עבודה זו נתמכה על ידי מלגה לטווח ארוך EMBO (ABW), קרן מדע בינלאומית מחקר הבתר האחווה לאומית (ABW), Gesellschaft מקס פלאנק (ABW, DS, JS, ACO), מלגת חפירות-BB (AO), והמועצה האירופית למחקר באירופה קהילות תכנית המסגרת השביעית STG-207,634 (DS, ACO). אנו מודים לראווי דסאי על הערות מועילות על כתב היד. כמו כן, אנו רוצים להודות למתקן ביטוי חלבון MPI-CBG לייצור בר Fibronectin1 דג הזברה, צוות מתקן דגי MPI-CBG לטיפול ותחזוקה של קווי הדגים שלנו ואת המתקן במיקרוסקופ אור MPI-CBG לתמיכת הדמיה.

1. לפני Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום שלפני לנתיחה, לקבל עוברים מincross של זוגות דג הזברה הטרוזיגוטיים עבור האלל המהונדס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעלות את העוברים במדיום E3 ללא מתילן כחול ב28 C o עד שלב מגן (6 שעות לאחר הפריה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה עובר במדיום E3 ללא מתילן כחול ל20 o CO / נ ב20 C o, עוברים יהוו somite 1 לכל שעה ברגע שהם מגיעים לשלב tailbud. אחרי 17-20 O שעה / N ב20 o C, עוברים צריכים להיות ב5 עד 8 ​​somite לביים למחרת בבוקר בתחילת הפרוטוקול לנתיחה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב כלים וחומרים כימיים נחוצים לנתיחה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה זכוכית אש המלוטשת להעברת עוברים ורקמות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זוג מלקחיים בסדר להסרת chorions מעוברים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנה מצופה Sylgard 35 מ&quot;מ לנתיחה - יוצקים פולימר Sylgard לתוך צלחת 35 מ&quot;מ ולרפא O / N ב° C. 37 הפוך לנתיחה גם באמצעותקצה מחט כדי להסיר נפח קטן של פולימר נרפא. המנה ניתן לנקות ולאחר מכן לעשות שימוש חוזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חידדו, כלי חוט טונגסטן שיטחו למניפולציה רקמת PSM </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרו אזמל לחיתוך חתיכות של PSM רצויים לתרבות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת פלסטיק 35 מ&quot;מ לדגירת טריפסין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיום L15 מכיל 10% בסרום שור עוברי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.25% פתרון טריפסין / EDTA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפים ג&#39;ל טעינת Sigmacoted לפיזור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות פטרי פלסטיק המכילות בינוני E3 ללא מתילן כחול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה צלחת הדמיה זכוכית תחתונה עם מצע Fibronectin1 (10 מיליליטר מיקרוגרם / PBS). עזוב את הצלחת על ספסל למעייל במהלך לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש stereoscope עם מסנני הקרינה מתאימים כדי לזהות ועוברי סוג חיוביים מהונדסים (שלב 5 עד 8 somite). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות עוברים מהונדסים על ידי בחינת המזודרם presomitic (PSM) לביטוי YFP תחת ערוץ פלואורסצנטי (איור 1 א). sho הקרינהULD להיות גלוי באזור מsomite נוצרה האחרונה לtailbud. בחר עובר עם אות הבהירה; 25% מצאצאים צריכים להיות עוברים הומוזיגוטים נושאים 2 עותקים של transgene. מספר העוברים שזוהו צורך משתנה על בסיס הניסוי. חתיכת tailbud גזור אחד תניב 1,000 תאים, בממוצע. בדרך כלל, כמה עוברים חיוביים נוספים הם שימושיים במקרה שגיאות שנעשו במהלך הנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משתמש באור להעברה כהתייחסות positional להבחין כל autofluorescence, במיוחד בתא החלמון, מאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העוברים חיוביים לצלחת פטרי פלסטיק נפרדת המכילה בינוני E3 ללא מתילן כחול. </li></ol></li></ol> 2. PSM Dissection ופיזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את העוברים לנתיחה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתיחה, באמצעות מלקחיים בסדר, להסיר בזהירות את סיסית מכל עובר במדיום E3. הקפד שלא לפגוע בעובר או לשבש את תא החלמון. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא Sylgard מצופה צלחת לנתח עם מדיום L15 עם סרום. בעזרת מלקחיים או עוד כלי שטוח, להסיר כל בועות אוויר מפני שטח של Sylgard. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את עוברי dechorionated באמצעות פיפטה אש הזכוכית מלוטשת לצלחת לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בכלי התיל, להעביר את כל העוברים בצד אחד של הצלחת לנתח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח PSM מעובר אחד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוריינט עובר יחיד בצד לרוחב שלה בקטן עשויים היטב בשכבת Sylgard בתוך הצלחת לנתח (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במייקרו האזמל, פרוסה דרך את העובר ותא חלמון רק קדמי למוח האחורי ודרך קוטב הגחון של העובר (איור 1 ב, מנוקד קו אדום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פיסה הקדמית של העובר מהבאר, שיזיז אותו משם לצד השני של הצלחת, ולאחר מכן להשתמש בכלי התיל כדי לגרד ממנו גרגרי תא חלמון שנותרו מהמדור האחורי כולל PSM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">ברגע שהחלמון כבר גרד משם, לשטח ולהתמצא PSM עם הקצה הקדמי פונה אל הנסיין ואחורי והצביע לעבר הנסיין (תרשים 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם השכבה דקה של האאקטודרם לא הוריד בנקודה זו, השתמש בכלי התיל כדי לקלף אותו מהחלק העליון של רקמת PSM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במייקרו האזמל לחתוך tailbud, הקצה האחורי ביותר של PSM עבר סוף notochord, הרחק משאר הרקמות (איור 1 ג, מנוקד קו אדום). הערה: חלקים אחרים של רקמה מPSM, לדוגמא PSM הקדמי קרוב יותר לsomite נוצרה האחרונה, יכול גם לקחת בתרבות, בהתאם לשאלת הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את פיסת tailbud לפינה אחת של הצלחת הרחק מהאזור לנתח. השתמש בכלי התיל כדי לנקות את כל פסולת ורקמות עובר לא רצויות מהתחום לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור עם העובר הבא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתיכות tailbud בריכה מדואר מרובהmbryos, תלוי כמה תאים יידרש לצורך הניסוי. בממוצע, פיסת רקמת tailbud אחת תשואות 1,000 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא צלחת פלסטיק 35 מ&quot;מ ריק עם נפח קטן של טריפסין-EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פיפטה אש הזכוכית מלוטשת, להעביר פיסות tailbud מצלחת לנתח לצלחת המכילה טריפסין / EDTA. דגירה חתיכות tailbud בטריפסין / EDTA עבור 20 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הרקמות מתבצעות מודגרות בטריפסין, להסיר את פתרון Fibronectin1 מצלחת ההדמיה עם רצפת הזכוכית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הפתרון מזכוכית 3 פעמים עם מים MilliQ. השתמש ביניקה כדי להסיר כל שטיפה ולהבטיח את הצלחת יבשה לחלוטין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר חתיכות tailbud במדיום להדמיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה של ​​מדיום L15 100 μl עם סרום לתוך צלחת הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קצה הג&#39;ל מצופה, להסיר את חתיכות tailbud מטריפסין / EDTA בקטן כמו נפח ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה חתיכות tailbud לתוך המדיום בצלחת הדמיה. פיפטה החתיכות מעלה ומטה מספר פעמים כדי לפרק אותם ולהשעות את התאים במדיום. היזהר שלא להכניס בועות אוויר. הגעה לגושי תא מתחת למיקרוסקופ ולפזר יותר לפי צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תאים מפוזרים בהשעיה להתיישב על משטח הזכוכית המצופה Fibronectin1 ל20 דקות ב RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נפח קטן של מדיום L15 נוסף עם סרום לתאים לפני תחילת הדמיה. השתמש טיפול לא לשבש תאים מיושב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתחשב בשאלה הניסיונית, להוסיף כל משלים או טיפולים תרופתיים לתרבות. </li></ol> 3. הדמיה של תאים המפוזרים PSM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מנה הדמיה בתא טמפרטורה על המיקרוסקופ ההדמיה הזמן לשגות. הגדרת תא וורנר לטמפרטורה רצויה לצורך הניסוי. לאפשר מנה לאזן לפחות 30 דקות לפני תחילת רכישת תמונה. טמפרטורה להצליב עדויות עם בדיקה טמפרטורה חיצונית ממוקמת לתוך צלחת, אם נדרש. הערה: בשלהקשר בין הטמפרטורה וקצב somitogenesis 21 בקרת טמפרטורה יציבה הוא חיוני למדידות מדויקות של התקופה בתאי PSM אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות בדיקה בערוץ הקרינה כדי לבדוק שזמן החשיפה ורווח לספק טווח דינמי גדול של עוצמות ללא הרוויה כדי להבטיח איתות טובה לרמות רעש. תמונת הקרינה אופיינית שנרכשה מהתאים מפוזרים שנוצרו מהקווים שלנו תוך שימוש בפרוטוקול זה דורשת 400 אלפיות שני ו40 אלפית שני לתמונת אור המועבר עם מצלמה EMCCD הפועלת ברווח EM 85. בנוסף, רווח לפני מגבר ומהירות קריאת נתונים מצלמה גם הן חיונית על מנת למקסם את האות על רעש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות ערוץ האור המסור, לבחור שדות של תאים לרכישת הזמן לשגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל פרוטוקול רכישת הזמן לשגות לאורך רצוי של זמן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרכוש אור אחד משודר ותמונת הקרינה אחד לכל תחום. הערה: הגדרת מרווח זמן בין ro הרכישהunds כי תהיה ללכוד את הדינמיקה זמנית ללא צילום הלבנה פני הדמיה מורחבת או רעילות וישכנע בתאים. פרוטוקול זה משתמש מרווח 2 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק הגדרת הזמן לשגות מדי פעם במהלך הקלטה כדי להבטיח שתאים נשארים בפוקוס, אין שגיאות בתוכנה או בחומרה, וכו &#39; </li></ol> 4. עיבוד תמונה של הזמן לשגות סרטים הנרכשים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח קובץ סרט לשדה שנרכש בתוכנת עיבוד תמונה. הערה: פיג&#39;י שימשה לכל העיבוד בפרוטוקול זה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול מועבר מסגרות אור וקרינה משדה אחד ליצירה 2 ערימות של תמונות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר תא בודד בערוץ האור המועבר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את ההחזר על ההשקעה עגולה (אזור של עניין) מסביב לתא שנבחר במסגרת הראשונה בערוץ האור המועבר. הערה:.. רק תאים ש1 בריא בסוף ההקלטה, 2 לא זזים מחוץ לתחום, ו3 לא באים במגע עם הספירה אחרת.LLS מתבצע מעקב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציל את ההחזר על ההשקעה בכל כמה מסגרות למנהל את ההחזר על ההשקעה. עקוב אחר תא עד הפריים האחרון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מודד את עוצמת באמצעות ROIs הצילה בערוץ פלואורסצנטי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מחסנית הקרינה ועם ROIs הצילה, השתמש במעגל המותאם אישית משרבב התוספת ומאקרו כדי למדוד את עוצמתו של התא במעקב לאורך זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את עקבות הפלט מהמאקרו. אם שמץ איכותי לוכד תכונות של הזמן לשגות הקרינה, לייצא את הערכים לגיליון העבודה של Excel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את רשימת ההחזר על ההשקעה עבור התא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על מעקב בערוץ משודר ומדידה בערוץ הקרינה לתאים אחרים בתחום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על כל הצעדים לתחומים נוספים מהניסוי. </li></ol>

<ol>
	<li>Cooke, J., Zeeman, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clock+and+wavefront+model+for+control+of+the+number+of+repeated+structures+during+animal+morphogenesis.">A clock and wavefront model for control of the number of repeated structures during animal morphogenesis.</a> J Theor Biol. 58, 455-476 (1976).</li><li>Oates, A. C., Morelli, L. G., Ares, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+embryos+with+oscillations:+structure,+function+and+dynamics+of+the+vertebrate+segmentation+clock.">Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock.</a> Development. 139, 625-639 (2012).</li><li>Dequeant, M. L., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmental+patterning+of+the+vertebrate+embryonic+axis.">Segmental patterning of the vertebrate embryonic axis.</a> Nat Rev Genet. 9, 370-382 (2008).</li><li>Oates, A. C., Gorfinkiel, N., Gonzalez-Gaitan, M., Heisenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+approaches+in+developmental+biology.">Quantitative approaches in developmental biology.</a> Nat Rev Genet. 10, 517-530 (2009).</li><li>Oates, A. C., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy/E(spl)-related+(Her)+genes+are+central+components+of+the+segmentation+oscillator+and+display+redundancy+with+the+Delta/Notch+signaling+pathway+in+the+formation+of+anterior+segmental+boundaries+in+the+zebrafish.">Hairy/E(spl)-related (Her) genes are central components of the segmentation oscillator and display redundancy with the Delta/Notch signaling pathway in the formation of anterior segmental boundaries in the zebrafish.</a> Development. 129, 2929-2946 (2002).</li><li>Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinhibition+with+transcriptional+delay:+a+simple+mechanism+for+the+zebrafish+somitogenesis+oscillator.">Autoinhibition with transcriptional delay: a simple mechanism for the zebrafish somitogenesis oscillator.</a> Curr Biol. 13, 1398-1408 (2003).</li><li>Schroter, C., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segment+Number+and+Axial+Identity+in+a+Segmentation+Clock+Period+Mutant.">Segment Number and Axial Identity in a Segmentation Clock Period Mutant.</a> Curr Biol. 20, 1254-1258 (2010).</li><li>Riedel-Kruse, I. H., Muller, C., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchrony+dynamics+during+initiation,+failure,+and+rescue+of+the+segmentation+clock.">Synchrony dynamics during initiation, failure, and rescue of the segmentation clock.</a> Science. 317, 1911-1915 (2007).</li><li>Ozbudak, E. M., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+synchronizes+the+zebrafish+segmentation+clock+but+is+not+needed+to+create+somite+boundaries.">Notch signalling synchronizes the zebrafish segmentation clock but is not needed to create somite boundaries.</a> PLoS Genet. 4, e15 (2008).</li><li>Herrgen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+Coupling+Regulates+the+Period+of+the+Segmentation+Clock.">Intercellular Coupling Regulates the Period of the Segmentation Clock.</a> Curr Biol. 20, 1244-1253 (2010).</li><li>Sawada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf/MAPK+signalling+is+a+crucial+positional+cue+in+somite+boundary+formation.">Fgf/MAPK signalling is a crucial positional cue in somite boundary formation.</a> Development. 128, 4873-4880 (2001).</li><li>Giudicelli, F., Ozbudak, E. M., Wright, G. J., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+the+tempo+in+development:+an+investigation+of+the+zebrafish+somite+clock+mechanism.">Setting the tempo in development: an investigation of the zebrafish somite clock mechanism.</a> PLoS Biol. 5, e150 (2007).</li><li>Herrgen, L., Schroter, C., Bajard, L., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+embryo+time-lapse+imaging+of+zebrafish+development.">Multiple embryo time-lapse imaging of zebrafish development.</a> Methods Mol Biol. 546, 243-254 (2009).</li><li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+expression+of+the+bHLH+factor+Hes1+regulated+by+a+negative+feedback+loop.">Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop.</a> Science. 298, 840-843 (2002).</li><li>Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronised+cycling+gene+oscillations+in+presomitic+mesoderm+cells+require+cell-cell+contact.">Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact.</a> Int J Dev Biol. 49, 309-315 (2005).</li><li>Reppert, S. M., Weaver, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+circadian+timing+in+mammals.">Coordination of circadian timing in mammals.</a> Nature. 418, 935-941 (2002).</li><li>Welsh, D. K., Imaizumi, T., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+reporting+of+circadian-regulated+gene+expression+by+luciferase+imaging+in+plants+and+mammalian+cells.">Real-time reporting of circadian-regulated gene expression by luciferase imaging in plants and mammalian cells.</a> Methods Enzymol. 393, 269-288 (2005).</li><li>Soroldoni, D., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+transgenic+reporters+of+the+vertebrate+embryo's+Segmentation+Clock.">Live transgenic reporters of the vertebrate embryo's Segmentation Clock.</a> Curr Opin Genet Dev. 21, 600-605 (2011).</li><li>Masamizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+the+somite+segmentation+clock:+revelation+of+unstable+oscillators+in+the+individual+presomitic+mesoderm+cells.">Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1313-1318 (2006).</li><li>Soroldoni, D., Hogan, B. M., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+transgenesis+with+meganuclease+constructs+in+zebrafish.">Simple and efficient transgenesis with meganuclease constructs in zebrafish.</a> Methods in molecular biology. 546, 117-130 (2009).</li><li>Schroter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+zebrafish+somitogenesis.">Dynamics of zebrafish somitogenesis.</a> Dev Dyn. 237, 545-553 (2008).</li><li>Picker, A., Roellig, D., Pourquie, O., Oates, A. C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+micromanipulation+in+zebrafish+embryos.">Tissue micromanipulation in zebrafish embryos.</a> Methods in molecular biology. 546, 153-172 (2009).</li><li>Mould, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multiple+integrin+beta1+homologs+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Identification of multiple integrin beta1 homologs in zebrafish (Danio rerio).</a> BMC Cell Biol. 7, 24 (2006).</li><li>Mould, A. P., Koper, E. J., Byron, A., Zahn, G., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+ligand-binding+pocket+of+integrin+alpha5beta1+using+a+gain-of-function+approach.">Mapping the ligand-binding pocket of integrin alpha5beta1 using a gain-of-function approach.</a> Biochem J. 424, 179-189 (2009).</li><li>Zhao, Q., Liu, X., Collodi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+fibronectin+in+zebrafish.">Identification and characterization of a novel fibronectin in zebrafish.</a> Exp Cell Res. 268, 211-219 (2001).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+The+zebrafish+book+:+a+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Brachydanio+rerio).">In The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio).</a> , (1993).</li><li>Vallone, D., Santoriello, C., Gondi, S. B., Foulkes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+protocols+for+zebrafish+cell+lines:+maintenance+and+transfection.">Basic protocols for zebrafish cell lines: maintenance and transfection.</a> Methods Mol Biol. 362, 429-441 (2007).</li><li>Carr, A. J., Whitmore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+single+light-responsive+clock+cells+reveals+fluctuating+free-running+periods.">Imaging of single light-responsive clock cells reveals fluctuating free-running periods.</a> Nat Cell Biol. 7, 319-321 (2005).</li><li>Whitmore, D., Foulkes, N. S., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+acts+directly+on+organs+and+cells+in+culture+to+set+the+vertebrate+circadian+clock.">Light acts directly on organs and cells in culture to set the vertebrate circadian clock.</a> Nature. 404, 87-91 (2000).</li><li>Soroldoni, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Doppler+effect+in+embryonic+pattern+formation.">A Doppler effect in embryonic pattern formation.</a> Science. 345, 222-225 (1126).</li></ol>

מחבר תרומות: ABW פיתח ושכלל פיזור, תרבות, הדמיה, ופרוטוקולי מעקב סלולרי. DS שנוצר הקווים מהונדסים ופקח על העיצוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הזמן לשגות בשימוש בפרוטוקול זה. AO חלוץ ניסויי הוכחה של עיקרון ראשוניים לנתק ותאי PSM הדימוי בתרבות. JS כתב כלי תוסף משרבב המעגל בפיג&#39;י משמש למדידת עוצמת הקרינה מהזמן לשגות סרטים. ABW וACO כתבו את כתב היד.

ללמוד תהליך תאי המתרחש במהלך התפתחות עוברית, ביולוגים בדרך כלל לנצל את הגישה בהקשר של כל העובר. עם זאת, כדי להבין איך תא בודד מתנהג בתוך מסגרת זמן התפתחותי, שיטה לבחינה ולהפריע תאים בודדים בבידוד היא גם מאוד מועילה. על ידי יצירת תרביות תאי PSM פוזרו באמצעות עוברי דג הזברה מהונדסים עכשיו יש לנו כלי ללמוד ישירות את האופי האוטונומי התא של תנודות גנטיות בשעון פילוח בצורה כמותית. אפשר למדוד את הדינמיקה של התנודות בכתב הניאון שלנו במאות תאים תחת מגוון רחב של תנאים. התקופה נצפתה של תאים בודדים בתרבות היא ארוכה יותר מתקופת somitogenesis בעובר ללא פגע. אנו צופים כי explant PSM ללא פגע בתרבות גם תערוכות תנודות איטיות יותר מהעובר ללא פגע (מידע לא מוצג), המצביעות על thaלא תקופה ארוכה יותר שנצפתה בתאים מבודדים היא לא רק בשל נזק מפיזור. תקופה ומשרעת משתנה הוא ציין ברוב סדרת הזמן מהתא הבודד שלנו. המקור של השתנות זו אינה ידוע, אך צריך לחשוף פרטים חשובים על מעגלי קבלת קצב של שעון הפילוח. בשיטה זו אנו יכולים ללמוד את המרכיבים הגנטיים של פילוח ברמה התאית, ושאלות כתובת שמאתגרים לבחון בכל העובר. לדוגמא, על ידי תוספת מבוקרת של מולקולות איתות ידועות שנמצאו בעובר המתפתח לתרבויות שלנו, אנו יכולים לבחון את ההשפעות שלהם על מתנד הסלולרי PSM הבודד בassay חזק והשחזור. מערכת תרבות PSM שלנו פותחת את הדלת להערכה קפדני של מה הגורם, לבד, או בשילוב לקדם את התנודות בתאים אלה, מה גורמים מעכבות תנודות אלה, ולבחון את יחסי הגומלין בין מולקולות כאלה. בעזרת כלים אלה ביד, אנו שואפיםלהעריך מודלים קיימים של somitogenesis המבוססים על נתונים שפורסמו ברמת רקמה, כמו גם תוצאות שימוש בתאים בודדים ליצירת חיזויים שניתן לבדוק בכל העובר. למיטב ידיעתנו, זהו פרוטוקול תרבית תאים עיקרי דג הזברה הראשון להקלטת הזמן לשגות אקוטית של הקרינה בתאים בודדים; פיתוח וחידוד נוסף של פרוטוקול זה הוא ללא ספק אפשרי. פרוטוקולים אחרים לעתים קרובות להשתמש בעוברי דג הזברה כדי להפיק שורות תאי יציבות שניתן transfected עם כתבים ומשמשים להדמיה לטווח ארוך 27-29. בעוד קווים יציבים שימושיים להדמית תהליך שאינו קשור לעיתוי פיתוח, כגון שעון הביולוגי, השאלה של פילוח עוברי מחייבת הדמיה מיידית בזמן שתאים עדיין בתנודתית, מדינת אביהם. ברגע שהתאים להפסיק נדנוד, הם מניחים גורל תא מובחן, וכאשר ברקמות, יהיה שולב somite. זה פוssible שעם הגורם או גורמים הנמצאים במבחנה הנכון אנחנו יכולים ליצור קווי תרבית תאי דג הזברה כמו PSM שיישאר תנודתית, המאפשרים באופן משמעותי תצפיות לטווח ארוך, הפרעות רציפים מרובות, או הקרנת תפוקה גבוהה. אנו מצפים כי שיטה זו של הכנת תרבויות עיקריות של תאים התפזרו לזמן לשגות הדמיה היא מתאימה היטב ללימוד כל תהליך תאי המתרחש בתוך מסגרת זמן ההתפתחותי שאינה נגיש באמצעות שורות תאי דג הזברה יציבה. הבידוד של תאים מסוגים שונים בשלבי התפתחות שונים מקווי הכתב מהונדסים המתאימים, בין אם באמצעות נתיחה או באמצעות FACS לאחר ניתוק עוברי, יכול לספק את התאים שמתחילים. אופטימיזציה של חלק מתנאי התרבות, מודרכים על ידי המקור העוברי של התאים, ייתכן שתידרש. על ידי שילוב של פרוטוקול גמיש ורגיש זה עם האוסף גדל במהירות של דג הזברה מהונדסקווים, אנו מקווים להקל במבחנה התפתחותית גישת ביולוגיה כי הוא משלים לשיטות גנטיות ועובריות קלאסיות.

היווצרות התקופתית של מגזרים לאורך ציר חוליות גוף, או somitogenesis, היא עדות למתנד מרחב ובזמן בעובר המתפתח. המנגנון המועדף השליטה somitogenesis מתואר מושגית על ידי מודל &quot;שעון וחזית גל&quot; 1, שבו &quot;השעון&quot; בהיקף של מתנדים סלולריים, עכשיו חשב להיות מונע intracellularly ידי הביטוי הקצבי של סט של גנים מחזוריים 2, מתקתק את היווצרות של somites מהמזודרם presomitic (PSM). כעובר מתפתח, &quot;חזית גל&quot; התבגרות בPSM נעה בתיאום עם רקמת רגרסיה לכיוון האחורי, להאט ולעצור מתנדים סלולריים כשהוא עובר 3. יחד, מערכת spatiotemporally הדינמית הזה נקראת שעון הפילוח. גישות הנוכחיות כדי ללמוד את תוחלת שעון פילוח שלוש רמות גוברת של ארגון ממתנד הגנטי בתאים בודדים לה צימוד המקומיתבמתרחש בין תאים ולבסוף לרגולציה הגלובלית של מידע positional ברקמת PSM הקיבוצית 4. מחקרים קודמים מצביעים על מתנד פילוח התאים אוטונומיים בדג זברה מורכב של גנים ומוצרי חלבון משעתוקה / הס factorfamily, אשר נחשבים ליצירת לולאת משוב שלילית באמצעות דיכוי תעתיק 5-7. מסלול איתות דלתא / Notch מסנכרן תנודות בין תאים השכנים ומסדיר את התקופה הקולקטיבית של האוכלוסייה 8-10. מולקולות FGF איתות מיוצרות בtailbud מופיעות לבנות שיפוע פני PSM דג הזברה, וכך שיערו לתרום להאטה ועצר את תאי נדנוד בקדמי 11. עד עכשיו, את התפקידים תפקודיים של כל אחת מהמולקולות האלה בsomitogenesis נחקרו על ידי מוטציה גנטית, הזרקת morpholino, חום הלם, וגיד יריב תרופה על ביטויtment של רכיבי שעון ואיתות בין תאי 5,7,10,12. שימוש בהפרעות אלה, פונקצית שעון פילוח כבר להסיק מתיאורים ברמת רקמה של פגמים somite והאובדן של תנודות אחידות בביטוי של גנים מחזוריים כמו her1, her7, ודלתא ג עם זאת, כמעט כל הנתונים האלה הם מעוברים קבועים ומצליחין ללכוד במדויק את שינויים שנובעים מעצם התפקוד הדינמי של שעון הפילוח. לאחרונה, זמן לשגות הדמיה מרובה עובר חשפה את מוטציות הראשונות עם תקופת מתנד השתנתה, אך תצפיות אלה נעשו גם ב7,13 רמת רקמות. לפיכך, התנהגות של מתנד התאים אוטונומיים שיערו במהלך somitogenesis לא נצפתה. תמונות סטטיות של somitogenesis נותנים תמונה חלקית כי, מטבעו, התהליך הוא מונע על ידי מערכת תנודתית. העבודה קודמת בתאי עכבר והחומוס הראתה כי רמות של תמלילועליית חלבון ונפילה, אבל דגימת תנודה כ 2 שעות בכל דקות 30 או 45 בהכרח מגביל את הנתונים שנאספו, ולכן מסקנות שניתן להסיק 14,15. מחקר של מתנדים ביולוגיים אחרים, בעיקר, שעונים ביולוגיים, התרחק ממדידות מבוימות של גנים וביטוי חלבונים לניטור בזמן אמת באמצעות ניאון וכתבי bioluminescent 16,17. כלים אלה הם חיוניים להוכחת תכונות שעון של תאים בודדים 18. כתב bioluminescent של הגן המחזורי Hes1 פותח ובקצרה מאופיין בתאי PSM עכבר אחת 19. תקופה והשונות הממוצעת חושבו עבור מספר קטן של תאים, מראים כי תנודות להימשך מספר מחזורים במבחנה. עם זאת, מחקרים אלו לא כמותית להתייחס ליציבות והחוסן של תדר מתנד ומשרעת, אם תאים באופן ספונטני יכולים להיכנס או תנודות יציאה,וכיצד התאים לשמור על היחסים בשלב שלהם. בנוסף, ההשפעות של מולקולות איתות שנמצאו בעובר על שעון התאים אוטונומיים לא נבדקו באופן ישיר. כתוצאה מכך, מאפייני יסוד אלה של מתנד התא הבודד אינם ידועים לחלוטין. יש לנו לאחרונה פיתחו קווי דג מהונדסים באמצעות recombineering BAC 20 לנהוג כתבי הקרינה ונוס (YFP) ביטוי her1 30. קווים כאלה לנצל את רמזי הרגולציה של הלוקוס כרומוזומליות השלמה שבו הם משובצים, ולשחזר את הדינמיקה הזמנית ודפוס המרחבי של her1. פריצת דרך זו מאפשרת ניטור בזמן אמת של ביטוי גנים בעובר דג הזברה מתפתח בגוף חי. כדי לחקור את התכונות הבסיסיות של תנודות תאים אוטונומיים וכיצד ביטוי כגון מוסדר לאורך זמן, לאחרונה פיתחו שיטה אמינה לבודד ולהקליט מתאי PSM במבחנה. פרוטו זהcol מתאר כיצד יש לנו מנוצלים קווי הכתב המהונדס שלנו כדי ליצור תרביות תאים מפוזרות, שממנו אנחנו יכולים לאפיין את התנודות של שעון פילוח דג הזברה בתאים בודדים. אנחנו יכולים להתמודד עם שאלות ובכך מצטיינים בתחום שלא היו נגישים לניתוח סטטי או ברמת רקמה, כמו גם ישירות לתפעל את שעון הפילוח ברמת התא הבודד עם מולקולות ומעכבי איתות.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epifluorescence microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>Model: SZX16</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epifluorescence microscope</td>
 <td>X-cite Illumination</td>
 <td>Series: 120Q</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>Model: SZX12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps no. 55</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11295-51</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass transfer pipettes</td>
 <td>Assistent</td>
 <td>567/2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm plastic petri dishes</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>627102</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60 mm plastic petri dishes</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>628102</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard polymer</td>
 <td>SASCO</td>
 <td>266727</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manipulation tools</td>
 <td>Made in-house</td>
 <td></td>
 <td>For description of manipulation tools Ref. 22</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microsurgical knife</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>500249</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L15 medium</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>57322</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin/streptomyocin</td>
 <td>PAA</td>
 <td>P11-010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal bovine serum</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>257322</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.05% trypsin / 0.02% EDTA</td>
 <td>PAA </td>
 <td>L11-004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gel loading tips</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>253188</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sigmacote</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>254589</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micropipette set</td>
 <td>Gilson International</td>
 <td>F167300</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Zebrafish Fibronectin1 70 kD fragment</td>
 <td>MPI-CBG protein facility</td>
 <td></td>
 <td>Generated in-house from construct based on previously published work Ref. 23-25</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass bottom imaging dishes</td>
 <td>Mattek (single well)</td>
 <td>P35G-1.5-14-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass bottom imaging dishes</td>
 <td>Greiner (CellView -multi-well)</td>
 <td>262502</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E3 medium without methylene blue</td>
 <td>Made in-house</td>
 <td></td>
 <td>From The Zebrafish Book, 5th Ed. Ref. 26 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic transfer pipettes</td>
 <td>Ratiolab</td>
 <td>260011</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Warner heating/cooling chamber</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>TC-324B/344B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EM-CCD camera</td>
 <td>Andor</td>
 <td>Model: iXOn 888</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>Model: Axiovert 200M</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td></td>
 <td>NeoFluor 40x, NA 0.75</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td>Lumencor Light Engine</td>
 <td>Model: Spectra X</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td>BrightLine HC 575/15</td>
 <td>F39-575</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

generation of dispersed presomitic mesoderm cell cultures for imaging of the zebrafish segmentation clock in single cells

פילוח הוא תהליך morphogenetic תקופתי ורציף בבעלי חוליות. היווצרות קצבית זה של בלוקים של רקמה הנקראים somites לאורך ציר הגוף היא עדות למתנד גנטי דפוסי העובר המתפתח. בדג הזברה, פילוח שעון תאיים נהיגה מורכב מבני המשפחה גורם שעתוקה / הס מאורגנים בלולאות משוב שליליות. יש לנו לאחרונה שנוצרו קווי כתב ניאון מהונדסים לher1 הגן המחזורי כי לשחזר את דפוס המרחב ובזמן של תנודות בהמזודרם presomitic (PSM). שימוש בקווים אלה, פיתחנו מערכת תרבות במבחנה המאפשרת ניתוח של תנודות שעון פילוח בזמן אמת בתוך תאים בודדים, מבודדים PSM. על ידי הסרת רקמת PSM מעוברים מהונדסים ולאחר מכן פיזור תאים מנדנוד אזורים על גבי זכוכית תחתונה מנות, אנחנו שנוצרנו תרבויות מתאימות לזמן לשגות הדמיה של אות הקרינה מןתאי שעון בודדים. גישה זו מספקת מסגרת רעיונית ואת ניסיון המניפולציה ישירה של שעון הפילוח עם רזולוציה תא בודד חסרת תקדים, המאפשרת תכונות התאים אוטונומיים ורמת הרקמה שלה כדי להיות מכובדים וגזורות.

פרוטוקול זה מייצר תרביות של תאי קיימא, מפוזרים, אחת PSM לזמן לשגות הדמיה של אות הקרינה (איור 2). transgene יוצר כתב מחזורו של ייצור והשפלה מתרחש עם דינמיקה דומה לגני אנדוגניים והחלבון בעובר, בסדר הגודל של חצי שעה. בשל התחלופה מהירה שלה, אות YFP בתאים בודדים צריכה להיות מזוהה במהירות כדי למזער הלבנת ועם רזולוציה גבוהה זמנית כדי ללכוד את תכונותיו של כל מחזור תנודתית. כמו כן, בהתחשב באפלולית היחסית של האות, תנאי תרבות והרכישה היו מכוון בקפידה כדי להבטיח תוצאות רגישות וחזקה. אנחנו צריכים למצוא את הגורמים הבאים להיות חשובים ביצירת תרביות תאי PSM אופטימליות להדמיה: 1. מצע ECM משמש לציפוי מנות תרבות הזכוכית התחתונה. 2. תוספת של סרום לנתיחה ובינוני הדמיה. 3. Dissection של PSM מעוברים מזוהים שנלקחו לאחר hete ההזדווגותזוגות rozygous, צאצאיו פוטנציאל לשאת 2 עותקים של transgene. 4. רכישת תמונה בטווח הגדלה אופטימלי, באמצעות מטרת NA גבוהה יותר כדי להבטיח לכידה יעילה של אותות הקרינה. 5. תאורה עם מקור אור מצב מוצק כדי למזער את התנודות בעוצמה שיכול לתרום לרעשי רקע. 6. גילוי אותות עם מצלמה EM-CCD רגיש מאוד למקסם את תצוגת אותות. תרבויות תת אופטימליות יכילו תאים שלא נשארים מעוגל ובריא לאורך כל ההקלטה. חוקרים שערנו כי מצע ECM שלנו, שבר של fibronectin1 דג הזברה שומר תאים במדינה כמו PSM מובחן, בהשוואה למצעים נפוצים אחרים כמו פולי-ליזין או laminin. מצעים אחרים שבדקנו שנגרמו לתאים לשטח על הזכוכית ואובדן אות ניאון נדנוד במהלך ההקלטה. כמו כן מצאנו כי התוספת של סרום למדיום במהלך נתיחה, פיזור,וההקלטה לא הייתה חשובה רק כדי להרוות את טריפסין משמש לניתוק, אלא גם הגדילה את עוצמת הקרינה על פני רקע, ככל הנראה בשל כדאיות תא משופרות. כדי להבטיח לכידת אות אופטימלית מהתאים בודדים היינו מטרת 40X שתוכננה במיוחד דימות פלואורסצנטי (סדרת NeoFluor תכנית Zeiss) עבור עם NA גבוה. מצאנו גם כי מקור אור מצב מוצק סיפק תאורה יציבה יותר ממנורות כספית מסורתיות, שהוא קריטי כדי למזער את תנודות רקע שתורמים לתמונות רועשות. שינויים אלה חשובים כדי להבטיח תוצאות חזקות. שימוש בפרוטוקול זה אנו מצפים תרבויות שברוב התאים בתחום מסוים הם פלורסנט בשלב כלשהו במהלך ההקלטה. אנו מוצאים כי תאי ניאון בדרך כלל נשארים מעוגלים ולעתים די ניעתי במהלך הקלטות. כמה תאים, כוללים תאי ניאון, עלולים להפוך אפופטוטיים במהלך ההקלטה. תאים אלה אינם נכללים בשוםnalysis. גם אנו לא כוללים תאים שבאים במגע עם תאים אחרים או להעביר מחוץ לשדה הראייה. בממוצע, אנו רואים ירידת 12% בתא מספר לכל שדה עד סוף הקלטת שעות 10 כפי שהיא נמדדת על ידי ספירת מספר התאים בריאים בערוץ האור המועבר. הפסד זה כולל גם מוות של תאים ותאים שעברו מחוץ לתחום. בהתחשב באזהרות הללו אנו יכולים, בממוצע, במסלול 5 תאים ניאון לשדה שנשארים קיימא ונראה לעין, ובדרך כלל להקליט 6 שדות לכל מצב. לדוגמא, ניסוי עם 4 תנאים יהיה 24 שדות הכולל שנרכשו ובדרך כלל כ 30 תאים במעקב לכל מצב. בתנאי הדמיה סטנדרטיים עם מדיום L15 מכיל 10% בסרום שור עוברי, אנו מוצאים כי תאי PSM (n = 101 תאים מ4 משכפל ניסיוני) יכולים לייצר בין 2 ל -7 פסגות, עם הממוצע וסטיית תקן של 3 ± 1 פסגות (2 מחזורים -3). חציון מספר השיא, כמו גם את אחוזון 25%, הוא 2 פסגות ואני אחוזון 75%זה 3 פסגות. באמצעות המעקב והניתוח חצי אוטומטיים שלנו, אנחנו יכולים ליצור במהירות עוצמת הקרינה על עקבות זמן לתאי PSM בודדים, עם עקבות תא נציג שמוצגים באיור 2 ג. עקבות גלם אלה לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לבצע מדידות כמותיות של מאפיינים של תאי PSM נדנוד, כגון תדירות, משרעת, מספר המחזורים, ועיתוי של פסגות. <img alt="איור 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50307/50307fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50307/50307fig1.jpg" /> איור 1. זיהוי של עוברים ושרטוטים מהונדסים של הנתיחה שלהם. () תצוגה לרוחב של עובר דג הזברה מהונדס מבטא הקרינה YFP בשלב 5-somite ~. תמונה היא כיסוי של אור מועבר וערוץ פלואורסצנטי. חצים מצביעים על אזורים של אות מתחילים בקצה של tailbud, לאורך PSM, לקראת l<html> AST נוצר somite. הבלעה מראה סכמטי של transgene הכתב (למידע נוסף על הפיתוח שלה ובהתנהגות vivo מתייחס לSoroldoni et al. 30. (B) סכמטי של תצוגה לרוחב של עובר לפני לחתוך ראשון במהלך לנתיחה. קו אדום מקווקו מציין את החתך הראשון עשה מעבר למוח האחורי, אם כי תא החלמון ממש מאחורי tailbud בתצוגה סכמטית. (C) של PSM השטוח לאחר פינוי גרגרי חלמון ושכבת האפידרמיס, שכיוונה לאורך הציר הקדמי, אחורי שלה. קו אדום מקווקו מציין את החתך השני כדי להסיר את הקצה של tailbud לפיזור ותרבות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50307/50307fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 07fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2. נציג תמונות ועקבות מתא בודד בתרבות PSM התפזרה. () מונטאז&#39; של תמונות משודרות אור תא PSM בודד בהקלטת הזמן לשגות 6 שעות. שים לב שהתא נשאר מעוגל ובריא לאורך כל מהלך ההקלטה. (ב &#39;) מקבילים מונטאז&#39; של תמונות הקרינה מסלולרית PSM אחת. פסגות בעוצמה של התא ממוספרות במהלך ההקלטה. (ג) בעצימות ממוצעת לאורך הזמן נמדדו מהחזר על השקעה שהונחה על תא זה. ערכי לקוחים מכל מסגרת מסרט עם קצב פריימים של אחד לכל 2 דקות באמצעות משרבב עיגול התוספת ומאקרו המותאם אישית נכתב בפיג&#39;י. פסגות בעוצמת ממוספרות שוב לאורך כל העקבות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50307/50307fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells at JoVE.com

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Somitogenesis הוא תהליך התפתחותי קצבי שמרחבית דפוסי ציר הגוף של עוברי החולייתנים. בעבר, פיתחנו קווי דג הזברה מהונדסים המשתמשים בכתבי ניאון להתבונן גנים מחזוריים המניע את התהליך הזה. כאן, אנו תרבות מפוזרת תאים משורות אלה ותמונת התנודות שלהם לאורך זמן במבחנה.

דור של תרביות תאים המפוזרים Presomitic המזודרם להדמיה של דג הזברה פילוח השעון בתאים בודדים

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

generation-dispersed-presomitic-mesoderm-cell-cultures-for-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K Views.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics.  Somitogenesis הוא תהליך התפתחותי קצבי שמרחבית דפוסי ציר הגוף של עוברי החולייתנים. בעבר, פיתחנו קווי דג הזברה מהונדסים המשתמשים בכתבי ניאון להתבונן גנים מחזוריים המניע את התהליך הזה. כאן, אנו תרבות מפוזרת תאים משורות אלה ותמונת התנודות שלהם לאורך...

Video: Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

תא בודד הגורל מיפוי של דג הזברה

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך למבוגרים התחדשות זנב סנפיר דג הזברה

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks (reviewed1,2). The circadian time-keeping system is a hierarchical multi-oscillator network, with the central clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) synchronizing and coordinating extra-SCN and peripheral clocks elsewhere1,2. Individual cells are the functional units for generation and maintenance of circadian rhythms3,4, and these oscillators of different tissue types in the organism share a remarkably similar biochemical negative feedback mechanism. However, due to interactions at the neuronal network level in the SCN and through rhythmic, systemic cues at the organismal level, circadian rhythms at the organismal level are not necessarily cell-autonomous5-7. Compared to traditional studies of locomotor activity in vivo and SCN explants ex vivo, cell-based in vitro assays allow for discovery of cell-autonomous circadian defects5,8. Strategically, cell-based models are more experimentally tractable for phenotypic characterization and rapid discovery of basic clock mechanisms5,8-13.
Because circadian rhythms are dynamic, longitudinal measurements with high temporal resolution are needed to assess clock function. In recent years, real-time bioluminescence recording using firefly luciferase as a reporter has become a common technique for studying circadian rhythms in mammals14,15, as it allows for examination of the persistence and dynamics of molecular rhythms. To monitor cell-autonomous circadian rhythms of gene expression, luciferase reporters can be introduced into cells via transient transfection13,16,17 or stable transduction5,10,18,19. Here we describe a stable transduction protocol using lentivirus-mediated gene delivery. The lentiviral vector system is superior to traditional methods such as transient transfection and germline transmission because of its efficiency and versatility: it permits efficient delivery and stable integration into the host genome of both dividing and non-dividing cells20. Once a reporter cell line is established, the dynamics of clock function can be examined through bioluminescence recording. We first describe the generation of P(Per2)-dLuc reporter lines, and then present data from this and other circadian reporters. In these assays, 3T3 mouse fibroblasts and U2OS human osteosarcoma cells are used as cellular models. We also discuss various ways of using these clock models in circadian studies. Methods described here can be applied to a great variety of cell types to study the cellular and molecular basis of circadian clocks, and may prove useful in tackling problems in other biological systems.

Circadian clocks function within individual cells, i.e., they are cell-autonomous. Here, we describe methods for generating cell-autonomous clock models using non-invasive, luciferase-based real-time bioluminescence technology. Reporter cells provide tractable, functional model systems for studying circadian biology.

ניטור מקצבי Cell-אוטונומי יממת שעון של ביטוי גנים באמצעות כתבי פליטת האור לוציפראז

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

ניתוח של תפקוד תאי בטא באמצעות הדמיה הסידן בתא יחיד ברזולוציה איונים דג זברה

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

חיטוט mRNA קינטיקה בחלל וזמן ב Escherichia קולי באמצעות שני צבעים פלואורסצנטיות מולקולה אחת ב סיטו הכלאה

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...