מטריקה שיטת הצביעה של פעילות ציטראט סינתאז בדרוזופילה מלאנוסטר

דרוסופילה משמשת כמערכת מודל טובה לחקר תפקוד המיטוכונדריאלי. כאן אנו מציגים פרוטוקול למדידת פעילות סינתאז ציטראט ברקמות הומוגניות מזבובים בוגרים. פרוטוקול זה אינו דורש בידוד של המיטוכונדריה.

הוא מהיר ופשוט והוא מתאים למדידת פעילות סינתאז ציטראט בזחלים, תאים מתורבתים ורקמות יונקים. התחל על ידי איסוף זבובים למבוגרים עבור כל מדגם, הקפד לאסוף לפחות דגימות טריפליקאט עבור כל גנוטיפ. הכינו 500 מיקרוליטרים של חיץ מיצוי קר כקרח עם 20 מילימולרים HEPES, EDTA מילימולר אחד ו-0.1% טריטון X-100 במבחנה של 1.5 מיליליטר לכל דגימה.

מרדים את זבובי המבוגר עם פחמן דו חמצני על משטח הרדמה. כדי לבודד את בית החזה, לתקן אותם עם זוג מ forceps ולבודד את הבטן זבוב על ידי חיתוך לאורך הגבול של בית החזה והבטן עם זוג מספריים. לאסוף את בית החזה לטוס עבור פעילות סינתאז ציטראט.

מעבירים 10 בית חזה זבובים למבוגרים ל-100 מיקרוליטרים של חיץ מיצוי קר כקרח מיד ומפיצים אותם עם עלה על הקרח. שמור את הדגימות קרות על ידי הומוגניזציה במשך חמש עד 10 שניות על קרח, לתת להם לשבת על קרח במשך חמש שניות, ואז לחזור עד שכל הרקמות הומוגני לחלוטין. Aliquot 10 microliters של כל מדגם הומוגני לתוך צינור חדש למדידת תוכן חלבון, שמירה על צינורות אלה על קרח גם כן.

הוסיפו 400 מיקרוליטרים של חיץ מיצוי קר כקרח לכל דגימה שנותרה לנפח כולל של 500 מיקרוליטרים ופיגט למעלה ולמטה כדי לערבב. עבור כל תגובה, יש להוסיף מיקרוליטר אחד של ליסק תאים מדולל ל-150 מיקרוליטרים של פתרון התגובה הטרי. מערבבים היטב על ידי צינורות בעדינות, הקפדה על הימנעות היווצרות בועה, ולאחר מכן להשתמש בקורא צלחת כדי למדוד את הספיגה ב 412 ננומטר כל 10 עד 30 שניות במשך ארבע דקות ב 25 מעלות צלזיוס.

התווה את הנתונים כספיגה לאורך זמן ולאחר מכן חשב את השיפוע עבור החלק ליניארי של העקומה. לבסוף, לחלק את קצב התגובה או השיפוע על ידי ריכוז החלבון מדגם לנרמל את פעילות סינתאז ציטראט. ההשערה הייתה כי הפלה של dRNF34 בשריר Drosophila יגדיל את פעילות ציטראט המיטוכונדריאלי סינתאז בעוד נוקאאוט של dPGC-1 יהפוך עלייה זו.

קצב אנזימטי ליניארי ראשוני נקבע עבור כל בדיקה;מדרונות קווי המגמה מייצגים את שיעורי התגובה המקסימליים המקבילים לפעילויות הסינתאז המקסימליות של הגנוטיפים השונים. פעילויות הסינתאז המקסימליות של ציטראט חושבו מהעיקולים הקינטיים ונורמלו על ידי ריכוז החלבון. התוצאות הראו כי פעילות הסינתאז של בית החזה זבוב אכן גדל עם שריר ספציפי dRNF34 להפיל את הגידול היה הפוך על ידי שריר ספציפי dPGC-1 להפיל.

כאשר homogenizing את המדגם, חשוב להטות את הצינור ולבדוק את homogenate כדי לוודא כי אין קרישי דם, כי הרקמות בצינור הם הומוגני לחלוטין. לאחר איסוף הדגימה, יש לבצע את כל הטיפולים לדוגמה על הקרח. המוצ"ש של פעילות הסינתאז משמש לכימות מסה מיטוכונדרית שלמה.

כימות נכון של מסה מיטוכונדרית שלמה חשוב מאוד להערכת תפקוד המיטוכונדריאלי.