הפרוטוקול שלנו משמעותי מכיוון שהוא מתאר דור של מודלים תלת-ממדיים של תרביות גידול מתאי סרטן ראשוניים, ומודל זה מייצג את הביולוגיה של הגידול בעולם האמיתי טוב יותר מאשר קווי תאים. גישה זו ישימה למגוון גידולים מוצקים. זה גם חסכוני כפי שהוא יכול להתבצע מתחילתו ועד סופו במעבדה ביולוגיה טיפוסית התא.
המודלים התלת-ממדיים של גידולים שנוצרו בגישה זו תומכים במחקר על הרגישות והעמידות של גידולים לטיפולים אנטי-סרטניים או לשילוב של טיפולים. גישה זו מייצרת מודלים תלת-ממדיים מתאי סרטן ראשוניים. לכן, הוא יכול לזהות איזה טיפול עשוי להיות יעיל עבור מטופל מסוים ובכך לעזור להתאים אישית את הטיפול שלו או שלה.
מי שתדגים את ההליך תהיה אלה יצחקי, דוקטורנטית מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, קח בקבוק T25 קטן עם תרבית תאים ראשונית דבק יחיד והסר את מדיית תרבית התא. שטפו את התאים עם PBS, והוסיפו מיליליטר אחד של 1x Accutase למשך שלוש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להכין תרחיף חד-תאי של תרביות תאי גידול ראשוניים דבקים במפגש של 75% עד 100%.
נטרול תמיסת Accutase על ידי הוספת חמישה מיליליטר של מדיום תרבית תאים. שואפים את התאים עם פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר, ומפקידים אותם בצינור חרוטי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינור ב 800 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
הסר את מדיום תרבית התא, והוסף שמונה מיליליטר של מדיום תרבית תאים טרי על גבי גלולת התא, ולאחר מכן ערבב בעדינות. כדי לספור את התאים קיימא עם hemocytometer, לקחת aliquot של 50 מיקרוליטר של השעיית התא ולערבב אותו עם 50 מיקרוליטר של טריפאן כחול. לאחר מכן ספור את התאים החיים וחשב את המספר הכולל של תאים חיים בהשעיה.
לאחר מכן, להכין מדיום תרבות 3D. ולאחר חישוב מספר התאים הדרושים לבדיקה ואת הנפח הכולל הנדרש, להכין השעיית תאים עם מספר התאים הרצוי ב 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית 3D. מערבבים בעדינות עם פיפטה כדי להבטיח פיזור הומוגני.
מעבירים את התרחיף למאגר צנרת, ומוסיפים 200 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל באר של צלחת חיבור 96 בארות נמוכה במיוחד עם פיפטה רב ערוצית. צנטריפוגו את הצלחת ב-300 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאכוף את התקבצות התאים, ובכך לשפר את צבירת התא, ולדגור על הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח של 5% פחמן דו חמצני. לאחר צנטריפוגה שוב ב 300 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, להסיר בעדינות ולהשליך 50% של המדיום, ולהוסיף 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תלת ממדית טרי כדי להחליף את הפתרון הקיים.
חזור על שלב זה, והחזיר את הצלחת לאינקובטור לחות של 37 מעלות צלזיוס ו- 5% פחמן דו חמצני. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ כל יום עד יומיים כדי לעקוב אחר היווצרות הספרואידים. מדוד את קוטר הספרואידים שנוצרו באמצעות כלי קנה המידה בתוכנת ההדמיה.
וברגע שקוטר הספרואיד מגיע ל -100 עד 200 מיקרומטר, בצע את ניסויי יעילות התרופה. לאיסוף ספרואידים, השתמש פיפטה 1, 000 מיקרוליטר כדי לאסוף את הספרואידים מכל באר, והפקיד אותם לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר. צנטריפוגו את הצינור החרוטי ב-300 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ובזהירות שאפו והשליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה.
מוסיפים 0.5 מיליליטר של מדיום תרבית התא, ומשעיפים מחדש את הגלולה היטב אך בעדינות. כדי לבצע ספירה ספרואידית, השתמש בלוח של 96 בארות וצייר סימן פלוס בחלק התחתון של באר כדי לחלק את הבאר לרבעים. מוסיפים 50 מיקרוליטר של התרחיף לבאר.
ועם עדשה אובייקטיבית פי 10, ספרו את הספרואידים ידנית מתחת למיקרוסקופ. ספרו את הספרואידים בכל רביע, וחשבו את המספר הכולל של הספרואידים בבאר. לאחר מכן חשב את ריכוז הספרואידים על ידי הכפלת ספירת הספרואידים על ידי ספירת נפח, וחשב את המספר הכולל של הספרואידים בתרחיף.
בצינור חדש, להכין תרחיף ספרואיד בריכוז של 200 spheroids לכל 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים. עבור כל טיפול תרופתי, להכין את מלאי spheroids בצינור אחר. חשב את הסכום הכולל הדרוש לכל תרופה לפי מספר הבארות הדרושות לחזרות, והוסף את התרופה לצינור לריכוז הסופי הדרוש.
מעבירים 200 מיקרוליטר של תרחיף הספרואיד לבארות של צלחת חיבור נמוכה במיוחד של 96 בארות, ודגרים על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח של 5% פחמן דו חמצני. לאחר הדגירה על הספרואידים עם תרופת המחקר במשך 24 עד 72 שעות, צנטריפוגות את הצלחת ב 300 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ובעדינות להסיר 170 מיקרוליטר של מדיום תרבית התא, משאיר 30 מיקרוליטר בתחתית הבאר. הכינו את תמיסת MTT, והוסיפו 70 מיקרוליטר של התמיסה לכל באר לנפח סופי של 100 מיקרוליטר לבאר.
ריכוז MTT הסופי בבאר יהיה 0.05 מיליגרם לכל 100 מיקרוליטר. בנוסף, להכין בארות ריקות עם פתרון MTT ללא תאים. דוגרים על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח של 5% פחמן דו חמצני למשך שלוש עד ארבע שעות עד שנצפה שינוי בצבע התמיסה בבארות.
כאשר נצפה שינוי, להוסיף 100 מיקרוליטר של פתרון Stop לכל באר, ולערבב בעדינות את התוכן של הבארות מבלי ליצור בועות. קרא את בליעת הלוח בקורא ELISA פרמטר באורך גל של 570 ננומטר ובאורך גל רקע של 630 עד 690 ננומטר. כדי לחשב את כדאיות התא, חשב את האות הספציפי עבור כל באר.
לאחר מכן חשב את הערך הממוצע של הבארות הריקות והפחת ערך זה מכל באר. חשב את הממוצע של האותות הספציפיים בבארות הבקרה המכילות תאים שלא טופלו בתרופת המחקר. לבסוף, לחשב את הכדאיות של תאים בכל באר ביחס לבארות עם תאים לא מטופלים.
היווצרות ספרואידים מתרבית תאי סרטן המעי הגס הראשונית לאורך זמן על ידי מספר תאי הזרע הראשוניים מוצגת כאן. מאיור זה ניתן לראות כי מספר הספרואידים הנוצרים תלוי במספר התאים שנזרעו בתחילה בכל באר. ספרואידים מתאי סרטן המעי הגס הראשוניים לאחר 10 ימים בתרבית עם זריעת תאים ראשונית של 2, 000 לכל באר מוצגים כאן.
לאחר תרבית ממושכת של ספרואידים מסרטן המעי הגס, הם החלו להיצמד זה לזה ויצרו אשכולות של ספרואידים ומבנים דמויי ענבים שמנעו תרבית הומוגנית ולכן אסרו על השימוש בספרואידים בבדיקות MTT. ההשפעות של פלבוציקליב, סוניטיניב, והשילוב שלהם על ספרואידים מתאי גידול ראשוניים, כולל סרטן המעי הגס וסרטן השד, מוצגות כאן. בדיקת MTT בוצעה על ספרואידים שמקורם בתאי סרטן המעי הגס והשד.
אותות MTT נורמלו לערכים מתאים שטופלו ב- DMSO. הערכים מייצגים את האמצעים בין ארבעה לשמונה עותקים משוכפלים. גם השפעות הטיפולים השונים על גדילת התאים הוערכו מיקרוסקופית ביום האפס ולאחר שלושה ימי טיפול בכדורידים שמקורם בסרטן המעי הגס ובתאי סרטן השד.
ההשפעות של trastuzumab בתוספת vinorelbine ו 5 fluorouracil בתוספת cisplatin על spheroids נגזר סרטן השד לאורך זמן מוצגים באיור זה. השינוי בקוטר הספרואידים ביחס ליום האפס על ידי משך הטיפול מוצג כאן. כל קבוצת טיפול כללה ארבע עד שש בארות עם ספרואיד אחד בכל באר.
השינוי הממוצע מוצג כאן. ספרואידים הם כלים חשובים למחקרים רבים מעבר לתגובה לטיפול אנטי סרטני. מחקרים אלה עוסקים, למשל, בהעברת תרופות ואפילו בשאלות ביולוגיות בסיסיות כגון אינטראקציות בין תאים לתאים.
זה קריטי להתחיל תהליך דור spheroid עם השעיה תא יחיד. כמו כן, קריטי להשתמש בלוחות חיבור נמוכים במיוחד עם מדיום המכיל 5% מדדי ממברנה בסיסיים.
