Este protocolo describe la implantación ortotópica de células cancerosas derivadas del paciente en la pared del ciego de ratones inmunodeficientes. Este modelo recapitula la enfermedad metastásica del cáncer colorrectal avanzado. El modelo ortotópico de cáncer colorrectal que se presenta aquí recapitula el escenario clínico de tumores intestinales avanzados y enfermedad metastásica en pacientes con cáncer colorrectal que no se pueden estudiar utilizando organoides derivados del paciente o modelos de xenoinjertos derivados del paciente.
De un ratón sacrificado, extrae el tumor extirpándolo cuidadosamente de la piel y del tejido circundante no tumoral con tijeras y fórceps. Coloque los tumores extraídos en PBS a cuatro grados centígrados. Con una cuchilla, disocie los tumores en una placa de cultivo de 10 centímetros que contenga un milímetro de medio.
Coloque la muestra disociada homogénea en un tubo cónico de 15 mililitros. Luego, agregue el medio hasta un volumen final de cinco mililitros. Luego, agregue el medio de digestión al tubo.
Coloque el tubo en una posición de 45 grados dentro de una incubadora de cultivo celular durante una hora a 37 grados centígrados. Durante la incubación de una hora, mezcle la solución cada 15 minutos con una pipeta de cinco mililitros. Después de la incubación, agregue cinco mililitros de medio y mezcle bien.
Luego, clasifique la solución con un filtro celular de 100 micrómetros usando un tubo estéril de 50 mililitros. Centrifugar las celdas clasificadas a 500 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en tres mililitros de 1 solución tampón de lisis RBC.
Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego, agregue tres mililitros de medio y mezcle la muestra. Centrifugar a 500 g durante 10 minutos a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante.
Vuelva a suspender el gránulo con cinco a 10 mililitros de medio y use un contador de celdas para calcular el número total de celdas. Después de centrifugar las células a 500 g durante 10 minutos a temperatura ambiente, vuelva a suspender en 10 mililitros de PBS. Repetir la centrifugación y lavar con 10 mililitros de PBS.
Resuspender el pellet para obtener una concentración de 20 veces 10 a las seis células por mililitro y mezclar bien para obtener una suspensión celular homogénea. A continuación, prepare una jeringa de 29 g para la inyección de ciego. Cargue 50 microlitros de la suspensión de células tumorales en la jeringa y asegúrese de que no queden burbujas de aire en la jeringa.
Coloque la jeringa sobre hielo. Primero, esterilice el sitio quirúrgico rociando con detergente desinfectante y limpiando. Luego, depila el abdomen con una máquina de depilación de ratón.
Coloque al ratón en posición supina y desinfecte el abdomen frotándolo con clorhexidina o povidona yodada. Haga una incisión longitudinal de un centímetro sobre la parte inferior del abdomen con unas tijeras quirúrgicas. Separe cuidadosamente la piel a los lados para exponer el peritoneo.
Luego, haga una incisión de 0,5 a un centímetro en la membrana del peritoneo, suficiente para exteriorizar el ciego. Con una gasa estéril precortada, aísle cuidadosamente el ciego del ratón. Humedecer el ciego con solución salina durante todo el procedimiento.
Inmovilice el ciego sosteniéndolo cuidadosamente con fórceps, luego introduzca la aguja superficialmente en la pared del ciego. Lentamente, inyecte todo el volumen de 50 microlitros de suspensión de células tumorales. Este proceso tarda unos 10 segundos.
Después de la inyección, retire lentamente la aguja del ciego y aplique una presión suave en el lugar de la inyección con un aplicador de punta de algodón. Limpie el ciego con solución salina para eliminar cualquier residuo y devuelva el ciego al abdomen del animal. Cerrar el peritoneo con suturas 5/0 y luego cerrar la piel del abdomen con suturas 5/0.
Se observaron tumores ortotópicos de CCR-PDX en el intestino de ratones a los que se les implantaron células cancerosas derivadas de pacientes. El análisis histológico mediante tinción de hematoxilina y eosina en el ciego mostró la presencia de células tumorales. El análisis histológico también reveló metástasis pulmonares y metástasis hepáticas en los ratones implantados.
Los ratones portadores de tumores ortotópicos se trataron con el vehículo, el fármaco de prueba o el fármaco quimioterapéutico irinotecán. El análisis de las imágenes de microtomografía computarizada mostró que, en comparación con el vehículo, el fármaco de prueba indujo una reducción del volumen tumoral, que se redujo aún más en combinación con el tratamiento con irinotecán. Este modelo ayudará a estudiar la biología de la metástasis en tumores de cáncer colorrectal.
