Bu protokol, immün yetmezliği olan farelerin çekum duvarına hasta kaynaklı kanser hücrelerinin ortotopik implantasyonunu açıklar. Bu model, ilerlemiş kolorektal kanser metastatik hastalığını özetlemektedir. Burada sunulan ortotopik kolorektal kanser modeli, kolorektal kanser hastalarında ileri bağırsak tümörleri ve metastatik hastalığın klinik senaryosunu özetlemektedir ve hasta kaynaklı organoidler veya hasta kaynaklı ksenogreft modelleri kullanılarak çalışılamamaktadır.
Ötenazi uygulanmış bir fareden, makas ve forseps kullanarak tümörü deriden ve çevresindeki tümör olmayan dokudan dikkatlice çıkararak çıkarın. Hasat edilen tümörleri dört santigrat derecede PBS'ye yerleştirin. Bir bıçak kullanarak, tümörleri bir milimetre ortam içeren 10 santimetrelik bir kültür plakasında ayırın.
Homojen ayrışmış numuneyi 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. Ardından, ortamı beş mililitrelik son hacme ekleyin. Ardından, sindirim ortamını tüpe ekleyin.
Tüpü, 37 santigrat derecede bir saat boyunca bir hücre kültürü inkübatörünün içine 45 derecelik bir konuma yerleştirin. Bir saatlik inkübasyon sırasında, çözeltiyi her 15 dakikada bir beş mililitrelik bir pipetle karıştırın. İnkübasyondan sonra, beş mililitre orta ekleyin ve iyice karıştırın.
Ardından, çözeltiyi steril 50 mililitrelik bir tüp kullanarak 100 mikrometrelik bir hücre süzgeci ile sıralayın. Sıralanan hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve peleti üç mililitre 1x RBC Lizis Tampon çözeltisinde yeniden süspanse edin.
Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Ardından, üç mililitre orta ekleyin ve numuneyi karıştırın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 g'da santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin.
Peleti beş ila 10 mililitre ortamla yeniden süspanse edin ve toplam hücre sayısını hesaplamak için bir hücre sayacı kullanın. Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 g'da santrifüjledikten sonra, 10 mililitre PBS'de tekrar süspanse edin. Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve 10 mililitre PBS ile yıkayın.
Mililitrede altı hücreye 20 kez 10 ila altı hücrelik bir konsantrasyon elde etmek için peleti yeniden süspanse edin ve homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için iyice karıştırın. Ardından, çekum enjeksiyonu için 29 g'lık bir şırınga hazırlayın. Şırıngaya 50 mikrolitre tümör hücresi süspansiyonu yükleyin ve şırıngada hava kabarcığı kalmadığından emin olun.
Şırıngayı buzun üzerine yerleştirin. İlk olarak, dezenfekte edici deterjan püskürterek ve silerek ameliyat bölgesini sterilize edin. Ardından, bir fare epilasyon makinesi kullanarak karnı epilasyon yapın.
Fareyi sırtüstü pozisyona getirin ve klorheksidin veya povidon-iyot ile ovalayarak karnı dezenfekte edin. Ameliyat makası kullanarak alt karın üzerinde bir santimetre uzunlamasına kesi yapın. Peritonu ortaya çıkarmak için cildi dikkatlice yanlara ayırın.
Ardından, periton zarında çekumu dışlamak için yeterli olan 0,5 ila bir santimetrelik bir kesi yapın. Önceden kesilmiş steril bir gazlı bez kullanarak, çekumu fareden dikkatlice izole edin. Prosedür boyunca çekumu nemlendirin, tuzlu su çözeltisiydi.
Cecumu forseps ile dikkatlice tutarak hareketsiz hale getirin, ardından iğneyi yüzeysel olarak çekum duvarına sokun. Yavaşça, 50 mikrolitrelik tümör hücresi süspansiyonunun tamamını enjekte edin. Bu işlem yaklaşık 10 saniye sürer.
Enjeksiyondan sonra, iğneyi çekumdan yavaşça çıkarın ve pamuk uçlu bir aplikatör ile enjeksiyon bölgesine hafif bir baskı uygulayın. Herhangi bir kalıntıyı gidermek ve çekumu hayvanın karnına geri döndürmek için çekumu tuzlu su çözeltisiyle temizleyin. 5/0 dikişler kullanarak karın zarını kapatın ve ardından 5/0 dikişler kullanarak karın derisini kapatın.
Hasta kaynaklı kanser hücreleri implante edilen farelerin bağırsağında ortotopik CRC-PDX tümörleri gözlendi. Çekumda hematoksilen ve eozin boyaması ile yapılan histolojik analiz, tümör hücrelerinin varlığını gösterdi. Histolojik analiz ayrıca implante edilen farelerde akciğer metastazı ve karaciğer metastazı ortaya çıkardı.
Ortotopik tümör taşıyan fareler, araç, test ilacı veya kemoterapi ilacı irinotekan ile tedavi edildi. Mikro BT tarama görüntülerinin analizi, araçla karşılaştırıldığında, test ilacının tümör hacminde bir azalmaya neden olduğunu ve bunun irinotekan tedavisi ile kombinasyon halinde daha da azaldığını gösterdi. Bu model, kolorektal kanser tümörlerinde metastazın biyolojisini incelemeye yardımcı olacaktır.
