אנו מודים לגב טס י. לאמייר, גב' רות פרנק וד ר מיכאל א. מוניק לעריכה והערות, וד ר ריודהי יאסין במקס פלאנק פלורידה לתוכנת הרכישה של 2pFLIM. עבודה זו נתמכת על ידי שני פרסי יוזמת המוח U01NS094247 (ז ו ט) ו R01NS104944 (ז ו ט), R01 המענק R01NS081071 (ט), ו R21 מענק R21NS097856 (ז). כל הפרסים הם מן המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ, ארצות הברית.

<ol>
	<li>Greengard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neurobiology+of+Slow+Synaptic+Transmission.">The Neurobiology of Slow Synaptic Transmission.</a> Science. 294 (5544), 1024-1030 (2001).</li><li>Petersen, S. E., Posner, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+attention+system+of+the+human+brain:+20+years+after.">The attention system of the human brain: 20 years after.</a> Annual Review of Neuroscience. 35 (2), 73-89 (2012).</li><li>Sun, Y., Hunt, S., Sah, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norepinephrine+and+Corticotropin-Releasing+Hormone:+Partners+in+the+Neural+Circuits+that+Underpin+Stress+and+Anxiety.">Norepinephrine and Corticotropin-Releasing Hormone: Partners in the Neural Circuits that Underpin Stress and Anxiety.</a> Neuron. 87 (3), 468-470 (2015).</li><li>Berke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+dopamine+mean?.">What does dopamine mean?.</a> Nature Neuroscience. 21 (6), 787-793 (2018).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+G&#945;q-Coupled+Neuromodulator+Receptors+Activate+Protein+Kinase+A.">Endogenous G&#945;q-Coupled Neuromodulator Receptors Activate Protein Kinase A.</a> Neuron. 96 (5), 1070-1083 (2017).</li><li>Madison, D. V., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+adenosine+3&#8217;,5&#8217;-monophosphate+mediates+beta-receptor+actions+of+noradrenaline+in+rat+hippocampal+pyramidal+cells.">Cyclic adenosine 3&#8217;,5&#8217;-monophosphate mediates beta-receptor actions of noradrenaline in rat hippocampal pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 372 (1), 245-259 (1986).</li><li>Yasuda, H., Barth, A. L., Stellwagen, D., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+signaling+cascades+for+LTP+induction.">A developmental switch in the signaling cascades for LTP induction.</a> Nature Neuroscience. 6 (1), 15-16 (2003).</li><li>Pedarzani, P., Storm, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKA+mediates+the+effects+of+monoamine+transmitters+on+the+K++current+underlying+the+slow+spike+frequency+adaptation+in+hippocampal+neurons.">PKA mediates the effects of monoamine transmitters on the K+ current underlying the slow spike frequency adaptation in hippocampal neurons.</a> Neuron. 11 (6), 1023-1035 (1993).</li><li>Brandon, E. P., Idzerda, R. L., McKnight, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKA+isoforms,+neural+pathways,+and+behaviour:+making+the+connection.">PKA isoforms, neural pathways, and behaviour: making the connection.</a> Current Opinion in Neurobiology. 7 (3), 397-403 (1997).</li><li>Radnikow, G., Feldmeyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-+and+Cell+Type-Specific+Modulation+of+Excitatory+Neuronal+Activity+in+the+Neocortex.">Layer- and Cell Type-Specific Modulation of Excitatory Neuronal Activity in the Neocortex.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12 (January), (2018).</li><li>Kennedy, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+trends+in+in+vivo+neurochemical+monitoring+by+microdialysis.">Emerging trends in in vivo neurochemical monitoring by microdialysis.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 17 (5), 860-867 (2013).</li><li>Rodeberg, N. T., Sandberg, S. G., Johnson, J. A., Phillips, P. E. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hitchhiker&#8217;s+Guide+to+Voltammetry:+Acute+and+Chronic+Electrodes+for+In+Vivo+Fast-Scan+Cyclic+Voltammetry.">Hitchhiker&#8217;s Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for In Vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry.</a> ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 221-234 (2017).</li><li>Hamel, E. J. O., Grewe, B. F., Parker, J. G., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+level+brain+imaging+in+behaving+mammals:+An+engineering+approach.">Cellular level brain imaging in behaving mammals: An engineering approach.</a> Neuron. 86 (1), 140-159 (2015).</li><li>Allen, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+dynamics+of+protein+kinase+A+activity+visualized+by+FRET-based+reporters.">Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 348 (2), 716-721 (2006).</li><li>Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+reporters+of+protein+kinase+A+activity+reveal+impact+of+substrate+tethering.">Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14997-15002 (2001).</li><li>Chen, Y., Saulnier, J. L., Yellen, G., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PKA+activity+sensor+for+quantitative+analysis+of+endogenous+GPCR+signaling+via+2-photon+FRET-FLIM+imaging.">A PKA activity sensor for quantitative analysis of endogenous GPCR signaling via 2-photon FRET-FLIM imaging.</a> Frontiers in Pharmacology. 5 (April), 1-12 (2014).</li><li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Highly+Sensitive+A-Kinase+Activity+Reporter+for+Imaging+Neuromodulatory+Events+in+Awake+Mice.">A Highly Sensitive A-Kinase Activity Reporter for Imaging Neuromodulatory Events in Awake Mice.</a> Neuron. 99 (4), 665-679 (2018).</li><li>Yellen, G., Mongeon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+two-photon+imaging+of+fluorescent+biosensors.">Quantitative two-photon imaging of fluorescent biosensors.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 27, 24-30 (2015).</li><li>Tang, S., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ERK+and+PKA+Activation+in+Single+Dendritic+Spines+during+Structural+Plasticity.">Imaging ERK and PKA Activation in Single Dendritic Spines during Structural Plasticity.</a> Neuron. 93 (6), 1315-1324 (2017).</li><li>Tillo, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liberated+PKA+Catalytic+Subunits+Associate+with+the+Membrane+via+Myristoylation+to+Preferentially+Phosphorylate+Membrane+Substrates.">Liberated PKA Catalytic Subunits Associate with the Membrane via Myristoylation to Preferentially Phosphorylate Membrane Substrates.</a> Cell Reports. 19 (3), 617-629 (2017).</li><li>Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+spatiotemporal+dynamics+of+neuronal+signaling+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy.">Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> Current Opinion in Neurobiology. 16 (5), 551-561 (2006).</li><li>Theurkauf, W. E., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+cAMP-dependent+protein+kinase+bound+to+microtubule-associated+protein+2.">Molecular characterization of the cAMP-dependent protein kinase bound to microtubule-associated protein 2.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (6), 3284-3290 (1982).</li><li>Zhong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+dynamics+of+type+II+PKA+in+neurons.">Subcellular dynamics of type II PKA in neurons.</a> Neuron. 62 (3), 363-374 (2009).</li><li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation.">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 151-158 (2005).</li><li>Baumgart, J., Baumgart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortex-,+Hippocampus-,+Thalamus-,+Hypothalamus-,+Lateral+Septal+Nucleus-+and+Striatum-specific+In+utero+Electroporation+in+the+C57BL/6+Mouse.">Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53303 (2016).</li><li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+Injection+of+Adeno-associated+Viral+Vectors.">Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), 1-4 (2010).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (12), 18-19 (2008).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Murakoshi, H., Lee, S. J., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+and+quantitative+FRET-FLIM+imaging+in+single+dendritic+spines+using+improved+non-radiative+YFP.">Highly sensitive and quantitative FRET-FLIM imaging in single dendritic spines using improved non-radiative YFP.</a> Brain Cell Biology. 36 (1-4), 31-42 (2008).</li><li>Murakoshi, H., Shibata, A. C. E., Nakahata, Y., Nabekura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dark+green+fluorescent+protein+as+an+acceptor+for+measurement+of+F&#246;rster+resonance+energy+transfer.">A dark green fluorescent protein as an acceptor for measurement of F&#246;rster resonance energy transfer.</a> Scientific Reports. 5, 1-11 (2015).</li><li>Guo, Z. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+behavioral+experiments+in+head-fixed+mice.">Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice.</a> PLoS ONE. 9 (2), (2014).</li><li>Yu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+amygdala+controls+learning+in+the+lateral+amygdala.">The central amygdala controls learning in the lateral amygdala.</a> Nature Neuroscience. 20 (12), 1680-1685 (2017).</li><li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation.">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li><li>Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+signaling+using+two-photon+fluorescent+lifetime+imaging+microscopy.">Imaging intracellular signaling using two-photon fluorescent lifetime imaging microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 7 (11), 1121-1128 (2012).</li><li>Mehta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-fluorophore+biosensors+for+sensitive+and+multiplexed+detection+of+signalling+activities.">Single-fluorophore biosensors for sensitive and multiplexed detection of signalling activities.</a> Nature Cell Biology. 20 (10), 1215-1225 (2018).</li></ol>

. למחברים אין מה לגלות

פרוטוקול זה מדגים את השימוש של חיישן-FLIM מחיישנים tAKARα כדי להמחיש את הפעילות העצבית-הפעלת PKA פעולה בראש-קבוע עכברים התנהגות. יישום זה מבוסס על בדיקות נרחבות ומאפיין של tAKARα ב מבחנה ובvivo להפגין כי האות FLIM שהושג הוא רלוונטי לאירועים נוירומודולטיים פיזיולוגיים17. כאן, אחד ביישום vivo,...

הנגיף העצבי, הידוע גם כשידור הסינפטית איטי, מטיל שליטה חזקה על תפקוד המוח במהלך מצבים התנהגותיים שונים, כגון לחץ, עוררות, תשומת לב, ו תנועה1,2,3, 4. למרות חשיבותו, המחקר של מתי והיכן מתרחשים אירועים נוירומודולטוריים הוא עדיין בחיתוליו. נוירואומודולטורים, כולל אצטילכולין, דופמין, נוראדרנלין, סרוטונין, ונוירופפטידים רבים, להפעיל את G חלבון מצמידים קולטנים (GPCRs), אשר בתורו ההדק תאיים מסלולים השני עם חלון רחב של צירי זמן ועד משניות לשעות. בעוד כל מטפל עצבי מפעיל קבוצה ברורה של אירועים איתות, המחנה/חלבון קינאז a (pka) מסלול הוא מסלול מצוי במורד הזרם עבור הרבה נוירומודולטורים1,5. מסלול המחנה/pka מווסת את היכולות הנוירואליות, העברת הסינפטית והפלסטיות6,7,8,9, ולכן, מנגינות את הדינמיקה של רשת עצבית. מכיוון נוירונים שונים או סוגים עצביים לבטא סוגים שונים או רמות של קולטני עצבי מחדש10, את ההשפעות התאיים של אותו מיאואואואואואואואואואואואואואואוטור זהה עשוי להיות הטרוגנית על פני נוירונים שונים, ולכן, צריך להיות למדה ברזולוציה תאית. עד היום, הוא נשאר מאתגר לפקח על אירועים נוירומודולאליים בנוירונים בודדים בvivo במהלך ההתנהגות.
כדי ללמוד את הדינמיקה הטמפורלית של הנוירומודולציה, נדרש מודאליות של הקלטה מתאימה. מיקרודיאליזה ומחזורי סריקה מחזורית משמשים לעתים קרובות כדי ללמוד שחרור של נוירומודולטורים, אבל הם חסרים את הרזולוציה המרחבית לפקח על אירועים סלולריים11,12. מקבילה לדינמיקה של סידן בשימוש כפרוקסי לפעילות החשמלית העצבית בדימות האוכלוסייה13, הדמיה pka עשוי לשמש כדי לקרוא את האירועים הנוירומודולדיטוריים ברחבי האוכלוסייה העצבית ברזולוציה התאית. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השימוש בכתבת הפעילות המשופרת של א-קינאז (AKAR) כדי לפקח על פעילויות ה-PKA בvivo במהלך התנהגות בעלי חיים. השיטה המתוארת כאן מאפשרת הדמיה בו של אוכלוסיות נירואליות ברזולוציה תת-תאית עם רזולוציה טמפורלית שעוקבת אחר אירועים נוירומודולטוריים פיזיולוגיים.
Akars מורכב מתורם ו לקבלה חלבונים פלואורסצנטי המקושרים על ידי pka זירחון המצע פפטיד ו forkhead הקשורים (fha) התחום הנקשר סרין זרחנת או טראונין של המצע14,15. עם הפעלת מסלול PKA, פפטיד המצע של AKAR הוא זרחי. כתוצאה מכך, התחום FHA נקשר את פפטיד המצע זרחני, ובכך להביא את שני fluorophores לסמיכות, המכונה מצב סגור של AKAR. המצב הסגור של AKAR זרחט מגדיל את העברת האנרגיה של התהודה המוגברת (למעלה) בין התורם לבין הקבלה. מאז שיעור של akars זרחמיים קשורה לרמה של פעילות pka16, את כמות הסריג במדגם ביולוגי ניתן להשתמש כדי לכמת את הרמה של פעילות pka16,17,18, 19,20.
גרסאות מוקדמות של AKARs תוכננו בעיקר עבור שני צבע הדמיה טימטרי14. כאשר הדמיה עמוקה יותר לרקמת המוח, השיטה הטיברמטרית סובלת מעיוות האותות בשל פיזור אור באורך הגל17,18,21. כפי שמתואר להלן, מיקרוסקופ הדמיה של תקופת החיים הפלואורסצנטית (flim) מבטלת את הבעיה כי flim רק מודד פוטונים הנפלטים על ידי fluorophore התורם18,21. כתוצאה מכך, הקוונפיקציה של הפלימטר של הסריג אינה מושפעת מעומק הרקמה17. בנוסף, "כהה" (כלומר, תשואה קוונטית נמוכה [QY]) המשתנה של הקבלה fluorophore ניתן להשתמש. פעולה זו משחררת ערוץ צבע כדי להקל על מדידת מדידה של תכונות נוירואליות אורתוגונאליות באמצעות הדמיה בו של חיישן שני או מסמן מורפולוגי17,19,20.
הדמיה FLIM לכמת את הזמן כי fluorophore מבלה במצב נרגש, כלומר, החיים הפלואורסצנטית18. שובו של פלואור למדינת הקרקע, ולכן סופו של המדינה הנרגשת, לעתים קרובות מקשר עם פליטת פוטון. למרות פליטת פוטון עבור מולקולה נרגש בודדים הוא סטוכסטי, באוכלוסייה החיים מרושע הזריחה הוא מאפיין של fluorophore מסוים. כאשר אוכלוסייה טהורה של fluorophores מתרגש בו זמנית, הזריחה המתקבלת יהיה לאחר ריקבון מעריכי אחד. קבוע הזמן של ריקבון מעריכי זה מתאים לאורך חיים הזריחה הממוצע, אשר בדרך כלל נע בין אחד לארבע ננושניות עבור חלבונים פלואורסצנטי. שובו של התורם הנלהב fluorophore למדינה הקרקע יכול להתרחש גם על ידי לדאוג. בנוכחות של לדאוג, החיים הפלואורסצנטית של התורם fluorophore מופחת. האקארים הבלתי זרחנים מציגים. אורך חיים של התורמים הארוכים יותר עם זרחון על ידי PKA, החיישן מציג חיים קצרים יותר כי התורם ואת הקבלה fluorophores הובאו זה לזה, והוא מוגבר. הקוונפיקציה של החיים הפלואורסצנטית באוכלוסייה של AKARs ולכן מייצגת את רמת פעילות PKA.
גירסאות מוקדמות של AKARs לא השתמשו בהצלחה עבור הדמיה vivo ברזולוציה תא יחיד. זה נובע בעיקר משרעת האות נמוך של חיישני AKAR להפעלות פיזיולוגיות17. לאחרונה, על ידי השוואת באופן שיטתי חיישני AKAR זמינים עבור שני פוטון הדמיה מיקרוסקופ גלגול החיים (2pFLIM), חיישן שנקרא FLIM-AKAR נמצא כדי להערים על חיישנים חלופיים. יתר על כן, סדרה של משתני flim-akar שנקרא akar ממוקד (takars) פותחו כדי להמחיש פעילות pka במיקומים משניים ספציפיים: microtubules (takarα), ציטוסול (tAKARβ), אקטין (tAKARδ), filamentous אקטין (tAKARε), קרום (tAKARγ), וצפיפות פוסט-סינפטית (tAKARζ). בין טאטרים, takarα הגדילה את משרעת האות הרוויח על ידי נוראדרנלין על ידי 2.7-קיפול. זה מתאים עם הידע כי רוב pka בנוירונים מעוגנת microtubules במצב מנוחה22,23. tAKARα היה האמן הטוב ביותר בין AKARs קיימים עבור 2pFLIM. יתר על כן, tAKARα זיהה פעילות מבחינה פיזיולוגית הרלוונטית PKA הרוויח על ידי נוירומודולטורים מרובים, ואת הביטוי של tAKARα לא לשנות פונקציות נוירואליות17.
לאחרונה, tAKARα השתמשו בהצלחה כדי להמחיש את הפעילויות PKA בראש קבוע עכברים התנהגות17. זה הוכח כי נאכף תנועה המופעל הפעילות pka בסומה של נוירונים בשכבה שטחית (שכבה 1 עד 3, עד עומק של ~ 300 יקרומטר מ pia) ב מנוע, חבית, ויזואלית מערבולות. פעילות PKA תנועה המופעל היה חלק תלוי על איתות באמצעות קולטנים β-אדרררגיות ו קולטני דופמין D1, אבל לא הושפע על ידי היריב D2 הקולטן הדופמין. עבודה זו ממחישה את היכולת של tAKARs לעקוב אחר אירועים נוירומודולליות בvivo באמצעות 2pFLIM.
בפרוטוקול הנוכחי, השיטה כולה לדימות פעילות PKA בעכברים הערים קבועים בראש במהלך פרדיגמה תנועה נאכף מתואר בשישה שלבים. ראשית, תוספת של יכולות 2pFLIM למיקרוסקופ רגיל 2-פוטון (איור 1). שנית, בניית הליכון ממונע (איור 2). שלישית, הביטוי של חיישן tAKARα בקליפת העכבר על ידי אלקטרופורציה של הרחם (IUE) של ה-DNA, או הזרקת סטריאוטקאית של וירוס הקשורים adeno (AAV). פרוטוקולים מצוינים עבור ניתוחים של iue24,25 והזרקת סטריאוטקאית של חלקיקים ויראלי26 פורסמו בעבר. הפרמטרים המרכזיים שבהם השתמשנו מתוארים להלן. . קדימה, התקנת חלון גולגולת פרוטוקולים מצוינים פורסמו בעבר עבור ניתוח חלון הגולגולת27,28. מתוארים מספר שלבים ששונו מהפרוטוקולים הסטנדרטיים. . חמישית, מופיעה בvivo 2pFLIM שישית, הניתוח של התמונות 2pFLIM (איור 3 ואיור 4). גישה זו צריכה להיות ישימה בקלות רבים אחרים בראש קבוע התנהגות ושטחים המוח.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m cellulose acetate syringe filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>190-2520</td>
			<td>Step 3.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16x 0.8 NA water-immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRP07220</td>
			<td>Step 5.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-pin cable</td>
			<td>US digital</td>
			<td>CA-MIC3-SH-NC</td>
			<td>Step 2.5. To connect rotation sensor to the DAQ input of the microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum bread board</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB1012</td>
			<td>Step 2.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnimalTracker MATLAB software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 2.5 and sections 5 - 6. Will be provided upon request to the lead author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass barrier filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET500-40m</td>
			<td>Step 1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Step 2.4. Used as mount for rotation sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon steel burrs for micro drill, 0.5 mm tip diameter</td>
			<td>FST</td>
			<td>19007-05</td>
			<td>Steps 3.2.3. and 4.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular coverslip (5mm diameter)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101413-528</td>
			<td>Step 4.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made injection needle holder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 3.2.4. Technical details provided upon request to the lead author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental acrylic</td>
			<td>Yates Motloid</td>
			<td>44114</td>
			<td>Steps 4.3. and 4.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill; Microtorque ii</td>
			<td>Ram products</td>
			<td>66699</td>
			<td>Steps 3.2.3. and 4.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dowsil transparent polymer</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>3-4680</td>
			<td>Step 4.5. Artificial dura</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation electrode</td>
			<td>Bex</td>
			<td>LF650P5</td>
			<td>Step 3.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bex</td>
			<td>CUY21</td>
			<td>Step 3.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green FCF</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>Step 3.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIMimage MATLAB software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Section 5. Kindly provided by Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIMview MATLAB software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sections 5. and 6. Will be provided upon request to the lead author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam-compatible glue (Gorilla White Glue)</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>5201204</td>
			<td>Step 2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headplate</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 4.3. Technical details provided upon request to the lead author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headplate holder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 2.6. Technical details provided upon request lead author, used in combination with mounting post bracket and right-angled bracket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydraulic micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MO-10</td>
			<td>Step 3.2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy glue</td>
			<td>Krazy glue</td>
			<td>KG82648R</td>
			<td>Step 4.3. Cyanoacrylate-based glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-noise fast photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H7422PA-40 or H10769PA-40</td>
			<td>Step 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB 2012b</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Steps 2.6, and sections 5, and 6. Used to run microscope acquisition and data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motor</td>
			<td>Zhengke</td>
			<td>ZGA37RG</td>
			<td>Step 2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motor speed controller</td>
			<td>Elenker</td>
			<td>EK-G00015A1-1</td>
			<td>Step 2.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micromanipulator</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-285</td>
			<td>Step 3.2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA1S</td>
			<td>Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with PH4 and TR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P14</td>
			<td>Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with PB2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting post base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PB2</td>
			<td>Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with P14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting post bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>C1515</td>
			<td>Step 2.6. Used in combination with right-angle bracket and headplate holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR2</td>
			<td>Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and PH4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>&#925;/&#913;</td>
			<td>&#925;/&#913;</td>
			<td>Step 3.2.2. Protocol: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FDS010</td>
			<td>Step 1.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon timing counting module</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td>SPC-150</td>
			<td>Step 1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid: tAKAR&#945; (CAG-tAKAR&#945;-WPRE)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>119913</td>
			<td>Step 3.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post holder</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH4</td>
			<td>Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and TR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AB90</td>
			<td>Step 2.6 Used in combination with mounting post bracket and headplate holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotation sensor</td>
			<td>US digital</td>
			<td>MA3-A10-250-N</td>
			<td>Step 2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber mat</td>
			<td>Rubber-Cal</td>
			<td>B01DCR5LUG</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaft coupling (1/4 inch x 1/4 inch)</td>
			<td>McMaster</td>
			<td>6208K433</td>
			<td>Steps 2.3. and 2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage 3.6</td>
			<td>Svoboda Lab/Vidrio Technology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Steps 5.9. and 6.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal splitter</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td>HPM-CON-02</td>
			<td>Step 1.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel axle (diameter 1/4 inch, L = 12 inch)</td>
			<td>McMaster</td>
			<td>1327K66</td>
			<td>Step 2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic alignment systsem</td>
			<td>David kopf</td>
			<td>1900</td>
			<td>Steps 3.2. and 4.1. modified; Sutter micromanipulator, custom-made injection needle holder, hydraulic micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Section 5. Built based on Modular in vivo multiphoton microscopy system (MIMMS) from HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>14006</td>
			<td>Step 3.2.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus: tAKAR&#945; (AAV2/1 hSyn-tAKAR&#945;-WPRE)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>119921</td>
			<td>Step 3.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White PE foam roller (8 x 12 inch)</td>
			<td>Fabrication enterprises INC.</td>
			<td>30-2261</td>
			<td>Step 2.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White polystyrene fom ball halves</td>
			<td>GrahamSweet</td>
			<td>200mm diameter 2 hollow halves</td>
			<td>Step 2.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zipkicker</td>
			<td>PACER</td>
			<td>PT29</td>
			<td>Step 4.3. Hardening accelerator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing protein kinase a activity in head-fixed behaving mice using in vivo two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy

הנוירואומודולציה מפעילה שליטה. חזקה על תפקוד המוח בעיות נוירולוגיות ופסיכיאטריות. למרות החשיבות שלהם, טכנולוגיות למעקב אחר אירועים נוירומודולטוריים עם רזולוציה תאית רק מתחילים להופיע. נוירומודולטיות, כגון דופמין, נוראדרנלין, אצטילכולין, וסרוטונין, ההדק אירועים תאיים מאותת באמצעות משולב חלבון G שלהם קולטנים כדי לווסת את היכולת הנוירולית, תקשורת סינפטית, ועוד עצבי ובכך להסדיר את עיבוד המידע ברשת העצבית. הנוירומודולטורים שהוזכרו לעיל מתכנסים אל המסלול של המחנה/חלבון קינאז A (PKA). לכן, ב vivo PKA הדמיה עם רזולוציה תא יחיד פותחה כבדיקה עבור אירועים נוירומודולאליות באופן אנלוגי לדימות סידן לפעילויות חשמל עצבי. להלן, שיטה מוצגת כדי להמחיש פעילות PKA ברמה של נוירונים בודדים בקליפת הראש-קבוע עכברים מתנהגים. לשם כך, נעשה שימוש בכתב משופר מבית א-קינאז (AKAR), הקרוי tAKARα, המבוסס על העברת אנרגיית תהודה של Förster (לדאוג). זה חיישן ה-pka מקודד גנטית הוא הציג לתוך קליפת המנוע באמצעות אלקטרופורציה הרחם (iue) של DNA פלמידים, או הזרקה סטריאוטקטית של וירוס הקשורים adeno (aav). שינויי השימוש בשיטת הצילום הם הדמיה באמצעות שני פוטון מיקרוסקופ גלגול החיים (2pFLIM), אשר מציע יתרונות על פני מדידות מחדש של מדידת מדידה עבור לכמת את האות ברקמת המוח פיזור אור. כדי ללמוד פעילויות PKA במהלך תנועה נאכף, tAKARα היא התמונה באמצעות חלון הגולגולת כרונית מעל קליפת הראש של הערה, הראשי קבוע עכברים, אשר לרוץ או לנוח על מהירות מבוקרת ממונע הליכון. גישה זו הדמיה יחולו על אזורים רבים אחרים במוח כדי ללמוד התנהגות הנגרמת המושרה פעילויות PKA ועל חיישנים אחרים מבוססי FLIM מבוסס על הדמיה vivo.

החיישנים מאפשרים הדמיה של מסלולים רבים ושונים של אותות, כולל מסלול המחנה/PKA המעורב במניפולציה עצבית. הפרוטוקול הנוכחי מנצל את חיישן tAKARα שפותחה לאחרונה בשילוב עם 2pFLIM כדי להמחיש את פעילויות PKA לתוך הראש קבוע עכברים התנהגות. ניתן לשדרג את רוב שני הפוטונים הקיימים באמצעות יכ...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy at JoVE.com

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

הליך זה מוצג להמחיש החלבון קינאז פעילות בעכברים קבועים ומתנהגים. כתבת הפעילות המשופרת של א-קינאז, tAKARα, מתבטאת בנוירונים בקליפת הגולגולת והפכה לנגישה להדמיה דרך חלון גולגולתי. מיקרוסקופ הדמיה של שני פוטון באורך החיים משמש כדי להמחיש פעילויות PKA ב vivo במהלך תנועה נאכף.

ויזואליזציה של חלבון קינאז פעילות בראש-קבוע עכברים התנהגות באמצעות Vivo Two-פוטון מיקרוסקופ החיים הדמיה מיקרונטית

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...

השיטה שלנו משתמשת קינאז חלבון חדש חיישן בשם יעד כתב פעילות קינאז אלפא, או tAKAR

visualizing-protein-kinase-activity-head-fixed-behaving-mice-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K Views.  Oregon Health & Science University. השיטה שלנו משתמשת קינאז חלבון חדש חיישן בשם יעד כתב פעילות קינאז אלפא, או tAKAR

Video: Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

בתחום ההדמיה vivo של חוט השדרה בעזרת עכבר דו פוטון מיקרוסקופית

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

בVivo שני פוטונים מיקרוסקופית של קצות עצבים בודדים בעור

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

שני פוטונים<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

אין ויוו שני הפוטונים הדמיה של נוירונים בקליפת המוח בעכברים Neonatal

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Evaluation and Manipulation of Neural Activity Using Two-Photon Holographic Microscopy

Recent advances in optical bioimaging and optogenetics have enabled the visualization and manipulation of biological phenomena, including cellular activities, in living animals. In the field of neuroscience, detailed neural activity related to brain functions, such as learning and memory, has now been revealed, and it has become feasible to artificially manipulate this activity to express brain functions. However, the conventional evaluation of neural activity by two-photon Ca2+ imaging has the problem of low temporal resolution. In addition, manipulation of neural activity by conventional optogenetics through the optic fiber can only simultaneously regulate the activity of neurons with the same genetic background, making it difficult to control the activity of individual neurons. To solve this issue, we recently developed a microscope with a high spatiotemporal resolution for biological applications by combining optogenetics with digital holographic technology that can modify femtosecond infrared laser beams. Here, we describe protocols for the visualization, evaluation, and manipulation of neural activity, including the preparation of samples and operation of a two-photon holographic microscope (Figure 1). These protocols provide accurate spatiotemporal information on neural activity, which may be useful for elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that lead to abnormalities in neural activity.

We developed a two-photon holographic microscope that can visualize, assess, and manipulate neural activity using high spatiotemporal resolution, with the aim of elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that are associated with abnormal neural activity.

הערכה ומניפולציה של פעילות עצבית באמצעות מיקרוסקופיה הולוגרפית דו-פוטונית

Recent advances in optical bioimaging and optogenetics have enabled the visualization and manipulation of biological phenomena, including cellular ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the other hand, two-photon imaging can resolve the activity of local neural circuits at the single-cell level. It is critical to make a large cranial window to perform multiple-scale analysis using both imaging techniques in the same mouse. To achieve this, one must remove a large section of the skull and cover the exposed cortical surface with transparent materials. Previously, glass skulls and polymer-based cranial windows have been developed for this purpose, but these materials are not easily fabricated. The present protocol describes a simple method for making a large cranial window consisting of commercially available polyvinylidene chloride (PVDC) wrapping film, a transparent silicone plug, and a cover glass. For imaging the dorsal surface of an entire hemisphere, the window size was approximately 6 x 3 mm2. Severe brain vibrations were not observed regardless of such a large window. Importantly, the condition of the brain surface did not deteriorate for more than one month. Wide-field imaging of a mouse expressing a genetically-encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6f, specifically in astrocytes, revealed synchronized responses in a few millimeters. Two-photon imaging of the same mouse showed prominent calcium responses in individual astrocytes over several seconds. Furthermore, a thin layer of an adeno-associated virus was applied to the PVDC film and successfully expressed GECI in cortical neurons over the cranial window. This technique is reliable and cost-effective for making a large cranial window and facilitates the investigation of the neural and glial dynamics and their interactions during behavior at the macroscopic and microscopic levels.

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

The present protocol describes making a large (6 x 3 mm2) cranial window using food wrap, transparent silicone, and cover glass. This cranial window allows in vivo wide-field and two-photon calcium imaging experiments in the same mouse.

אין ויוו הדמיית סידן בשדה רחב ושני פוטונים מעכבר באמצעות חלון גולגולתי גדול

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

מעקב אחר התנהגות ודפוס פעילות עצבית במוח הקדמי של דגי הזברה

Two-Photon Calcium Imaging of Forebrain Activity in Behaving Adult Zebrafish

Adult zebrafish (Danio rerio) exhibit a rich repertoire of behaviors for studying cognitive functions. They also have a miniature brain that can be used for measuring activities across brain regions through optical imaging methods. However, reports on the recording of brain activity in behaving adult zebrafish have been scarce. The present study describes procedures to perform two-photon calcium imaging in the dorsal forebrain of adult zebrafish. We focus on steps to restrain adult zebrafish from moving their heads, which provides stability that enables laser scanning imaging of the brain activity. The head-restrained animals can freely move their body parts and breathe without aids. The procedure aims to shorten the time of head restraint surgery, minimize brain motion, and maximize the number of neurons recorded. A setup for presenting an immersive visual environment during calcium imaging is also described here, which can be used to study neural correlates underlying visually triggered behaviors.

מחבר זרקור: התקדמות בחקר המוח של דגי זברה בוגרים 

Here, we present a protocol to perform two-photon calcium imaging in the dorsal forebrain of adult zebrafish.

הדמיית סידן דו-פוטון של פעילות המוח הקדמי בדגי זברה בוגרים

Adult zebrafish (Danio rerio) exhibit a rich repertoire of behaviors for studying cognitive functions. They also have a miniature brain that can be used ...