פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לזהות אם פעילות הקספז מתרחשת בשילוב עם מוות תאי, ובכך לזהות מצבים שונים של מוות תאי. היתרון של טכניקה זו הוא הגמישות להעריך את פעילות הקספז בבדיקה מבוססת אוכלוסייה או תא בודד. ידגימו את ההליך סטפני רופלי, בוגרת דוקטורט, וג'ינג טונג, דוקטורנטית אורחת מהמעבדה של וונדי ווי-לין וונג.
לאחר התמיינות וקצירת המקרופאגים שמקורם במח עצם או BMDMs כמתואר בכתב היד, זרעו אותם בצלחת בת שש בארות בצפיפות של אחד פי 10 עד התאים השישיים למיליליטר. טפל בתאים עם חיקוי SMAC במשך 16 שעות. כדי להכין את התא ליזט, להעביר את הצלחת המכילה תאים מטופלים על הקרח ולאסוף את התווך תרבית התא לתוך צינור 1.5 מיליליטר.
צנטריפוגה ב 300 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. שואפים את המדיום ומניחים את הצינור על קרח. לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של PBS קר לצלחת תרבית התאים כדי לשטוף את התאים.
לאחר שאיפת כל PBS, להוסיף 100 מיקרוליטר של טריפסין לתאים. לאחר ניתוק התאים מהצלחת, אספו אותם לתוך צינור 1.5 מיליליטר. לאחר צנטריפוגה של מתלה התא, להסיר את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 100 מיקרוליטר דיסק ליזה חיץ .
דגרו את הדגימה על קרח במשך 20 דקות ולאחר מכן צנטריפוגו את הליזט כדי להניע את החלק הבלתי מסיס. מעבירים 25 מיקרוליטר ליזט לצלחת לבנה בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות עבור בדיקת הפעילות קספאז-3/7 ו-10 מיקרוליטר לצלחת שקופה בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות עבור בדיקת חומצה ביכומונית או BCA. לכימות חלבונים, הכינו טווח של ריכוזי אלבומין או BSA בסרום בקר כחלבון סטנדרטי.
לאחר הוספת BSA סטנדרטי לצלחת בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות המכילה את הדגימות, ערבבו את ריאגנטי BCA אחד ושניים ביחס של 50 לאחד והוסיפו 200 מיקרוליטר ממנו לכל דגימה בתקן. לאחר הדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, מודדים את הספיגה ב-562 ננומטר במכשיר פלואורומטרי ומכמתים את ריכוז החלבון עם העקומה הסטנדרטית. כדי לבצע בדיקת אוכלוסייה, הפעל את המכשיר הפלואורומטרי וחמם את המכונה ל -30 מעלות צלזיוס.
הגדר את אורך גל העירור והפליטה על 360 ו 465 ננומטר בהתאמה. לאחר מכן הכינו תערובת תגובה ראשית על קרח כמתואר בכתב היד כדי לקבוע את פעילות הקספז. הוסף 75 מיקרוליטר של תערובת לכל דגימה ותקן כדי לקבל נפח תגובה כולל של 100 מיקרוליטר.
מדוד מיד את הפלואורסצנטיות באמצעות הגדרת המכשיר הפלואורומטרי והקלט קריאות בודדות כל דקה במשך 40 דקות כדי לקבוע את קינטיקה התגובה. לאחר הזריעה, קצרו את התאים הדבקים כפי שהודגם קודם לכן לתוך צינור פוליסטירן של חמישה מיליליטר. לאחר מכן צנטריפוגו את הדגימה ב-300 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, והוציאו את הסופרנטנט.
כדי להכין את תערובת הצביעה, לקחת מיקרוליטר אחד של המצע פלואורוגני ולדלל אותו עם 150 מיקרוליטר של PBS. מוסיפים 50 מיקרוליטר תערובת כתמים לדגימה, דוגרים עליה בחושך בחום של 37 מעלות למשך 30 דקות ומערבבים כל 15 דקות. בבדיקה מבוססת אוכלוסייה זו, הנתונים המייצגים של הבדיקה הקינטית לפעילות קספאז-3/7 הראו פיצול מצע מוגבר עם ריכוז חיקוי SMAC מוגבר.
עם זאת, העלייה בריכוז של 500 ננו-מולרית לא הייתה משמעותית בהתבסס על ANOVA חד-כיווני רגיל עם השוואות מרובות. ניתוח פעילות קספאז-3/7 באמצעות ציטומטריית זרימה הצביע על שינוי בפלואורסצנטיות של התאים שטופלו במימטיקת SMAC בהשוואה לתאים שלא טופלו, דבר שניכר גם בעוצמת הפלואורסצנטיות החציונית המשורטטת והעלייה בריכוז של 500 ננו-מולרית הייתה משמעותית. ההליך צריך להתבצע על קרח.
עם זאת, בבדיקות מבוססות אוכלוסייה, לא ניתן להשאיר דגימות על הקרח ללא הגבלת זמן. לאחר שלב הליזיס, יש לעבד את הדגימות או להקפיא אותן באופן מיידי. הדמיה של פעילות הקספז באמצעות מיקרוסקופ תאים חיים תהיה שיטה נוספת להשגת מידע קינטי ברמת התא הבודד.
