Этот протокол описывает ортотопическую имплантацию раковых клеток пациента в стенку слепой кишки мышей с иммунодефицитом. Эта модель повторяет метастатическое заболевание колоректального рака на поздних стадиях. Представленная здесь модель ортотопического колоректального рака повторяет клинический сценарий распространенных опухолей кишечника и метастатических заболеваний у пациентов с колоректальным раком, которые не могут быть изучены с использованием органоидов, полученных от пациентов, или моделей ксенотрансплантатов, полученных от пациентов.
У усыпленной мыши извлеките опухоль, осторожно удалив ее с кожи и окружающих неопухолевой ткани с помощью ножниц и щипцов. Поместите собранные опухоли в PBS при температуре четыре градуса по Цельсию. С помощью лезвия диссоциируют опухоли в 10-сантиметровой культуральной планшете, содержащей один миллиметр среды.
Поместите однородный диссоциированный образец в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Затем добавьте средство до конечного объема в пять миллилитров. Затем добавьте среду для сбраживания в трубку.
Поместите пробирку под углом 45 градусов внутрь инкубатора для клеточных культур на один час при температуре 37 градусов по Цельсию. В течение часовой инкубации каждые 15 минут перемешивайте раствор пятимиллилитровой пипеткой. После инкубации добавить пять миллилитров средства и хорошо перемешать.
Затем отсортируйте раствор с помощью 100-микрометрового клеточного ситечка с помощью стерильной пробирки объемом 50 миллилитров. Центрифугируйте отсортированные клетки при 500 г в течение 10 минут при комнатной температуре. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в трех миллилитрах 1x раствора RBC Lysis Buffer.
Выдерживать 10 минут при комнатной температуре. Затем добавьте три миллилитра средства и перемешайте образец. Центрифугу при 500 г в течение 10 минут при комнатной температуре и аспирировать надосадочную жидкость.
Повторно суспендируйте гранулу с пятью-10 миллилитрами среды и используйте счетчик клеток, чтобы рассчитать общее количество клеток. После центрифугирования клеток при 500 г в течение 10 минут при комнатной температуре ресуспендировать в 10 миллилитрах PBS. Повторите центрифугирование и промойте 10 миллилитрами PBS.
Ресуспендируйте гранулу до получения концентрации 20 раз по 10 до шести клеток на миллилитр и хорошо перемешайте до получения однородной клеточной суспензии. Далее подготовьте шприц 29 г для инъекции слепой кишки. Загрузите в шприц 50 микролитров суспензии опухолевых клеток и следите за тем, чтобы в шприце не оставалось пузырьков воздуха.
Поместите шприц на лед. Сначала простерилизуйте место операции, опрыскав дезинфицирующим моющим средством и протирая. Затем проведите депиляцию живота с помощью аппарата для удаления волос мышью.
Поместите мышь в положение лежа на спине и продезинфицируйте брюшную полость, протерев хлоргексидином или повидон-йодом. Сделайте сантиметровый продольный разрез над нижней частью живота с помощью хирургических ножниц. Осторожно отделите кожу в стороны, чтобы обнажить брюшину.
Затем делают разрез на мембране брюшины от 0,5 до одного сантиметра, достаточный для экстериоризации слепой кишки. Используя предварительно нарезанную стерильную марлю, тщательно изолируйте слепую кишку от мыши. Смачивайте слепую кишку физиологическим раствором на протяжении всей процедуры.
Иммобилизуйте слепую кишку, осторожно удерживая ее щипцами, затем введите иглу поверхностно в стенку слепой кишки. Медленно вводят весь 50 микролитровый объем суспензии опухолевых клеток. Этот процесс занимает около 10 секунд.
После инъекции медленно извлеките иглу из слепой кишки и слегка надавите на место инъекции аппликатором с ватным наконечником. Очистите слепую кишку солевым раствором, чтобы удалить мусор и вернуть слепую кишку обратно в брюшную полость животного. Закройте брюшину швами 5/0, а затем закройте кожу живота швами 5/0.
Ортотопические опухоли CRC-PDX наблюдались в кишечнике мышей, имплантированных раковыми клетками, полученными от пациентов. Гистологический анализ методом окрашивания гематоксилином и эозином на слепой кишке показал наличие опухолевых клеток. Гистологический анализ также выявил метастазы в легкие и печень у имплантированных мышей.
Мышей с ортотопическими опухолями лечили либо транспортным средством, либо тестируемым препаратом, либо химиотерапевтическим препаратом иринотеканом. Анализ изображений микрокомпьютерной томографии показал, что по сравнению с транспортным средством тестируемый препарат индуцировал уменьшение объема опухоли, который был дополнительно уменьшен в сочетании с лечением иринотеканом. Эта модель поможет изучить биологию метастазирования в опухолях колоректального рака.
