פרוסות אומנה על טומוגרפיה אחת ובוצעה פילוח ידני לצורך קלט אימון.
מוצג פילוח דו-ממדי מהיחידה לאחר השלמת האימון. עיבוד תלת-ממדי של האזורים המפולחים מראה קרום, מיקרוטובולים וחוטי אקטין (actin filaments). DIV 5 נוירונים של חולדות בהיפוקמפוס מאותו מפגש כמו טומוגרפיית האימון מוצגים.
סגמנטציה דו-ממדית מהיחידה ללא הכשרה נוספת בניקוי מהיר הציגה ממברנה, מיקרוטובולים, אקטין ופידוקיאלים. עיבוד תלת ממדי של האזורים המפולחים היה גם חזותי. נצפה גם נוירון חולדה בהיפוקמפוס DIV 5 מפגישה קודמת.
כמו כן בוצע פילוח דו-ממדי מהיחידה עם ניקוי מהיר ורינדור תלת מימד. נוירון חולדה בהיפוקמפוס DIV 5 נצפה גם על טיטאן קריוס אחר בהגדלה שונה. גודל הפיקסלים השתנה עם כספת הסחיטה של תוכנית IMOD כדי להתאים לטומוגרפיית האימון.
פילוח דו-ממדי מהיחידה עם ניקוי מהיר מדגים הסקה חזקה על פני ערכות נתונים עם עיבוד מקדים נכון, ובוצע עיבוד תלת ממדי של סגמנטציה. עיבוד מראש של הנתונים באופן זהה וכיול ההיסטוגרמות הם ללא ספק השלבים החשובים ביותר להסקת מסקנות נכונה ברשת. ברגע שהמיקום של מולקולות ידוע בתוך הטומוגרפיה, זה ממש טריוויאלי בתוך שפירית לחשב מדידות כמותיות או לחשב קואורדינטות ולהזין אותן לתוך צינור ממוצע תת-טומוגרפיה.
אנחנו רק מתחילים לראות את ההשפעות של למידה עמוקה על ניתוח תמונות cryo-ET, אבל זה רק עוד תחום אחד שבו זה מראה הבטחה עצומה באמת.
