Nosso protocolo é significativo porque descreve uma geração de modelos de cultura tumoral 3D a partir de células cancerosas primárias, e este modelo representa melhor a biologia tumoral do mundo real do que as linhagens celulares. Esta abordagem é aplicável a uma variedade de tumores sólidos. Também é custo-efetivo, pois pode ser realizado do início ao fim em um laboratório típico de biologia celular.
Os modelos tumorais 3D gerados usando esta abordagem apoiam a pesquisa sobre a sensibilidade e resistência dos tumores a terapias anti-câncer ou a uma combinação de terapias. Esta abordagem gera modelos 3D a partir de células cancerosas primárias. Portanto, poderia identificar qual terapia é provável de ser eficaz para um determinado paciente e, assim, ajudar a personalizar seu tratamento.
Quem demonstrará o procedimento será Ella Itzhaki, aluna de doutorado do meu laboratório. Para começar, pegue um pequeno frasco T25 com uma cultura de células primárias aderente de célula única e remova o meio de cultura celular. Lave as células com PBS e adicione um mililitro de 1x Accutase por três minutos a 37 graus Celsius para preparar uma suspensão de célula única de culturas de células tumorais primárias aderentes de 75 a 100% de confluência.
Neutralizar a solução de Accutase adicionando cinco mililitros de meio de cultura celular. Aspirar as células com uma pipeta sorológica de 10 mililitros e depositá-las em um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar o tubo a 800g durante cinco minutos à temperatura ambiente.
Retire o meio de cultura celular e adicione oito mililitros de meio de cultura de células frescas em cima do pellet de células e, em seguida, misture suavemente. Para contar as células viáveis com um hemocitômetro, pegue uma alíquota de 50 microlitros da suspensão celular e misture com 50 microlitros de azul de tripano. Em seguida, conte as células vivas e calcule o número total de células vivas na suspensão.
Em seguida, prepare o meio de cultura 3D. E após calcular o número de células necessárias para o ensaio e o volume total necessário, preparar a suspensão celular com o número desejado de células em 200 microlitros do meio de cultura 3D. Misture suavemente com a pipeta para garantir uma distribuição homogénea.
Transfira a suspensão para um reservatório de pipetagem e adicione 200 microlitros da suspensão celular a cada poço de uma placa de 96 poços de fixação ultrabaixa com uma pipeta multicanal. Centrifugar a placa a 300g durante 10 minutos à temperatura ambiente para reforçar o agrupamento das células, melhorando assim a agregação celular, e incubar a placa a 37 graus Celsius numa incubadora humidificada com dióxido de carbono a 5%. Depois de centrifugar novamente a 300g por 10 minutos à temperatura ambiente, remova e descarte suavemente 50% do meio e adicione 100 microlitros de meio de cultura 3D fresco para substituir a solução existente.
Repita este passo e coloque a placa de volta na incubadora umidificada de 37 graus Celsius e dióxido de carbono a 5%. Inspecione as células ao microscópio a cada um a dois dias para monitorar a formação esferoide. Meça o diâmetro dos esferoides formados usando a ferramenta de escala no software de imagem.
E quando o diâmetro do esferoide atingir 100 a 200 micrômetros, realize os experimentos de eficácia do medicamento. Para a coleta de esferoides, use uma pipeta de 1.000 microlitros para coletar os esferoides de cada poço e deposite-os em um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar o tubo cônico a 300g por cinco minutos à temperatura ambiente e aspirar e descartar cuidadosamente o sobrenadante com pipeta.
Adicione 0,5 mililitros do meio de cultura celular e ressuspenda bem o pellet, mas suavemente. Para realizar a contagem esferoide, use uma placa de 96 poços e desenhe um sinal de mais na parte inferior de um poço para dividir o poço em quadrantes. Adicione 50 microlitros da suspensão ao poço.
E com uma lente objetiva de 10x, conte os esferoides manualmente sob o microscópio. Conte os esferoides em cada quadrante e calcule o número total de esferoides no poço. Em seguida, calcule a concentração de esferoides dobrando a contagem de esferoides contando o volume e calcule o número total de esferoides na suspensão.
Em um novo tubo, preparar a suspensão esferoide a uma concentração de 200 esferoides por 200 microlitros de meio de cultura celular. Para cada tratamento medicamentoso, prepare o estoque de esferoides em um tubo diferente. Calcule a quantidade total necessária para cada droga pelo número de poços necessários para repetições e adicione o fármaco ao tubo até a concentração final necessária.
Transfira 200 microlitros da suspensão esferoide para os poços de uma placa de 96 poços de fixação ultrabaixa e incube a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com dióxido de carbono a 5%. Depois de incubar os esferoides com a droga do estudo por 24 a 72 horas, centrifugar a placa a 300g por cinco minutos à temperatura ambiente e remover suavemente 170 microlitros do meio de cultura celular, deixando 30 microlitros no fundo do poço. Prepare a solução MTT e adicione 70 microlitros da solução a cada poço para um volume final de 100 microlitros por poço.
A concentração final de MTT no poço será de 0,05 miligramas por 100 microlitros. Além disso, prepare poços em branco com solução de MTT sem células. Incubar a placa a 37 graus Celsius em uma estufa umidificada com dióxido de carbono a 5% por três a quatro horas até que uma mudança na cor da solução nos poços seja observada.
Quando uma mudança for observada, adicione 100 microlitros de solução Stop a cada poço e misture suavemente o conteúdo dos poços sem criar bolhas. Leia a absorbância da placa em um leitor ELISA de parâmetro em um comprimento de onda de 570 nanômetros e um comprimento de onda de fundo de 630 a 690 nanômetros. Para calcular a viabilidade celular, calcule o sinal específico para cada poço.
Em seguida, calcule o valor médio dos poços em branco e subtraia esse valor de cada poço. Calcular a média dos sinais específicos nos poços de controle que contêm células que não foram tratadas com o medicamento do estudo. Finalmente, calcular a viabilidade das células em cada poço em relação aos poços com células não tratadas.
A formação de esferoides a partir de uma cultura primária de células de câncer de cólon ao longo do tempo pelo número de células inicialmente semeadas é mostrada aqui. A partir desta figura, pode-se observar que o número de esferoides gerados depende do número de células inicialmente semeadas em cada poço. Esferoides das células primárias de câncer de cólon após 10 dias em cultura com semeadura inicial de 2.000 células por poço são mostrados aqui.
Após a cultura prolongada dos esferoides do câncer de cólon, eles começaram a se ligar uns aos outros e formaram aglomerados de esferoides e estruturas semelhantes a uvas que impediram uma cultura homogênea e, portanto, proibiram o uso dos esferoides nos ensaios de MTT. Os efeitos do palbociclib, sunitinibe e sua combinação em esferoides de células tumorais primárias, incluindo câncer de cólon e mama, são mostrados aqui. Um ensaio de MTT foi conduzido em esferoides derivados de células de câncer de cólon e mama.
Os sinais MTT foram normalizados para valores de células tratadas com DMSO. Os valores representam as médias de quatro a oito repetições. Os efeitos dos diversos tratamentos sobre o crescimento celular também foram avaliados microscopicamente no dia zero e após três dias de tratamento dos esferoides derivados de células de câncer de cólon e câncer de mama.
Os efeitos do trastuzumabe mais vinorelbina e 5 fluorouracila mais cisplatina sobre esferoides derivados do câncer de mama ao longo do tempo são apresentados nesta figura. A mudança no diâmetro dos esferoides em relação ao dia zero pela duração do tratamento é mostrada aqui. Cada grupo de tratamento incluiu de quatro a seis poços com um esferoide em cada poço.
A variação média é apresentada aqui. Os esferoides são ferramentas importantes para muitos estudos além da resposta ao tratamento anticâncer. Esses estudos abordam, por exemplo, a liberação de fármacos e até mesmo questões básicas de biologia, como interações célula-célula.
É fundamental iniciar um processo de geração de esferoides com uma suspensão de célula única. Também é fundamental usar placas de fixação ultrabaixas com um meio contendo uma métrica de membrana básica de 5%.
