מטרת פרוטוקול זה היא ליצור קו זבוב ערוך אנדוגני. אנו מראים חלבון פלואורסצנטי כדוגמה, אבל זה יכול להיות מיושם גם על נוק-אין אחרים, נוקאאוט, כמו גם יצירת מוטציות. הפרוטוקול שלנו הוא שיטה מבוססת רקומבינציה הומולוגית CRISPR, כך שאין כמעט הגבלה על אתרי מוטציות.
יתר על כן, הפרוטוקול שלנו צמצם מאוד את הזמן והמאמץ הכרוכים בשלבי גנוטיפ. כדי להתחיל, פתחו את אתר Fly CRISPR כדי לעצב sgRNA עבור דרוזופילה, והזינו כ-100 רצפי זוגות בסיסים סביב מיקום הדפיקה הרצוי. בחרו יעדי CRISPR עם האפשרות 'חמש גואנין מובחרות'.
לחץ על הלחצן Find CRISPR targets כדי ליצור רשימה של רצפי sgRNA אפשריים. לאחר מכן לחץ על לחצן ההערכה עבור כל רצף, ובחר שני sgRNA שיש להם אפס מטרות מחוץ ליעד. מכיוון שרמות ביטוי החלבון הטבעיות הן בדרך כלל נמוכות בהרבה, בחרו תגים פלואורסצנטיים בהירים וניתנים לצילום, והתאימו למערך הניסוי.
לאחר מכן, עצבו מקשר כדי לקשר תגי אפיטופ לסמן הפלואורסצנטי לצורך ניתוח ביוכימי. השתמשו בפפטיד מקשר המכיל בין שתיים ל-20 חומצות אמינו, המכילות חומצות אמינו כמו גליצין וסרין. כדי לתכנן את וקטור התורם לדרוזופילה, ארגנו את רצף הדנ"א של הפפטיד המקשר ואת התג הפלואורסצנטי, וודאו רצפים הומולוגיים משני הקצוות.
שנה את כל רצפי PAM בתוך פלסמיד התורם כדי לשמור על רצף חומצות האמינו של החלבונים המתקבלים. לאחר מכן, מקם את קודוני ההתחלה והעצירה בהתאם למיקום התג. לתיוג פנימי, ודא שהתג הפלואורסצנטי נמצא במסגרת עם רצף הקידוד של גן היעד.
לתיוג N-terminus, מקם את התג הפלואורסצנטי אחרי קודון ההתחלה האנדוגני. לתיוג C-terminus, מקם את התג הפלואורסצנטי לפני קודון העצירה הטבעי. הקפד לשמור רק קודון התחלה אחד כדי למנוע בעיות תרגום פוטנציאליות.
השתמש בגישת השיבוט החלופית המבוססת על אנזים הגבלה כדי להכניס את רצף sgRNA לפלסמיד פלסמיד U6 Bbs1-chiRNA. לאחר יצירת פלסמיד sgRNA, הפוך את הפלסמיד ב- DH5-Alpha Escherichia coli בהתאם להוראות היצרן. אמת את השיבוטים המתקבלים באמצעות ריצוף Sanger, באמצעות פריימרים לריצוף סטנדרטי T3 או T7.
כדי ליצור את פלסמיד התורם, השתמש בדנ"א דו-גדילי עם הרצף הרצוי, ושלב אותו באתר השיבוט המרובים השלילי של פלסמיד Bluesript 2SK. רצף את פלסמיד התורם כדי להבטיח שרצפי sgRNA או PAM משתנים כראוי ואין SNPs נוכחים בפלסמיד. לאחר מכן, קח זבובי Cas9 המוזרקים עם gRNA בנוי פלסמידים תורם.
מרדימים את הזבובים בפחמן דו חמצני, ומפרידים בין זבובים זכרים לנקבות בתולות. כדי לבסס צלבי זבובים, זיווג כל זכר G zero עם לפחות שתי נקבות בתולות FM7L בבקבוקוני מזון CT צרים בודדים. הניחו בקבוקונים מוצלבים באינקובטור מאוורר הנשמר בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ולחות של 60% עד שטיסות F1 נסגרות.
לאחר מכן הרדימו ואספו לפחות 10 צאצאים נקבות בתולות משני הצלבים הזכריים והנקביים של G zero. ודא שכל זבוב F1 מתויג עם פרטי ההורות שלו ומאוחסן בנפרד. כדי לסנן זבובים עבור PCR, תכננו פריימרים עם טמפרטורת התכה של כ-55 מעלות צלזיוס המקיפים את אתר העריכה של גן המטרה.
הכינו חיץ ליזיס לכל דגימת זבוב, ושחררו 10 מיקרוליטר לכל באר של צלחת PCR 96 באר. שמור על החיץ בטמפרטורה קרה במהלך תהליך דיסקציה של הרגל. לאחר מכן, להכין צינורות נימי זכוכית, מילוי קצה אחד עם מזון אגר סוכרוז.
מניחים צינורות אלה בצלחת באר עמוקה 96, המכונה מלון הזבוב. לדיסקציה של הרגליים, מקמו את משטח ההרדמה של פחמן דו חמצני מתחת למיקרוסקופ סטריאו. מרדימים זבוב מועמד, וכורתים את אחת מרגליו האמצעיות.
לאחר מכן, לטבול את הרגל לתוך חיץ ליזיס. החזיקו את כנף הזבוב בעזרת זוג מלקחיים עדינים ממתכת. העבירו את הזבוב למלון הזבובים, ואטמו מיד את הצינור בחוט.
אכלסו את מלון הזבובים באינקובטור מאוורר המתוחזק בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ו-60% לחות. השקיעו את הרגליים הכרותות בתמיסת חיץ הליזיס במחזור תרמי. ארגן את תגובת ה- PCR לפי הוראות היצרן, באמצעות 1.5 מיקרוליטר של רגל הזבוב ליזט כמקור ה- DNA.
יש להעביר את מוצרי ה-PCR לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז, ולפרש את התוצאות על סמך גודל הרצועה. בהתבסס על תוצאות הג'ל, בחרו את הזבובים החיוביים ממלון הזבובים והצליבו אותם בנפרד עם זבובי איזון כדי לייצר את דור ה-F2. השתמש במניות הומוזיגוטיות לריצוף Sanger של אתר העריכה כדי להבטיח דיוק.
הצלבה אחורית של קווי זבובים מאומתים עם זבובים מסוג בר כדי להסיר מוטציות רקע. מסך כל דור באמצעות פרוטוקול PCR על רגל אחת. תמונות מיקרוסקופ קונפוקלי של מוחות דרוזופילה בוגרים הראו חלבון תקופתי מאורגן במוקדים גרעיניים דיסקרטיים לאורך שעות הלילה המאוחרות ושעות הבוקר המוקדמות.
בסך הכל, פרוטוקול זה חזק אם פריימרים PCR גנוטיפ שלך הם ספציפיים.
