המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לאפיין ביוכימית tRNA-Isopentenyl Transferase פעילות במבחנה. שיטה זו שימושית עבור זיהוי ואפיון במבחנה של פעילות tRNA-isopentenyl transferase של אנזימים רקומביננטיים מטוהרים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה חקירה פשוטה וישירה המשמשת לגילוי שינוי RNA קווולנטי.
למרות שיטה זו מספקת תובנה לפעילות tRNA-isopentenyl transferase, זה פוטנציאל הסתגלות לאפיון ביוכימי של מגוון רחב או RNA שינוי אנזימים. הצעד הראשון בהליך זה הוא לנקות ביסודיות את צלחות הזכוכית שישמשו ליציקת הג'ל. לשטוף את הצלחות עם מים וסבון, לשטוף היטב עם מים deionized, ולאחר מכן לנקות את הצלחות עם isopropanol ומגבונים ללא מוך.
לאחר מכן, להרכיב את הצלחות ואת הרווחים. מערבבים את הבאים reagents לעשות 100 מיליליטר 20%אקרילאמיד, 7.5 אוריאה טוחנת, 1x ג'ל TBE. 80 מיליליטר של תרכיז ג'ל אוריאה, 10 מיליליטר של דילואנט ג'ל אוריאה, ו -10 מיליליטר של חיץ ג'ל אוריאה.
הוסיפו לתערובת 40 מיקרוליטרים של T-med ו-800 מיקרוליטרים של 10%אמוניום. משוך את פתרון הג'ל למזרק גדול וחלוק את ת פתרון הג'ל בין צלחות הזכוכית הקשה על הזכוכית תוך חלוקת הפתרון למניעת היווצרות בועה. אפשרו לג'ל להתגבש בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
לאחר הג'ל התגבש, לשתול את הג'ל על מנגנון ג'ל אנכי. מלא את תאי המאגר העליונים והתחתון ב- TBE אחד. שעתיים לפני טעינת הג'ל, יש להפעיל מראש את הג'ל ב-20 מיליאמפר למשך שעתיים כדי לאפשר לגבול החיץ לצאת ולהפעיל את האויגונוקלאוטידים הקטנים ביותר.
הכינו כל תגובה למבחן isopentenylation RNA בנפח סופי של 17 מיקרוליטרים. הוסף לכל צינור 50 מילימול טריס-HCl, pH 7.2, 1.2 מילימולאר ATP, 5.8 מילימולר מגנזיום כלוריד, 0.2 מילימולאר DMAPP, 10 יחידות מעכב RNase, 40, 000 CPM פנימי 32P שכותרתו RNA, 5.3 מיקרומולרי Mod5, ו 1.2 מילימולר 2-mercapetol. דגירה התגובות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
לאחר שעה אחת, אתנול לזרז את RNase באמצעות 2.5 נפח של 100%אתנול ו 1/10 נפח של 3.5 נתרן טוחן אצטט pH 5.5, ומניחים אותו שלילי 20 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת בלילה. לאחר מכן, צנטריפוגה דגימות RNA ב 15, 400 גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. בזהירות להסיר את supernatant ולשטוף כל גלולת RNA עם 500 microliters של 70% אתנול.
צנטריפוגה הדגימות ב15, 400 גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. בזהירות להסיר את supernatant ואוויר לייבש את כדורי RNA במשך 15 דקות או עד שכל אתנול התאדה. הבא להשעות מחדש כל גלולת RNA ב 10 microliters של שמונה אוריאה טוחנת.
הוסיפו 150 יחידות של RNase T1 לכל דגימה ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. ביום שלמחרת, הוסף שני מיקרוליטרים של מאגר טעינה פי 6 לכל דגימה. טען 10 מיקרוליטרים של כל דגימת RNA על ג'ל אוריאה טרום ריצה, 20% פוליאקרילמיד, 7.5 ג'ל אוריאה טוחן.
תריץ את הג'ל ב-25 מיליאמפר למשך שעתיים. לאחר שעתיים, להפסיק את האלקטרופורזה ולהסיר את הג'ל מן המנגנון. שוברים את החותם בין שתי צלחות הזכוכית ומסירים בזהירות את אחת מצלחות הזכוכית עם הג'ל שנותר על כל אחת מהצלחות.
מניחים שכבה של ניילון נצמד מעל הג'ל וחושפים על מסך זרחן במשך שלוש שעות. פרוטוקול זה מזהה באופן אמין isopentenylation של שאריות tRNA קנוניות ולא קאנוניות ששונו על ידי S.cerevisiae isopentenyl tranferase Mod5. בדוגמה זו טירוסין tRNA היה מסומן באופן פנימי עם 32P-אדנוסין ו Mod5 היה דגירה עם RNase בנוכחות או היעדר DMAPP.
RNAs מתעכלים עם RNase T1 ונפתרו על ג'ל פוליאקרילמיד denaturing. Mod5 משנה את השאריות החזויות בנוכחות DMAPP ומצוין על ידי 10 נוקלאוטיד שהוזז, אדנוסין משולש המכיל שבר בעמדות נוקליאוסיד 36 עד 38 מכילים שבר בטירוסין tRNA. Adenosine שונה 37 מתגורר מצוין עם כוכבית.
באופן דומה כאשר tRNA סרין הוא דגירה עם Mod5 ו DMAPP, משמרת מלאה של 10 אדנוסין משולש נוקלאוטיד המכיל שבר בעמדת נוקליאוסייד 36 עד 38 הוא ציין. מעניין, תזוזה חלקית של שבר נוקלאוטיד שבע הוא ציין כי אינו מכיל את אדנוזין משולש המכיל שבר בעמדות nucleoside 36 עד 38, מה שמרמז כי אדנוסין משולש המכיל שבר במיקום nucleoside 36 עד 38 רצף ומבנה לא יכול להידרש עבור Mod5 פעילות במבחנה. לאחר השליטה בטכניקה זו ייקח שעתיים, ארבע עד שש שעות ימים אם היא מבוצעת כראוי.
ובכן מנסה הליך זה חשוב לזכור לשמור ולפקח על השלמות של RNA, כי השפלה RNA יכול להשפיע על שינוי RNA יהיה לבלבל פרשנות נתונים. בעקבות הליך זה מחקרים מוטציה באמצעות האנזים שלך של עניין, ניתן לעשות כדי לקבוע שאריות ספציפיות או תחומים הדרושים לפעילות אנזימטית. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של RNA, לומר פעילויות tRNA-isopentenyl transferase של אנזימים פרוקריוטיים ואיקריוטיים.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לבצע את הפרוטוקול לגילוי של פעילות isopentenyl transferase של האנזים שלך של עניין. אל תשכח כי עבודה עם רדיואקטיביות יכול להיות מסוכן מאוד אמצעי זהירות כגון לבישת PPE תקין, באמצעות מיגון נאות, סילוק רדיואקטיביות כראוי תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.
