פרוטוקול זה מתאר השתלה אורתוטופית של תאים סרטניים שמקורם בחולה בדופן הצקום של עכברים מדוכאי חיסון. מודל זה משחזר מחלה גרורתית מתקדמת של סרטן המעי הגס. המודל האורתוטופי של סרטן המעי הגס המוצג כאן משחזר את התרחיש הקליני של גידולי מעי מתקדמים ומחלה גרורתית בחולי סרטן המעי הגס שלא ניתן לחקור באמצעות אורגנואידים שמקורם בחולה או מודלים של קסנוגרפט שמקורם בחולה.
מעכבר שעבר המתת חסד, חלצו את הגידול על ידי הסרתו בזהירות מהעור ומהרקמה הלא-גידולית שמסביב באמצעות מספריים ומלקחיים. מניחים את הגידולים שנקטפו ב- PBS בארבע מעלות צלזיוס. בעזרת להב, מנתקים את הגידולים בצלחת תרבית של 10 ס"מ המכילה מילימטר אחד של תווך.
מניחים את הדגימה ההומוגנית המנותקת לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף את המדיום לנפח סופי של חמישה מיליליטר. לאחר מכן, מוסיפים את מדיום העיכול לצינור.
הניחו את הצינור במיקום של 45 מעלות בתוך אינקובטור של תרבית תאים למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. במהלך הדגירה של שעה, מערבבים את התמיסה כל 15 דקות עם פיפטה של חמישה מיליליטר. לאחר הדגירה, מוסיפים חמישה מיליליטר של בינוני ומערבבים היטב.
לאחר מכן, מיין את התמיסה עם מסננת תאים 100 מיקרומטר באמצעות צינור סטרילי 50 מיליליטר. צנטריפוגה את התאים ממוינים ב 500 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה בשלושה מיליליטר של תמיסת חיץ ליזיס 1x RBC.
יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מוסיפים שלושה מיליליטר של בינוני ומערבבים את המדגם. צנטריפוגה במשקל 500 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ושאפו את הסופרנטנט.
להשעות מחדש את הגלולה עם חמישה עד 10 מיליליטר של בינוני, ולהשתמש מונה התא כדי לחשב את המספר הכולל של תאים. לאחר צנטריפוגה של התאים ב 500 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, resuspend ב 10 מיליליטר של PBS. חזור על הצנטריפוגה ושטוף עם 10 מיליליטר של PBS.
להשעות מחדש את הגלולה כדי לקבל ריכוז של 20 פעמים 10 לשישה תאים למיליליטר ולערבב היטב כדי לקבל השעיית תאים הומוגנית. לאחר מכן, להכין מזרק 29g להזרקת cecum. יש להעמיס 50 מיקרוליטר של תרחיף תאי הגידול לתוך המזרק, ולוודא שלא נשארות בועות אוויר במזרק.
מניחים את המזרק על קרח. ראשית, לעקר את אתר הניתוח על ידי ריסוס עם חומר ניקוי חיטוי וניגוב. לאחר מכן, depilate את הבטן באמצעות מכשיר להסרת שיער עכבר.
מניחים את העכבר במצב שכיבה ומחטאים את הבטן על ידי קרצוף עם chlorhexidine או povidone-יוד. בצע חתך אורכי של סנטימטר אחד מעל הבטן התחתונה באמצעות מספריים לניתוח. יש להפריד בזהירות את העור לצדדים כדי לחשוף את הצפק.
לאחר מכן, בצע חתך של 0.5 עד 1 סנטימטר בקרום הצפק, מספיק כדי להוציא את הצקום. באמצעות גזה סטרילית לחתוך מראש, בזהירות לבודד את cecum מן העכבר. להרטיב את cecum היה תמיסת מלח לאורך כל ההליך.
לשתק את הצקום על ידי החזקתו בזהירות עם מלקחיים, ולאחר מכן להכניס את המחט באופן שטחי לתוך קיר cecum. לאט, להזריק את כל נפח 50 מיקרוליטר של השעיית תאי הגידול. תהליך זה אורך כ-10 שניות.
לאחר ההזרקה, הסר באיטיות את המחט מהצקום והפעל לחץ עדין על אתר ההזרקה באמצעות מוליך קצה כותנה. נקו את הצקום בתמיסת מלח כדי להסיר את כל הלכלוך ולהחזיר את הצקום חזרה לבטן החיה. סגור את הצפק באמצעות תפרים 5/0 ולאחר מכן סגור את עור הבטן באמצעות תפרים 5/0.
גידולי CRC-PDX אורתוטופיים נצפו במעי של עכברים שהושתלו בהם תאים סרטניים שמקורם בחולה. ניתוח היסטולוגי על ידי hematoxylin ו eosin כתמים על cecum הראה נוכחות של תאים סרטניים. הניתוח ההיסטולוגי גילה גם גרורות ריאה וגרורות בכבד בעכברים המושתלים.
עכברים שנשאו גידולים אורתוטופיים טופלו ברכב, בתרופה לבדיקה או בתרופה הכימותרפית אירינוטקן. ניתוח תמונות סריקת מיקרו CT הראה כי בהשוואה לרכב, תרופת הבדיקה גרמה לירידה בנפח הגידול, אשר הופחת עוד יותר בשילוב עם טיפול באירינוטקן. מודל זה יסייע לחקור את הביולוגיה של הגרורות בגידולי סרטן המעי הגס.
