私たちのプロトコルは、初代がん細胞からの3D腫瘍培養モデルの生成を記述し、このモデルは細胞株よりも実際の腫瘍生物学をよりよく表しているため、重要です。このアプローチは、さまざまな固形腫瘍に適用できます。また、典型的な細胞生物学ラボで最初から最後まで実行できるため、費用対効果も高くなります。
このアプローチを使用して生成された3D腫瘍モデルは、抗がん療法または治療法の組み合わせに対する腫瘍の感受性と耐性に関する研究をサポートします。このアプローチでは、初代がん細胞から3Dモデルを生成します。したがって、どの治療法が特定の患者に効果的である可能性が高いかを特定し、彼または彼女の治療をパーソナライズするのに役立ちます。
手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるエラ・イツァキです。まず、シングルセル接着初代細胞培養液を入れた小さなT25フラスコを取り、細胞培養培地を取り除きます。細胞をPBSで洗浄し、1ミリリットルの1xアキュターゼを摂氏37度で3分間添加して、75〜100%コンフルエンスの付着性初代腫瘍細胞培養物の単一細胞懸濁液を調製します。
5ミリリットルの細胞培養培地を加えてアキュターゼ溶液を中和します。細胞を10ミリリットルの血清学的ピペットで吸引し、15ミリリットルの円錐形チューブに入れます。チューブを800gで室温で5分間遠心分離します。
細胞培養培地を取り出し、細胞ペレットの上に8ミリリットルの新鮮な細胞培養培地を加え、穏やかに混合します。血球計算盤で生細胞をカウントするには、50マイクロリットルの細胞懸濁液のアリコートを取り、それを50マイクロリットルのトリパンブルーと混合します。次いで生細胞をカウントし、懸濁液中の生細胞の総数を計算する。
次に、3D培地を調製します。そしてアッセイに必要な細胞数と必要な総量を計算した後、200マイクロリットルの3D培養液に所望の細胞数で細胞懸濁液を調製します。ピペットで穏やかに混合して、均一な分布を確保します。
懸濁液をピペッティングリザーバーに移し、マルチチャンネルピペットを備えた超低アタッチメント96ウェルプレートの各ウェルに200マイクロリットルの細胞懸濁液を追加します。プレートを室温で300gで10分間遠心分離して細胞のクラスター化を強化し、それによって細胞凝集を改善し、5%二酸化炭素加湿インキュベーター内でプレートを摂氏37度でインキュベートします。室温で300gで10分間再度遠心分離した後、50%の培地を静かに取り出して廃棄し、100マイクロリットルの新鮮な3D培養培地を加えて既存の溶液を置き換えます。
この手順を繰り返し、プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%加湿インキュベーターに戻します。顕微鏡で細胞を1〜2日ごとに検査して、スフェロイド形成を監視します。イメージングソフトウェアのスケールツールを使用して形成されたスフェロイドの直径を測定します。
そして、スフェロイドの直径が100〜200マイクロメートルに達したら、薬効実験を行います。スフェロイド採取の場合は、1, 000マイクロリットルのピペットを使用して各ウェルからスフェロイドを収集し、それらを15ミリリットルの円錐形チューブに入れます。コニカルチューブを室温で300gで5分間遠心分離し、ピペットを使用して上清を注意深く吸引して廃棄します。
0.5ミリリットルの細胞培養培地を加え、ペレットをよく、しかし穏やかに再懸濁します。回転楕円体カウントを実行するには、96ウェルプレートを使用し、ウェルの下側にプラス記号を描画して、ウェルを象限に分割します。50マイクロリットルの懸濁液をウェルに加える。
また、10倍の対物レンズを使用して、顕微鏡下で手動でスフェロイドを数えます。各象限のスフェロイドを数え、ウェル内のスフェロイドの総数を計算します。次に、体積をカウントしてスフェロイド数を2倍にしてスフェロイド濃度を計算し、懸濁液中のスフェロイドの総数を計算します。
新しいチューブで、細胞培養培地200マイクロリットルあたり200スフェロイドの濃度でスフェロイド懸濁液を調製します。薬物治療ごとに、異なるチューブにスフェロイドのストックを準備します。リピートに必要なウェルの数で各薬剤に必要な総量を計算し、必要な最終濃度まで薬剤をチューブに追加します。
200マイクロリットルのスフェロイド懸濁液を超低付着96ウェルプレートのウェルに移し、5%二酸化炭素加湿インキュベーター内でプレートを摂氏37度でインキュベートします。スフェロイドを治験薬と一緒に24〜72時間インキュベートした後、プレートを300gで室温で5分間遠心分離し、170マイクロリットルの細胞培養培地を静かに取り除き、ウェルの底に30マイクロリットルを残します。MTT溶液を調製し、各ウェルに70マイクロリットルの溶液をウェル当たり100マイクロリットルの最終容量まで添加する。
ウェル内の最終的なMTT濃度は、100マイクロリットルあたり0.05ミリグラムになります。さらに、細胞を含まないMTT溶液でブランクウェルを調製します。ウェル内の溶液の色の変化が観察されるまで、5%二酸化炭素加湿インキュベーター内でプレートを摂氏37度で3〜4時間インキュベートします。
変化が観察されたら、各ウェルに100マイクロリットルのStop溶液を加え、気泡を発生させずにウェルの内容物を穏やかに混合します。パラメータELISAリーダーで、波長570ナノメートルおよび背景波長630〜690ナノメートルでのプレートの吸光度を読み取ります。細胞生存率を計算するには、各ウェルの特異的シグナルを計算します。
次に、ブランクウェルの平均値を計算し、各ウェルからこの値を差し引きます。治験薬で処理されなかった細胞を含むコントロールウェルの特異的シグナルの平均を計算します。最後に、未処理の細胞を含むウェルに対する各ウェルの細胞の生存率を計算します。
ここでは、初代結腸癌細胞培養物からのスフェロイドの形成を、最初に播種した細胞の数によって経時的に示します。この図から、生成されるスフェロイドの数は、各ウェルに最初に播種された細胞の数に依存することがわかる。1ウェル当たり2, 000の初期細胞播種による培養10日後の初代結腸癌細胞からのスフェロイドをここに示す。
結腸癌スフェロイドを長期間培養すると、それらは互いに付着し始め、スフェロイドとブドウ様構造のクラスターを形成し、均質な培養を妨げ、MTTアッセイでのスフェロイドの使用を禁止しました。結腸がんおよび乳がんを含む原発性腫瘍細胞由来のスフェロイドに対するパルボシクリブ、スニチニブ、およびそれらの組み合わせの効果をここに示します。MTTアッセイは、結腸および乳癌細胞に由来するスフェロイドに対して実施されました。
MTTシグナルをDMSO処理細胞からの値に正規化した。値は、4回から8回の反復の平均を表します。細胞増殖に対する様々な処理の効果も、結腸癌および乳癌細胞に由来するスフェロイドの0日目および3日間の治療後に顕微鏡で評価された。
乳がん由来のスフェロイドに対するトラスツズマブとビノレルビンの併用および5つのフルオロウラシルとシスプラチンの経時的な効果をこの図に示します。治療期間によるゼロ日目に対するスフェロイドの直径の変化をここに示す。各治療群には、各ウェルに1つのスフェロイドを有する4〜6つのウェルが含まれていた。
ここでは、平均的な変化を示します。スフェロイドは、抗がん治療への反応を超えた多くの研究にとって重要なツールです。これらの研究は、例えば、薬物送達や、細胞間相互作用などの基本的な生物学の問題にも取り組んでいます。
単一細胞懸濁液でスフェロイド生成プロセスを開始することが重要です。また、5%の基本的な膜メトリックを含む培地で超低接着プレートを使用することも重要です。
