הפרוטוקול שלנו מספק דרך לדמיין את התגובה העצבית ללחץ מכני בעכבר חי, אשר יכולה לספק ראיות ישירות לאופן שבו פגיעה מוחית טראומטית משפיעה על המוח. טכניקה זו יכולה לנטר את חלבון המטרה באותו מיקום במוח באותה חיה הן בשלב החריף והן בשלב הכרוני לאחר פגיעה מוחית טראומטית. הגן המעניין ומקדם הנגיף יכולים להשתנות בהתאם כדי לחקור חלבונים אחרים בסוגי התאים הספציפיים במוח.
כדי להתחיל, להחיל משחה אופתלמית על העיניים של העכבר מורדם. הסר את השיער מהחלק העליון של הראש על ידי חיתוך עם מספריים רגילים. לאחר קביעת חתך בקו האמצע באורך 12 עד 15 מילימטרים, יש לכרות את העור מעל האונה השמאלית והימנית של הגולגולת באמצעות מספריים קפיציים מעוקלים.
לאחר חשיפת הגולגולת, הסירו את הפריאוסטאום על ידי שפשוף עדין עם המוליך הסטרילי מכותנה, ושטיפתו במי מלח סטריליים. לאחר ייבוש אזור הגולגולת, סמנו את אזור הפגיעה המוחית הטראומטית, או TBI, בקואורדינטות 2.5 מילימטרים אחוריים לברגמה ושני מילימטרים רוחביים מתפר הקשת מימין. הסר במהירות את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית והנח את הראש על כרית החיץ מתחת להתקן TBI.
ישר את קצה המשפיע לאתר ההשפעה המסומן. הרימו את עמוד המתכת על ידי משיכת חוט הניילון הקשור 15 סנטימטרים מעל ראש העכבר, ואז שחררו אותו, מה שמאפשר למשקל ליפול בחופשיות על מוט המתמר, שנמצא במגע עם ראש הגולגולת באתר TBI. הניחו את ראשו של העכבר המורדם על המסגרת הסטריאוטקסית שנשמרה מתחת למיקרוסקופ הכירורגי.
קדח בעדינות ובאיטיות את פני השטח של הגולגולת באמצעות ביט קרביד FG4 במהירות רוטור נמוכה כדי להסיר את הפריאוסטאום שנותר, וצור משטח גולגולת מחוספס כך שהמלט הדנטלי נקשר היטב עם הגולגולת. השתמשו במי מלח כדי לשטוף ולנקות אבק עצמות מפני השטח של הגולגולת. כדי להפריד את השרירים הרוחביים מהגולגולת, בערך חמישה מילימטרים אחוריים לעין, שם ממוקם התפר המחבר בין הגולגולת הקודקודית והרקתית, הכניסו בעדינות את הקצוות הסגורים העדינים והזיזו בעדינות את הקצוות הסגורים בכיוון האחורי עד לתפר הלמבדואיד.
הפרידו את השרירים הרוחביים בצד שבו תתרחש השתלת חלון גולגולתי. לשטוף את הפסולת מאתר הניתוח באמצעות מלוחים ולייבש את האזור עם גזה. כדי להשתיל את עמוד הראש, סמן את נקודת המרכז 2.5 מילימטרים אחורית לברגמה ו -1.5 מילימטרים מתפר הקשת בהמיספרה הימנית באמצעות עט סמן וקליפר כירורגי.
לאחר מכן עקוב אחר היקף הקרניוטומיה על הגולגולת הנקייה והיבשה. שחררו את מוט האוזן וסובבו את הראש, כך שמישור הקרניוטומיה יהיה אופקי לחלוטין, ולאחר מכן הדקו שוב את מוט האוזן. השתמשו במקל העץ של אפליקטור עם קצוות כותנה כדי להוסיף שתי טיפות קטנות של דבק-על לקצה הקדמי והאחורי של עמוד הראש.
מקמו את עמוד ראש הטיטניום מעל מרכז הקרניוטומיה, והתאימו אותו במהירות למנוחה באותו מישור שבו יושתל חלון הגולגולת. הפעילו לחץ קל עד לייבוש דבק העל, פעולה שנמשכת בדרך כלל כ-30 שניות. הכינו מלט דנטלי בכלי קרמי מקורר מראש על ידי ערבוב יסודי של 300 מיליגרם אבקת מלט, שש טיפות נוזל QuickBase וטיפה אחת של זרז.
יש למרוח במהירות כמות נדיבה של תערובת צמנט דנטלי על ההיקף החיצוני ולכסות כל משטח עצם חשוף. עם זאת, אין לכסות את האתר של craniotomy. שחררו את מוט האוזן והצמידו את עמוד הראש למסגרת המתכת כדי להבטיח שהראש יציב לקידוח מדויק לאורך היקף הקרניוטומיה המסומן.
כדי לבצע את הקרניוטומיה, השתמש בקליפר כירורגי כדי לוודא את קוטר העיגול המסומן כפי שהודגם קודם, והתאם לפי הצורך, כך שחלון הגולגולת יתאים היטב לתוך הקרניוטומיה. בעזרת מקדחה דנטלית חשמלית, חורטים ומדללים את הגולגולת לאורך החלק החיצוני של העיגול המסומן באמצעות ביט קרביד FG4 תחילה, היוצר מסילה שבתוכה ניתן לדלל את הגולגולת. השקו את האזור במי מלח כדי לשטוף את אבק העצמות.
ממשיכים לדלל את הגולגולת באמצעות FG 1/4 carbide bit עד שהגולגולת דקה ושקופה. מעת לעת, להפסיק את הקידוח, ולהשקות את כל האזור עם מלוחים סטריליים שוב כדי להפחית את החימום מן המקדחה כדי לשטוף את אבק העצם. השלימו את דילול הגולגולת באמצעות ביט קרביד EF4, והמשיכו לדלל ולקדוח דרך שאר הגולגולת לאורך המסילה.
הכניסו מלקחיים עדינים בקוטר 0.5 מ"מ דרך המקום הסדוק, והרימו את דש העצם בעדינות כלפי מעלה מבלי להסיט פנימה את המוח שמתחתיו. לאחר הסרת דש העצם, להשקות את אזור craniotomy עם מלוחים. בעזרת המלקחיים הכירורגיים בעלי הקצה המעוקל, הסר בעדינות את החומר הארכנואיד הנראה לעין.
השתמש במלקחיים כירורגיים בעלי קצה ישר כדי להרים את חלון הזכוכית הסטרילית כאשר כיסוי הזכוכית בגודל שלושה מילימטר פונה כלפי מטה. מקמו וכווננו את חלון הזכוכית מעל אתר הקרניוטומיה כדי לוודא שהחלון יכול להתאים היטב לקצה הקרניוטומיה. משטח כיסוי הזכוכית בקוטר חמישה מ"מ נמצא למעלה.
מכינים את המלט הדנטלי כפי שהודגם קודם לכן, וממתינים כשש דקות עד שהמלט הופך בצקי וסמיך. בזמן ההמתנה שהמלט יהפוך לבצקי ועבה, הפעילו כמות מספקת של לחץ על החלון באמצעות מניפולטור סטריאוטקסי כדי לבדוק שהגולגולת יכולה לבוא במגע בטוח והדוק עם חלון הזכוכית. השתמש במברשת אפליקטור מדויקת מתכווננת כדי להוסיף כמות קטנה של מלט לצד קצה החלון כדי לאטום את חלון הזכוכית עם הגולגולת.
המתן כ -10 דקות כדי לתת למלט להתייבש לחלוטין, ואז שחרר בעדינות, והסר את המניפולטור מעל החלון. השלם על ידי חיתוך המלט הדנטלי באמצעות מקדחה דנטלית עם ביט קרביד FG4 אם עודפי מלט מכסים את החלון. כארבע שעות לאחר הניתוח בוצעה הדמיה של שני פוטונים, כאשר ברמה השטחית כלי הדם נראו שחורים, וברמה העמוקה של כ-400 מיקרומטר, ביטוי חלבון EGFP התפזר באופן מפוזר בכל גוף התא.
שבוע וארבעה חודשים לאחר TBI, תבנית כלי הדם שנצפתה בנקודת זמן של יום אפס שימשה כנקודת התייחסות לאיתור אותו אזור הדמיה. דפוס כלי הדם דומה לזה שביום האפס. באופן דומה, ביטוי EGFP זוהה בכל גוף התא.
עוצמת הפלואורסצנטיות ביום אפס ובארבעה חודשים הייתה דומה הן ברמה השטחית והן ברמה העמוקה יותר. עם זאת, עוצמת הפלואורסצנטיות בשבוע אחד הייתה נמוכה מזו של יום אפס וארבעה חודשים, אולי בגלל הדיכוי התרגומי שדווח עבור מודלים אחרים של TBI. חשוב לנקוט משנה זהירות בעת הפעלת שלב הקרניוטומיה כדי למנוע פגיעה ברקמת המוח.
אל תחדיר את קצה המקדחה למוח. באמצעות שיטה זו, חוקרים יכולים לדמיין חלבונים שונים בעלי עניין באותו תא לאורך שלבים שונים לאחר TBI, ולספק מידע על הלוקליזציה, הביטוי והמסיסות של חלבון זה במוח יונקים לאחר טראומה.
