מיקרו-דגימה בניתוח חלבונים ממוקד מבוסס ספקטרומטריית מסה של חלבונים בעלי שפע נמוך

Summary

מוצג פרוטוקול לקביעת סמנים ביולוגיים בשפע נמוך מדגימות סרום מיובשות שהודגמו עם הסמן הביולוגי פפטיד משחרר פרוגסטרין (ProGRP). חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים משמשים לניקוי והעשרה סלקטיביים של פפטיד ProGRP פרוטאוטיפי. הפפטיד שנלכד מנותח לאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית נוזלית-טנדם.

Abstract

מאמר זה מציג פרוטוקול עם תיאורים מפורטים לניקוי דגימות יעיל של חלבונים בשפע נמוך מדגימות מיובשות. פעולה זו מבוצעת באמצעות פרוטאוליזה מבוססת חרוזים לפני קביעת לכידת זיקה פפטידית פרוטאוטיפית וקביעת ספקטרומטריית מסה טנדם של כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS/MS). ניתן ליישם את ההליך הן על דגימות מיובשות קונבנציונליות באמצעות כרטיסי נייר (למשל, כתמי דם מיובשים [DBSs] וכתמי סרום מיובשים [DSS]), כמו גם על דגימות שנאספו בשיטות דגימה חדשות יותר כגון מיקרו-דגימה סופגת נפח (VAMS). בנוסף לתיאור הליך זה, הכנת חרוזי טריפסין וחרוזים מצופים נוגדנים מוצגת באופן שלב אחר שלב בעבודה זו. היתרונות של ההליך המוצג הם פרוטאוליזה חסכונית בזמן באמצעות חרוזים וניקוי חזק סלקטיבי באמצעות לכידת זיקה פפטידית. ההליך הנוכחי מתאר את קביעת הסמן הביולוגי סרטן ריאות של תאים קטנים (SCLC), פפטיד משחרר פרוגסטרין (ProGRP), בסרום מיובש (הן DSS והן VAMS). נהלים מפורטים להכנת חרוזים מקלים על יישום זרימת העבודה ביישומים חדשים או במעבדות אחרות. הוכח כי התוצאות עשויות להיות תלויות בחומר הדגימה; עבור הפרויקט הנוכחי, נצפו עוצמות אות גבוהות יותר עבור דגימות שנאספו באמצעות VAMS בהשוואה ל- DSS.

Introduction

מיקרו-דגימה קיימת כבר יותר מ-100 שנה מאז שאיוור באנג תיאר ניטור סוכר מ-DBS ב-1913¹. לאחר שגאת'רי וסוזי הציגו DBS בשנת 1963 לקביעת פנילאלנין בתינוקות², הטכניקה הפכה נפוצה יותר ויותר. הדיווחים הראשונים של DBS לדגימה ואחסון של חלבונים נעשו בתחילת שנות השבעים^3,4, ועשור לאחר מכן, בשנות השמונים, מצאנו את הדו"ח הראשון של ספקטרומטריית מסות (MS) לקביעת חלבונים מ- DBS⁵. למרות הקדמה מוקדמת זו, רק לאחר תחילת המאה הפכה קביעת טרשת נפוצה של חלבונים מ- DBS וטכניקות מיקרו-דגימה אחרות לנפוצה יותר.

בהקשר קליני, יש עניין לקבוע חלבונים באבחון ומעקב אחר מחלות, כמו גם למטרות ניטור טיפול וסימום. קביעה ממוקדת זו של אנליטות חלבונים על ידי טרשת נפוצה מכמויות קטנות של דגימות מיובשות עדיין מאתגרת, ולעתים קרובות דורשת הכנת דגימות נרחבת לפני הניתוח.

קביעה כמותית ממוקדת של חלבונים על ידי טרשת נפוצה מבוצעת בדרך כלל על ידי יישום הגישה מלמטה למעלה, עיכול החלבונים לפפטידים לפני הניתוח. הליך זה מייצר מספר עצום של פפטידים, מה שהופך את הניתוח הישיר של הדגימה הביולוגית המעוכלת למאתגר. דרך לעקוף זאת היא ליישם שלב ניקוי זיקה סלקטיבי לפני ניתוח טרשת נפוצה לפני או אחרי העיכול ^6,7,8. בדרך זו, החלבון המעניין (או הפפטיד הפרוטאוטיפי שלו, אם שלב לכידת הזיקה מבוצע לאחר העיכול) מבודד באופן סלקטיבי ממטריצת הדגימה לפני הניתוח, ומספק גבולות זיהוי נמוכים יותר⁹.

למיקרו-דגימה באמצעות כרטיסי DBS יש יתרונות מסוימים בהשוואה לדגימות דם קונבנציונליות, כולל נפח דגימה נמוך, דגימה פחות פולשנית ויציבות אחסון מוגברת. עם זאת, מטריצת הדגימה שונה ויכולה להציג אתגרים אחרים בניתוח (למשל, מטריצת דגימה מיובשת לעומת נוזלית ודם נימי לעומת סרום או פלזמה)^10,11. אתגר נוסף שנצפה עם DBS הוא מה שנקרא אפקט המטוקריט, שבו המטוקריט הדם משפיע על נפח המדגם מעובד עוד יותר לניתוח, ולכן מציג שונות בין-אישית בניתוח¹². יחידות מיקרו-דגימה חדשות יותר, כגון VAMS שהוצגו בשנת 2014¹³, מטפלות בבעיה זו על ידי איסוף נפח קבוע של דם במקום טיפת דם.

פרוטוקול זה מתאר מערך לניתוח סמנים ביולוגיים בשפע נמוך ממיקרו-דגימות מיובשות. לאחר ההדבקה, הדגימה המיובשת מתעכלת, ולאחר מכן, הפפטיד הפרוטאוטיפית מבודד על ידי לכידת זיקה פפטידית. ניתוח המודל הוא הסמן הביולוגי SCLC ProGRP. מכיוון שלא ניתן לקבוע ProGRP באופן אמין מדם שלם, הסרום שימש כמטריצת הדגימה. מוצגות תוצאות מייצגות הן של DSS והן של דגימות סרום שנאספו באמצעות VAMS.