Name: two-photon calcium imaging in neuronal dendrites in brain slices
Uploaded: 2018-03-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הקנדית מכוני הבריאות מחקר מדעי הטבע, מחקר הנדסי (NSERC גילוי גרנט) וקרן סבוי. OC נתמכה על ידי מלגת דוקטורט מ NSERC.

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות רווחת החיה הגנה הוועדה של אוניברסיטת לאוול והמועצה קנדי על טיפול בעלי חיים.
1. הכנה ראשונית (אופציונלי: להכין יום מראש)
<ol><li>הכינו שלושה סוגים של נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (כלנית חדד) פתרון (רגילה, סוכרוז, התאוששות פתרונות, 1 ליטר לכל; ראה טבלה 1). התאם את osmolality של הפתרונות ± 10 300 mOsm25 . ומגניב כלנית חדד-סוכרוז עד נקודה ליד קירור (0-4 ° C). הערה: השימוש של פתרון חיתוך דל-נתרן (כלנית חדד-סוכרוז) מסייעת לשמר את הכדאיות של נוירונים בשכבות השטחיות של פרוסות חריפה26.</li>
	<li>להכין 0.75 מ של תיקון-פתרון הכולל של fluorophore אדום (למשל, אלקסה-594), מחוון ירוק סינתטי סידן (למשל, אורגון הירוקה BAPTA-1; ראה טבלה 1). כוללים biocytin (ראה טבלה 1) בפתרון התיקון-אם פוסט הוק זיהוי מורפולוגי של תאים מוקלטות נדרשת.</li>
	<li>התאם את osmolality של הפתרון 280 mOsm ± 5 ו- pH 7.35 ± 0.5. שמור את הפתרון במקרר או על קרח בכל עת. הערה: בחירה של מחוון סידן צריך להיות המבוססים על טווח דינמי שלה ועל אופיה של האירועים2 + Ca ובדוקים.</li>
	<li>שימוש של פולר micropipette, להכין טלאי פיפטות של נימים זכוכית בורוסיליקט (ראה טבלה של חומרים) עם טיפ 2 מיקרומטר ≈ (פיפטה ההתנגדות של MΩ 3-5), גירוי פיפטות של נימים תטא-זכוכית בורוסיליקט (ראה טבלה של חומרים) עם טיפ 2-5 מיקרומטר. הערה: ההגדרות פולר כדי להפוך פיפטות של קוטר נתון ו צורה ייקבעו לפי סוג נימה של פולר את תוצאות הבדיקה כבש עבור סוג מסוים של זכוכית.</li>
</ol>2. בהיפוקמפוס פרוסה הכנה
<ol><li>עזים ומתנגד העכבר (P13-20; את הלחץ ואת המין של העכבר נקבעת לפי השאלה ניסיוני שפנתה) עם 1 מ"ל של איזופלוריין להציב על גבי מגבת נייר בתוך תא הרדמה אינהלציה. כאשר החיה הוא מורדם עמוקות, כפי שמעידים חוסר תנועה, נשימה איטית, להסיר אותו מהתא הרדמה, לערוף באמצעות גיליוטינה.</li>
	<li>לחשוף את הגולגולת על ידי חיתוך העור עם זוג מספריים מהחלק האחורי של הגולגולת באף קטן. השתמש זוג קטן של העצם מיני rongeurs כדי לעשות חור ברמת bregma. ואז להשתמש המספריים לעשות חתך סימטרית-על-rostral לאורך התפר המשונן. עם rongeurs לאחוז האחורי של כל הגולגולת הכריכה, מעלית כלפי מעלה והחוצה כדי להסיר את הגולגולת כיסוי האונה כל.</li>
	<li>אחרי המוח נחשף במלואו, לערער העצבים האופטים עם מרית קטנה. מסירים את המוח מהגולגולת והכניס אותו לתוך צלחת פטרי המכילות ברציפות מחומצן, קר כלנית חדד-סוכרוז (ראה טבלה 1 ריכוז סוכרוז).<ol>
<li>אם הרקמה של עכברים בוגרים נדרש, לבצע זלוף intracardiac באמצעות מזרק (25 גרם) מלא 20 מ של חנה המבר כקרח-סוכרוז לפני החילוץ במוח כדי לקבל פרוסות באיכות טובה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין פרוסות בהיפוקמפוס מהמוח בעלי חיים שחולצו.<ol>
<li>תן הצינה המוח עבור בסביבות 2 דק מניחים חתיכת נייר סינון על צלחת פטרי וגדוש קרח, להעביר את המוח על גבי נייר הסינון. לנתח את שתי ההמיספרות.</li>
		<li>הדבק את ההמיספרות גזור (הכיוון נקבעת על-ידי המטרה ניסיוני כדי לקבל פרוסות הפרונטליים, חציה או אופקי) על גבי שולחן vibratome, לטבול אותו במגש vibratome מלא עם חנה המבר מחומצן כקרח-סוכרוז. להפוך 300-מיקרומטר פרוסות עבות בטמפרטורה של 1 ° C באמצעות vibratome קריר או הצבת הקרח סביב המגש vibratome.</li>
		<li>בעזרת מכחול שטוח, לצבור את פרוסות המכילות בהיפוקמפוס (עד 6 פרוסות לכל חצי הכדור) באמבט המכיל חמצן חנה המבר-שחזור מחומם ל- 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>להשאיר את הפרוסות באמבטיה כלנית חדד-התאוששות למשך לפחות 45 דקות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטות
<ol><li>להציב פרוסה בהיפוקמפוס באמבט מתחת המטרה (הגדלה: 40 x, מפתח נומרי: 0.8) של מיקרוסקופ שני הפוטונים סריקה בלייזר. ללא הרף perfuse האמבטיה עם חמצן חנה המבר-נורמלית מחומם ב 30-32 מעלות צלזיוס בשיעור של 2.5-3 מ לדקה.</li>
	<li>השתמש ניגודיות התערבות דיפרנציאלית אינפרא-אדום (IR-DIC) או Dodt-מפקדת הסטארגייט מיקרוסקופ כדי לאתר תא עניין באמצעות שלה גודל, צורה, מיקום. הערה: בהתאם האוכלוסייה נוירון יישוב, מודל הטרנסגניים העכבר ניתן לאתר בקלות תאים עניין. במקרה זה, שלב זה הרבה עם שימוש של מקור אור פלורסנט.</li>
	<li>למלא פיפטה גירוי של פתרון כלנית חדד-נורמלית המכיל את fluorophore אדום (למשל, אלקסה-594).</li>
	<li>להגדיר את פיפטה גירוי (מחוברים יחידת גירוי חשמלי) על הפרוסה כך הקצה הוא באותו אזור של התא עניין.</li>
	<li>לאחר מילוי של פיפטה תיקון עם פתרון תיקון וצירופם לשלב ראש, להגדיר אותו על הפרוסה כך את קצהו הוא ישירות מעל התא של ריבית.</li>
	<li>להשתלב מזרק צימוד-כיוונית וחבר אותו התיקון-פיפטה דרך הצינורית פלסטיק. להזריק לחץ חיובי קבוע לתוך פיפטה תיקון (≈ 0.1 מ"ל) באמצעות המזרק. שמור את צימוד במצב "סגור".</li>
	<li>להפעיל את המודול תוכנות שליטה מגבר, לעבור למצב המתח להדק בלחיצה על כפתור "VC". פתח אלקטרופיזיולוגיה נתונים רכישת התוכנה (למשל, clampex) עבור רכישת של אותות אלקטרופיזיולוגיות ולחץ על הסמל "קרום מבחן" לעשות זה לשלוח ללא הרף את מתח מרובע דופק (5 mV, 10 ms), אשר יש צורך לנטר שינויים בהתנגדות פיפטה.</li>
	<li>. תוריד את פיפטה תיקון עד שזה ישר לראש התא יישוב. בעת יצירת קשר עם קרום התא, להסיר את הלחץ על-ידי הפעלת את צימוד למצב 'פתח'. הערה: קשר עם קרום התא מזוהה בעת עלייה קטנה במחתרת פיפטה (≈ 0.2 MΩ) נתפסת והיא כניסה קטן על התא נגרמת על ידי לחץ אוויר חיובי.</li>
	<li>לחץ שלילי קלה חלות על פיפטה תיקון באמצעות על מזרק ריק מצויד לתוך צימוד עד ההתנגדות פיפטה שמספקת התוכנה מגיע 1 GΩ. בחלון "הבדיקה" קרום"של התוכנה רכישת נתונים, מהדק את התא ב-60 mV.</li>
	<li>המשך הפעלת לחץ שלילי עד התא נפתח תצורת כל-תא מושגת. זיהוי של מדינה תא מתבסס על השינוי הפתאומי ההתנגדות פיפטה (מתוך GΩ 1 ל 70-500 MΩ בהתאם לסוג interneuron) ואת המראה של תופעות מעבר קיבולי גדול בחלון "הבדיקה" קרום".</li>
</ol>4. שני הפוטונים Ca2 + הדמיה
<ol><li>אם מעוניינת התגובות postsynaptic סינאפסות, להוסיף את gabazine חוסם קולטן GABAA (10 מיקרומטר) ו את חוסמי קולטן GABAB CGP55845 (2 מיקרומטר) באמבטיה כלנית חדד.</li>
	<li>במודול תוכנת שליטה מגבר, הגדר את תצורת תיקון הנוכחי-קלאמפ על-ידי לחיצה על כפתור "CC" ולהקליט דפוס הירי של התא בתגובה סומאטית זריקות של depolarizing הנוכחי (0.8-1.0 nA, 1 s). המתן לפחות 30 דקות של התא תהיה מלאה האינדיקטורים נוכח הפתרון תיקון. הערה: ירי דפוס ומאפיינים פעיל של התא יכול לשמש כדי לזהות את סוג המשנה של התא; למשל, תאים עולה מהר. חשוב על ריכוז מחוון לייצב באמצעות דיפוזיה לפני שמתחילים להקליט חתולים (ראו טבלה 2 פתרון בעיות).</li>
	<li>AP-עורר חתולים<ol>
<li>באמצעות התוכנה רכישת התמונה, להתחיל רכישת תמונות. אתר של דנדריט עניין באמצעות האות פלואורסצנטי אדום. כדי להבטיח תגובה גלויה, ראשית, לבחור דנדריט צינתור (≤ 50 מיקרומטר) כמו היעילות של AP backpropagation עלולה לרדת באופן משמעותי עם מרחק GABAergic interneurons22.</li>
		<li>באמצעות הכלי' מלבני' בתוכנה רכישת התמונה, להגדיל האזור ולעבור "xt" מצב (linescan). מקם את הסריקה ברחבי הסניף דנדריטים של ריבית. עם עוצמת לייזר בקרי בתוכנת רכישה, להגדיר את הלייזר שני הפוטונים ברמה כוח מינימלי איפה בסיסית ירוק הוא גלוי רק מעט, כדי להימנע phototoxicity.</li>
		<li>באלקטרופיזיולוגיה נתונים רכישת התוכנה 'פרוטוקול' חלון ותמונה רכישת תוכנה, ליצור גירסת ניסיון הקלטה של משך הנסיעה המכיל זריקה הנוכחי סומאטית של משרעת הרצוי.<ol>
<li>באמצעות התוכנה רכישת התמונה, לחץ על לחצן "התחל רשומה" ולרכוש פלורסצנטיות ברציפות עבור חזור ס' 1-2 הרכישה תמונה 3 - 10 פעמים. חכה לפחות 30 s בין הסריקות יחיד כדי למנוע נזקי. אם רכישת linescans בנקודות מרובים לאורך דנדריט, לקחת אותם בסדר אקראי כדי למנוע תופעות סדר.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>חתולים עורר synaptically<ol>
<li>אתר של דנדריט עניין באמצעות האות פלואורסצנטי אדום.</li>
		<li>הגדר את פיפטה גירוי על פני השטח של הפרוסה מעל דנדריט עניין. הורידו לאט את פיפטה גירוי למקומו, צמצום התנועה כדי שלא להפריע למטופלים את תצורת כל תא. מקם פיפטה של 10-15 מיקרומטר של פיתוח.</li>
		<li>כדי להמחיש את המיקום של microdomains סינפטית ב aspiny דנדריטים, בתוכנה רכישת התמונה לעבור 'xt' (linescan) מצב ומקם את הקו לאורך הענף דנדריטים עניין.</li>
		<li>"פרוטוקול" חלון (אלקטרופיזיולוגיה נתונים רכישת תוכנה), תמונה רכישת תוכנה, ליצור משפט הקלטה שמפעיל את יחידת גירוי לאחר תחילת המשפט.</li>
		<li>באמצעות רכישת התוכנה, לחץ על לחצן "התחל רשומה" כדי לסרוק לאורך פיתוח ברציפות עבור רכישת חוזר ס' 1-2 3 - 5 פעמים, מחכה 30 s בין הסריקות כדי למנוע נזקי. הערה: האורך של הסריקה ניתן להתאים בהתאם קינטיקה של האירוע עורר, אך צריך להיות ממוזער כדי למנוע נזקי (ראו טבלה 2 פתרון בעיות).</li>
		<li>חזור על שלב 4.5.5 בתנאים שונים (למשל, העוצמה/אורך שונים של גירוי, הקדמה של חוסם הפריטים המוקפצים תרופתי, וכדומה) בהתאם לשאלה ספציפית נותרים ללא מענה.</li>
		<li>לעצור את הרכישה כאשר התא מראה סימנים של הידרדרות בריאות: דפולריזציה מתחת-45 mV, עלייה הבסיס Ca2 + רמה, הידרדרות מורפולוגי של דנדריטים (למשל, blebbing, פיצול; ראה בטבלה 2 פתרון בעיות).</li>
		<li>כדי לקבל מידע ראשוני על המורפולוגיה של התא לשמור רשומה של המיקום של פיפטה גירוי, רוכשים את Z -ערימה של התא ערוץ הצבע האדום. שימוש בתוכנת רכישה ב 'xyz' מצב, מציבה את הגבולות העליונים והתחתונים מחסנית לשיקוף את התא כולו עם כל התהליכים כללו. להגדיר את 'גודל צעד' ב 1 מיקרומטר וליזום הרכישה מחסנית באמצעות לחצן "התחל רשומה".</li>
		<li>כאשר Z-מחסנית הרכישה הושלמה, השתמש באפשרות "הקרנה מרבי" בתוכנה כדי להרכיב כל התכניות מוקד המחסנית של ולוודא את האיכות של רכישה. ואז, לאט לאט נסגרים על פיפטה תיקון מחוץ הפרוסה</li>
		<li>כדי לתקן את הפרוסה לזיהוי מורפולוגי פוסט הוק , להסיר את הפרוסה של האמבטיה באמצעות מכחול שטוח, ובמהירות במקום זה בין בשני העיתונים מסנן, צלחת פטרי מלא כלנית חדד. להחליף את חנה המבר פתרון paraformaldehyde (PFA) 4% ולהשאיר את המנה 4 ° C החדר או במקרר למשך הלילה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. אימונוהיסטוכימיה לזיהוי מורפולוגי פוסט הוק של תאים מוקלט
הערה: לאחר לילה 1 של קיבוע מחברים, הפרוסה ניתן לאחסן במאגר פוספט (PB) עם אזיד הנתרן (0.5%) עד כחודש.
<ol><li>הכניסו את הפרוסה באגירה טריס תמיסת מלח (TBS) עם טריטון X-100 (0.3%) ולבצע שוטף 4 (5-10 דקות כל אחד).</li>
	<li>הכניסו את הפרוסה TBS-טריטון 0.3% עם 10% נסיוב עז רגילה (הגדרות) 1 h.</li>
	<li>לשים את הפרוסה TBS-טריטון 0.3% 1% המיתרים, של Streptavidin מצומדת fluorophore (למשל, אלקסה עבור חיל הים 546-מצומדת Streptavidin, 1:200) עבור לילה הדגירה.</li>
	<li>לשטוף 4 פעמים (5-10 דקות) ב- TBS.</li>
	<li>הר פרוסות על שקופיות מיקרוסקופ, התמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. כדי שיחזור תא מלאה, לרכוש Z-מחסנית (שלב גודל: 1 מיקרומטר) באמצעות מטרה 20 x. עבור הדמיה תווית של אלקסה-546-מצומדת, להגדיר שימוש בלייזר nm 543 וזיהוי nm 515-560 לסנן.</li>
</ol>6. ניתוח של חתולים
<ol><li>לחלץ את הערכים פלורסצנטיות מהאזורים של הריבית (ROIs) של תמונות linescan מן הערוצים אדום וירוק, ממוצע של הערכים של חוזר מרובים עבור כל תנאי להפחית את הרעש. הערה: כאשר linescan הרכישה מתבצעת לאורך פיתוח, זה אפשרי לחלץ נתונים מתוך ROIs מרובים, אשר יתאימו ל- microdomains דנדריטים (2-5 מיקרומטר), ובכך מאפשרים לימוד Ca2 + אות מידור.</li>
	<li>עבור כל רועי, לבטא את השינויים ב- Ca2 + משרעת כמו: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56776/56776eq1.jpg"> הערה: כאן G הוא הערך פלורסצנטיות מערוץ ירוק; G0 הוא הערך פלורסצנטיות בסיסית בלבד לערוץ הצבע הירוק במהלך תקופת טרום גירוי; R הוא הערך זריחה של הערוץ האדום18. שני הפוטונים עירור הוא מקומי מאוד, אינו יוצר רקע משמעותי, חיסור של רקע זריחה אינה נדרשת.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Williams, S. R., Mitchell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+somatic+voltage+clamp+errors+in+central+neurons.">Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons.</a> Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).</li><li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+upmanship:+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick.">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18, 351-357 (1997).</li><li>Yuste, R., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spines+as+basic+functional+units+of+neuronal+integration.">Dendritic spines as basic functional units of neuronal integration.</a> Nature. 375, 682-684 (1995).</li><li>Nimchinsky, E. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+Dendritic+Spines.">Structure and Function of Dendritic Spines.</a> Annu Rev Physiol. 64, 313-353 (2002).</li><li>Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+calcium+channels+in+single+spines+using+optical+fluctuation+analysis.">Analysis of calcium channels in single spines using optical fluctuation analysis.</a> Nature. 408, 589-593 (2000).</li><li>Mainen, Z. F., Malinow, R., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+calcium+transients+in+single+spines+indicate+that+NMDA+receptors+are+not+saturated.">Synaptic calcium transients in single spines indicate that NMDA receptors are not saturated.</a> Nature. 399, 151-155 (1999).</li><li>Yasuda, R., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+calcium+channels+in+dendritic+spines.">Plasticity of calcium channels in dendritic spines.</a> Nat Neurosci. 6, 948-955 (2003).</li><li>Carter, A. G., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-dependent+calcium+signaling+in+dendritic+spines+of+striatal+medium+spiny+neurons.">State-dependent calcium signaling in dendritic spines of striatal medium spiny neurons.</a> Neuron. 44, 483-493 (2004).</li><li>Topolnik, L., Congar, P., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+metabotropicglutamate+receptor-+and+AMPA+receptor-mediated+dendritic+Ca2++signals+by+presynaptic+and+postsynaptic+activity+in+hippocampal+interneurons.">Differential regulation of metabotropicglutamate receptor- and AMPA receptor-mediated dendritic Ca2+ signals by presynaptic and postsynaptic activity in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 25, 990-1001 (2005).</li><li>Topolnik, L., Chamberland, S., Pelletier, J. G., Ran, I., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+compartmentalized+regulation+of+dendritic+Ca2++signaling+in+hippocampal+interneurons.">Activity-dependent compartmentalized regulation of dendritic Ca2+ signaling in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 29, 4658-4663 (2009).</li><li>Camir&#233;, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+calcium+nonlinearities+switch+the+direction+of+synaptic+plasticity+in+fast-spiking+interneurons.">Dendritic calcium nonlinearities switch the direction of synaptic plasticity in fast-spiking interneurons.</a> J Neurosci. 34, 3864-3877 (2014).</li><li>Jaffe, D. B., Johnston, D., Lasser-Ross, N., Lisman, J. E., Miyakawa, H., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thespread+of+Na++spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2++entry+into+hippocampal+neurons.">Thespread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li><li>Nakamura, T., Barbara, J. G., Nakamura, K., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+release+of+Ca2++from+IP3-sensitive+stores+evoked+by+synaptic+activation+of+mGluRs+paired+with+backpropagating+action+potentials.">Synergistic release of Ca2+ from IP3-sensitive stores evoked by synaptic activation of mGluRs paired with backpropagating action potentials.</a> Neuron. 24, 727-737 (1999).</li><li>Kovalchuk, Y., Eilers, J., Lisman, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+subthreshold+Ca(2+)+signals+in+spines+of+hippocampal+neurons.">NMDA receptor-mediated subthreshold Ca(2+) signals in spines of hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 20, 1791-1799 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R., Tamas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++imaging+of+mouse+neocortical+interneurone+dendrites:+contribution+of+Ca2+-permeable+AMPA+and+NMDA+receptors+to+subthreshold+Ca2++dynamics.">Ca2+ imaging of mouse neocortical interneurone dendrites: contribution of Ca2+-permeable AMPA and NMDA receptors to subthreshold Ca2+ dynamics.</a> J Physiol. 551, 67-78 (2003).</li><li>Goldberg, J. H., Lacefield, C. O., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+dendritic+calcium+spikes+in+mouselayer+5+low+threshold+spiking+interneurones:+implications+for+control+of+pyramidal+cell+bursting.">Global dendritic calcium spikes in mouselayer 5 low threshold spiking interneurones: implications for control of pyramidal cell bursting.</a> J Physiol. 558, 465-478 (2004).</li><li>Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+single+synapses+in+brain+slices.">Functional imaging of single synapses in brain slices.</a> Exp Physiol. 87, 733-736 (2002).</li><li>Yasuda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+concentration+dynamics+in+small+neuronal+compartments.">Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments.</a> Sci STKE. 219, pl5 (2004).</li><li>Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+intracellular+calcium+concentrations+and+buffering+without+wavelength+rationing.">Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength rationing.</a> Biophys J. 78, 2655-2667 (2000).</li><li>Camir&#233;, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+compartmentalization+and+regulation+of+postsynaptic+CaTs+in+inhibitory+interneurons.">Functional compartmentalization and regulation of postsynaptic CaTs in inhibitory interneurons.</a> Cell Calcium. 52, 339-346 (2012).</li><li>Guet-McCreight, A., Camir&#233;, O., Topolnik, L., Skinner, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+semi-automated+strategy+to+develop+multi-compartment+models+that+predict+biophysical+properties+of+interneuron-specific+3+(IS3)+cells+in+hippocampus.">Using a semi-automated strategy to develop multi-compartment models that predict biophysical properties of interneuron-specific 3 (IS3) cells in hippocampus.</a> eNeuro. 3, 1-26 (2016).</li><li>Evstratova, A., Chamberland, S., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+and+activity-dependent+dynamics+of+action+potential-evoked+Ca2++signals+in+dendrites+of+hippocampal+inhibitory+interneurons.">Cell type-specific and activity-dependent dynamics of action potential-evoked Ca2+ signals in dendrites of hippocampal inhibitory interneurons.</a> J Physiol. 589, 1957-1977 (2011).</li><li>Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+calcium+mechanisms+and+long-term+potentiation+in+cortical+inhibitory+interneurons.">Dendritic calcium mechanisms and long-term potentiation in cortical inhibitory interneurons.</a> Eur J Neurosci. 35, 496-506 (2012).</li><li>Camir&#233;, O., Lacaille, J. C., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Signaling+in+Inhibitory+Interneurons:+Local+Tuning+via+Group+I+Metabotropic+Glutamate+Receptors.">Dendritic Signaling in Inhibitory Interneurons: Local Tuning via Group I Metabotropic Glutamate Receptors.</a> Front Physiol. 3, 259 (2012).</li><li>Bourque, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+mechanisms+of+osmosensation+and+systemic+osmoregulation.">Central mechanisms of osmosensation and systemic osmoregulation.</a> Nat RevNeurosci. 9, 519-531 (2008).</li><li>Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+studies+in+the+facial+nucleus+illustrating+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+motoneurons+in+adult+rat+brain+slices.">Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices.</a> Synapse. 3, 331-338 (1989).</li><li>Pettit, D. L., Wang, S. S., Gee, K. R., Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+two-photon+uncaging:+anovel+approach+to+mapping+glutamate+receptors.">Chemical two-photon uncaging: anovel approach to mapping glutamate receptors.</a> Neuron. 19, 465-471 (1997).</li><li>Salom&#233;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+random-access+scanning+in+two-photon+microscopy+usingacousto-optic+deflectors.">Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy usingacousto-optic deflectors.</a> J Neurosci Methods. 154, 161-174 (2006).</li><li>Lechleiter, J. D., Lin, D. T., Sieneart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+laser+scanning+microscopy+using+an+acoustic+optical+deflector.">Multi-photon laser scanning microscopy using an acoustic optical deflector.</a> Biophys J. 83, 2292-2299 (2002).</li></ol>

המחברים יש אין מתחרים אינטרסים כלכליים או אחרים ניגודי עניינים.

השיטה המוצגת כאן מדגים כיצד ניתן להשתמש השילוב של שני הפוטונים Ca2 + הדמיה electrophysiology תיקון-קלאמפ ללמוד דנדריטים Ca2 + איתות של דנדריטים עצביים במוח חריפה פרוסות. שיטה זו מאפשרת ניטור של שניהם מקומי Ca2 + הגבהים עורר על ידי חשמל AP גירוי או backpropagating מקטעים דנדריטים, ואת התגובה סומ?...

התרומה של נוירון לפעילות הרשת נקבעת במידה רבה על ידי באופי הדינמי של הקלט סינפטית שהיא מקבלת. באופן מסורתי, השיטה הדומיננטית של אפיון פעילות סינפטיים בנוירונים הסתמך על תיקון שלם-תא הסומטית-קלאמפ הקלטות של זרמי postsynaptic עורר על ידי גירוי חשמלי של אקסונים של המעבר. עם זאת, הפעילות היחידה של הסינפסות ממוקם הציר הקרוב הוא דיווח בכנות במקרה הזה1. בנוסף, כדי להעריך את המנגנונים הספציפיים סינפסה, שימשו הקלטות זוגות נוירונים ומן דנדריטים במיקום ספציפי למטרה הסינפסות עניין ולפי המנגנון של אינטגרציה דנדריטים, בהתאמה. פריצת דרך בתחום הפיזיולוגיה סינפטית הושג באמצעות נישואים של טכניקות אופטי אלקטרופיזיולוגיות. סריקת מיקרוסקופ (2PLSM) בשילוב עם Ca2 + הדמיה וכלים optogenetic לייזר שני הפוטונים עירור עלול לחשוף פרטים עצומה של הארגון הדינאמי של פעילות סינפטית ספציפי חיבורים עצביים במוח פרוסות חוץ גופית ו ויוו.
מספר יתרונות מרכזיים שנעשו 2PLSM להתבלט מיקרוסקופ עירור קונבנציונאלי, פוטון אחד2: (1) בשל אופי לא לינארית של שני הפוטונים עירור, נוצר על ידי קרינה פלואורסצנטית רק באמצעי אחסון מוקד ולאחר כל הפוטונים הנפלטים מייצגים שימושי אותות (אין צורך חריר); (2) אורכי הגל, בשימוש 2PLSM, לחדור את הרקמה פיזור ביעילות רבה יותר; בנוסף, פוטונים מפוזר הם גם לדלל לייצר שני הפוטונים עירור, רקע זריחה; (3) נזקי phototoxicity מוגבלים גם למישור מוקד. לכן, למרות העלות הגבוהה של פוטון 2 מערכות בהשוואה מיקרוסקופ קונפוקלי קונבנציונאלי, נשאר 2PLSM שיטת הבחירה לחקירה ברזולוציה גבוהה של מבנה העצבית ותפקוד ברקמת החיים עבה.
היישום הראשון של 2PLSM ברקמות פיזור היתה תמונת המבנה והתפקוד של הדנדריטים3. 2PLSM בשילוב עם Ca2 + הדמיה חשפה שהפונקציה קוצים כמו תאים מבודדים הביוכימי. מאז בסוגי עצביים רבים יש התאמה של אחד לאחד בין קוצים בודדים הסינפסות4, שני הפוטונים Ca2 + הדמיה בקרוב הפך להיות כלי שימושי דיווח הפעילות של הפרט סינפסות רקמות ללא פגע5, 6,7,8. יתר על כן, Ca2 + דימות מבוסס 2PLSM שימש בהצלחה כדי לפקח על הפעילות של ערוצי סידן יחיד, יחסי גומלין לא לינארית conductances פנימי וסינפטית, כמו גם כדי להעריך את מצב פעילות ותלוי רגולציה של Ca2 + איתות דנדריטים עצביים5,6,7,8,9,10,11.
סידן הוא שליח השני תאיים בכל מקום, ייתכן האירגון subcellular קובע את הכיוון של תגובות פיזיולוגיות, מפני שינויים סינפטיים כוח ברגולציה של יון ערוצי, צמיחה דנדריט ועמוד השדרה, כמו כמו מוות של תאים, הישרדות. Ca דנדריטים2 + הגבהים להתרחש באמצעות הפעלה של נתיבים מרובים. פוטנציאל פעולה (APs), backpropagating אל דנדריטים, פתיחת ערוצי סידן ממותגת מתח12 ומפיקים יחסית הכללית Ca2 + תופעות מעבר (חתולים) דנדריטים, קוצים13. הסינאפסית מזוהה עם ההפעלה של Ca postsynaptic2 +-קולטנים חדיר (NMDA, Ca2 +-חדיר אמפא, kainate), מפעילה סינפטית חתולים14,6,15. לבסוף, ניתן להפיק supralinear Ca2 + אירועים של דנדריטים תחת מסוים התנאים11,12,13,16.
שני הפוטונים Ca2 + הדמיה בשילוב עם הקלטות אלקטרופיזיולוגיות תיקון-קלאמפ מעסיקה Ca סינתטי2 +-אינדיקטורים פלורסנט רגיש, אשר מועברים בדרך כלל דרך האלקטרודה תיקון במהלך הקלטות שלם-תא . שיטה סטנדרטית על כימות של Ca2 + דינמיקה מבוסס על כביש17,שיטת מחוון כפול18. הוא משתמש fluorophores שני עם ספקטרום הפליטה מופרדים היטב (למשל, שילוב של אדום Ca2 +-צבע אטום עם ירוק Ca2 + אינדיקטורים, כגון אורגון הירוקה BAPTA-1 או Fluo-4) יש מספר יתרונות בהשוואה שיטת אינדיקציה יחידה. ראשית, Ca2 +-צבע רגישות משמש כדי לאתר מבנים קטנים עניין (סניפים דנדריטי ואת עמוד השדרה) שבו יבוצעו Ca2 + הדמיה. שנית, היחס בין שינוי ירוק ואדום קרינה פלואורסצנטית (ΔG/R) מחושבת כאמצעי של [Ca2 +], המהווה במידה רבה רגישות לשינויים בסיסית פלורסצנטיות עקב תנודות [Ca2 +]017 , 18. יתר על כן, התפקיד פלורסצנטיות השינויים מבחינת מוחלטת Ca2 + ריכוזים19.
דאגה כללית בעת הפעלת שני הפוטונים Ca2 + הדמיה ניסויים בפרוסות חריפה היא בריאות ויציבות של רכישת התמונה עקב עוצמת הלייזר גבוהה משמש בדרך כלל. בנוסף, Ca2 + ניסויים הדמיה, קיים חשש על ההפרעות, ניכר מופרזת של Ca subcellular2 + דינמיקה בשל העובדה כי Ca2 + מחוונים לשמש ניידים במיוחד אקסוגני Ca2 + מאגרים. לכן, הבחירה של מחוון Ca2 + והריכוז שלו תלוי על סוג עצביים, משרעת הצפויה של חתולים, השאלה ניסיוני.
שינינו את שיטת שני הפוטונים Ca2 + הדמיה עבור חקירת Ca2 + תנודות דנדריטים של GABAergic interneurons9,10,11,20,21 , 22. בעוד עיקר מוקדם Ca2 + הדמיה מחקרים נעשו בו נוירונים העיקרי, interneurons מעכבות להציג לראווה מגוון גדול של תפקודי Ca2 + מנגנונים נבדלים אלה תאים כפירמידה20 , 23 , 24. מנגנונים אלה interneuron ספציפיים (למשל, Ca2 + חדיר אמפא רצפטורים) עשוי לשחק תפקידים ספציפיים בוויסות פעילות התאים. בעוד דנדריטים Ca2 + איתות ב interneurons הוא מטרה מפתה לחקירה נוספת, שני הפוטונים Ca2 + דימות in דנדריטים של תאים אלה מציגה אתגרים נוספים, מ בקוטר דק יותר של דנדריטים וחוסר קוצים כדי גבוהה במיוחד אנדוגני Ca2 + מחייב קיבולת. כל תחומי המחקר שלנו המחקר של interneurons בהיפוקמפוס, פרוטוקול הבאות, בעוד החלים על אוכלוסיות עצביים שונים, הותאם להתמודד עם האתגרים הללו.
פרוטוקול זה הוצא להורג עם מיקרוסקופ שני הפוטונים מסחרי קונפוקלי, אשר מצויד עם גלאים חיצוניים, שאינם descanned שני (NDDs), אפנן אלקטרו-אופטיים (לבחירות) Dodt סריקת צבע ניגודיות (מפקדת הסטארגייט), מותקן על טבלת אופטי. המיקרוסקופ היה בשילוב עם Ti:Sapphire לייזר multiphoton במצב נעול ב 800 nm (> 3 W, 140 פעימות fs, 80 הרץ חזרה שער). מערכת ההדמייה היה מצויד מעטה אלקטרופיזיולוגיה רגיל, כולל תא זלוף עם בקרת טמפרטורה, פלטפורמה תרגום עם שני micromanipulators, מגבר microelectrode מבוקרת מחשב, של התקן דיגיטציה, גירוי היחידה, הנתונים רכישת התוכנה.

<table><tbody><tr><td>Animal Strain: Mouse CD1</td><td>Charles River</td><td>022</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>AbbVie Corporation</td><td>0B506-099</td><td></td></tr><tr><td>CGP 55845 hydrochloride</td><td>Abcam</td><td>ab120337</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde powder, 95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Potassium gluconate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic dihydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Sodium phosphate monobasic&lt;br/&gt; monohydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Hydrazide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10438</td><td></td></tr><tr><td>SR95531 (Gabazine)&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab120042</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Adenosine triphosphate (ATP)-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Guanosine (GTP)-Na&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Oregon Green BAPTA-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6812</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Phosphocreatine di(tris) salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1937</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Streptavidin-conjugated Alexa-546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11225</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Patch Borosilicate Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Theta Borosilicate Glass Capillaries</td><td>Sutter Instrument</td><td>BT-150-10</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; P-97 Flaming/Brown Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser&amp;nbsp;</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF Imaging Acquisition Software</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Temperature Controller TC-324B</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; MultiClamp 700B Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Digidata 1440A Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Confocal Translator</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Micromanipulator</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; pClamp Data Acquisition Software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; A365 Constant Current Stimulus Isolator</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Vibraplane Optical Table</td><td>Kinetic Systems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

two-photon calcium imaging in neuronal dendrites in brain slices

הדמיית סידן (Ca2 +) הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור את הדינמיקה ייתכן של אותות תאיים2 + Ca בדנדריטים עצביים. Ca2 + תנודות יכול להתרחש באמצעות מגוון רחב של הממברנה, מנגנונים תאיים, לשחק תפקיד מכריע של אינדוקציה של פלסטיות סינפטית, ויסות דעתנית דנדריטים. מכאן, היכולת להקליט סוגים שונים של Ca2 + אותות בענפים דנדריטים הוא יקר עבור קבוצות לומדים איך דנדריטים לשלב מידע. כניסתו של מיקרוסקופ שני הפוטונים עשה מחקרים כאלה קל יותר באופן משמעותי על ידי פתרון הבעיות כדי הדמיה ברקמה חיה, כגון פיזור אור, נזקי. יתר על כן, באמצעות שילוב של שיטות אלקטרופיזיולוגיות קונבנציונאלי עם שני הפוטונים Ca2 + הדמיה, זה אפשרי לחקור המקומי Ca2 + תנודות דנדריטים עצביים במקביל עם הקלטות של פעילות סינפטית סומה. כאן, אנו נתאר כיצד להשתמש בשיטה זו כדי ללמוד את הדינמיקה של רשות מקומית2 + תופעות מעבר (חתולים) בדנדריטים של GABAergic interneurons מעכבות. השיטה ניתן להחיל גם ללמוד דנדריטים Ca2 + איתות סוגים עצביים במוח חריפה פרוסות.

באמצעות פרוטוקול המובאת כאן, השגנו חתולים עורר סומאטית נוכחי הזרקת ועל ידי גירוי חשמלי של דנדריטים של oriens/alveus interneurons באזור CA1 של ההיפוקמפוס. לאחר תיקון נוירון, מזוהה המבוסס על הצורה והמיקום שלה, השגנו linescans על פני דנדריט הפרוקסימלית נקודות מרובות-נתן מרחקים סומא (<strong class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices at JoVE.com

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

שני הפוטונים סידן הדמיה של דנדריטים עצביים במוח פרוסות

אנו מציגים שיטת שילוב תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטות והדמיה שני הפוטונים להקליט את Ca2 + שנחשולי דנדריטים עצביים במוח חריפה פרוסות.

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

two-photon-calcium-imaging-in-neuronal-dendrites-in-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K Views.  Université Laval. אנו מציגים שיטת שילוב תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטות והדמיה שני הפוטונים להקליט את Ca2 + שנחשולי דנדריטים עצביים במוח חריפה פרוסות.

Video: Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation של נוירונים בין פרוסות המוח מכרסמים לחקר הילוכים Synaptic ותמונה מסופי Presynaptic

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

In vivo 2-Photon סידן הדמיה ב Layer 2 / 3 של עכברים

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Biology

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

סידן הדמיה תפקודית בפיתוח רשתות קליפתיים

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

תגובות סידן הדמיה בנוירונים GFP-tagged של פרוסות מוח עכבר ההיפותלמוס

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

אורך שני-פוטון הדמיה של CA1 היפוקמאל בעכברים חיים

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

Behavior

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

אלקטרו הקלטה בו זמנית ובסידן הדמיה של suprachiasmatic גרעין נוירונים

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

שני פוטונים<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high spatial and temporal resolution. Combined with electrophysiology, it is widely used to study activity-related calcium signals in small subcellular compartments such as dendrites and dendritic spines. In addition to calcium transients, synaptic activity also induces postsynaptic sodium signals, the properties of which are only marginally understood. Here, we describe a method for combined whole-cell patch-clamp and multi-photon sodium imaging in cellular micro domains of central neurons. Furthermore, we introduce a modified procedure for ultra-violet (UV)-light-induced uncaging of glutamate, which allows reliable and focal activation of glutamate receptors in the tissue. To this end, whole-cell recordings were performed on Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) pyramidal neurons in acute tissue slices of the mouse hippocampus. Neurons were filled with the sodium-sensitive fluorescent dye SBFI through the patch-pipette, and multi-photon excitation of SBFI enabled the visualization of dendrites and adjacent spines. To establish UV-induced focal uncaging, several parameters including light intensity, volume affected by the UV uncaging beam, positioning of the beam as well as concentration of the caged compound were tested and optimized. Our results show that local perfusion with caged glutamate (MNI-Glutamate) and its focal UV-uncaging result in inward currents and sodium transients in dendrites and spines. Time course and amplitude of both inward currents and sodium signals correlate with the duration of the uncaging pulse. Furthermore, our results show that intracellular sodium signals are blocked in the presence of blockers for ionotropic glutamate receptors, demonstrating that they are mediated by sodium influx though this pathway. In summary, our method provides a reliable tool for the investigation of intracellular sodium signals induced by focal receptor activation in intact brain tissue.

We describe the combination of focal UV-induced photo-activation of neuro-active compounds with whole-cell patch-clamp and multi-photon imaging of intracellular sodium transients in dendrites and spines of hippocampal neurons in acute tissue slices of the mouse brain.

רב פוטון תאית נתרן הדמיה בשילוב עם משחרר רפרוף מיקוד בתיווך UV של גלוטמט בCA1 פירמידת נוירונים

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Calcium Imaging in Neurons

Calcium ions play an integral role in neuron function: They act as intracellular signals that can elicit responses such as altered gene expression and neurotransmitter release from synaptic vesicles. Within the cell, calcium concentration is highly dynamic due to the presence of pumps that selectively transport these ions in response to a variety of signals. Calcium imaging takes advantage of intracellular calcium flux to directly visualize calcium signaling in living neurons.This video begins with an overview of the key reagents used for this technique, known as calcium indicator dyes. The discussion includes an introduction to the commonly used dye Fura-2 and some basic principles behind how both ratiometric and non-ratiometric calcium indicators work. Next, a typical calcium imaging experiment is presented, from preparing the cells and dye to capturing and analyzing the fluorescent images. Finally, several experimental applications of calcium imaging are provided, such as the study of neuronal network activity and sensory processing.

Calcium Imaging in Neurons Using Fura-2

הדמיית סידן בתאי עצב

Calcium ions play an integral role in neuron function: They act as intracellular signals that can elicit responses such as altered gene expression and ...