ברצוננו להודות כל הקודם חברי המעבדה Bouchier-הייז שתרמו להתפתחות של טכניקה זו. עבודה זו מומן בחלקו על ידי פרס טייס בילדים בבית החולים לילדים טקסס אנא צרו קשר. אנו מודים צ'אנדרה Joya (MD אנדרסון, יוסטון, טקסס) על הרשאה לכלול נתונים לאור בשיתוף עם הצוות שלה. התפתחות ריאגנטים תיאר נתמך על ידי Cytometry התא מיון הליבה ביילור לרפואה במימון NIH (NIAID P30AI036211, NCI P30CA125123 ו NCRR S10RR024574), הסיוע של ג'ואל מ Sederstrom

1. הכנת התאים ומנות תרבות
הערה: בצע את שלבים 1-3 בשכונה זרימה שכבתית תרביות רקמה. ללבוש כפפות.
<ol><li>אם באמצעות כלי הזכוכית התחתונה, מעיל הזכוכית עם fibronectin. לדלג על שלב 1.2 אם משתמש מנות פלסטיק.<ol>
<li>להפוך את פתרון 0.1 מ"ג/מ"ל של fibronectin: למהול 1 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל fibronectin פתרון 9 מ ל 1 X PBS.</li>
		<li>מכסים קרקעית זכוכית בכל טוב עם 0.5-1 מ ל fibronectin דגירה למשך 1-5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>באמצעות פיפטה של, לאסוף את הפתרון fibronectin ולאחסן ב 4 º C. הערה: הפתרון fibronectin חוזר מספר פעמים.</li>
		<li>לשטוף את הכוס פעם אחת עם 1-2 מ ל 1 X PBS, וארוקן את PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>צלחת עונה 1 פרק 105 תאים לכל טוב של צלחת 6-ובכן ב- 2 מ של התא המתאים תרבות המדיה (ראה טבלה 1 עבור מספרי הטלפון הנייד לשימוש עבור בארות בגדלים שונים). אם משתמש קו תא stably שיבטא את הרכיבים BiFC קספאז (ראה דיון), צלחת 2 x 105 תאים והמשך לשלב טיפול (שלב 3).</li>
	<li>אפשר לדבוק המנה בין לילה ב 37 ° C בחממה תרביות רקמה תאים.</li>
</ol>2. תקנים של תאים כדי להציג את הרכיבים BiFC קספאז
<ol><li>Transfect תאים עם תרביות תאים המתאימים הכימית. הערה: פרוטוקול זה מתווה את ההוראות עבור Lipofectamine 2000, אשר הותאם מבחינת רעילות מינימלית. פרוטוקול זה שימש בהצלחה הלה תאים, התאים MCF7, תאים LN18. אם משתמשים נוספים תרביות תאים ריאגנטים בצע הוראות היצרן ולמטב כנדרש.<ol>
<li>להוסיף µL 12 מהתרכובת תרביות תאים µL 750 של התקשורת מופחת סרום צינור סטרילי.</li>
		<li>דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.</li>
		<li>להוסיף 10 ng של פלסמיד כתב (פלסמיד קידוד חלבון פלואורסצנטי, למשל אדום חלבון פלואורסצנטי [RFP], זה יהיה תווית התאים transfected) לרכבת התחתית mL 1.5 סטרילי עבור כל טוב להיות transfected.</li>
		<li>הוסף 20 ng של כל פלסמיד BiFC קספאז (למשל, 20 ng של קספאז-2 prodomain [C2 Pro]-VC ו- 20 ng של C2 Pro-VN) כדי כל שפופרת (טבלה 2).</li>
		<li>להביא כל שפופרת עד הנפח הכולל של 100 µL על-ידי הוספת מדיה מופחת סרום.</li>
		<li>בעזרת פיפטה p200, להוסיף 100 µL של תרביות תאים ריאגנט פתרון משלב 2.1.2 לתערובת פלסמיד באופן dropwise.</li>
		<li>דגירה המיקס ריאגנט פלסמיד-תקנים עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>תשאף התקשורת מן התאים באמצעות פיפטה או עם יניקה, לאחר מכן, באמצעות פיפטה p1000, פיפטה 800 µL מדיה פנויה סרום בעדינות במורד הצד של הבאר.</li>
		<li>באמצעות פיפטה p200, להוסיף 200 µL של המתחם הדי-השומנים dropwise כל טוב.</li>
		<li>דגירה התאים חממה תרביות רקמה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.</li>
		<li>מטפל לא לשבש את טפט, להסיר את התקשורת החופשית סרום המכיל את מתחמי ה-DNA-השומנים על ידי השאיפה באמצעות שאיבה או עם פיפטה.</li>
		<li>פיפטה 2 מיליליטר ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס) מדיה צמיחה מלאה בעדינות במורד הצד של כל טוב.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס חממה תרביות רקמה במשך 24-48 שעות עבור ביטוי חלבון אופטימלי.</li>
</ol>3. אינדוקציה של קספאז הפעלת
<ol><li>לטפל עם תרופות או גירוי שגורם קספאז הפעלה כ 24 פוסט-תקנים h.<ol>
<li>הוסף הריכוז הרצויה של הסם מראש חימם (37 מעלות צלזיוס) הדמיה מדיה (מדיה צמיחה מלאה בתוספת Hepes [20 מ מ, pH 7.2-7.5] ומרקפטואתנול [מיקרומטר 55]), לערבב בעדינות (טבלה 3).</li>
		<li>תשאף התקשורת מן התאים באמצעות פיפטה או עם יניקה, לאחר מכן, באמצעות פיפטה של, פיפטה 2 מ"ל של הפתרון של 3.1.1 בעדינות במורד הצד של הבאר.</li>
		<li>הוסף מדיה הדמיה ללא התרופה באר אחת כפקד של לא מטופל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה התאים חממה תרביות רקמה ב 37 ° C או להמשיך 4.3 שלב עבור ניסוי זמן לשגות.</li>
</ol>4. BiFC קספאז קירור והקפאה
<ol><li>
BiFC קספאז עבור רכישת נקודת זמן יחיד
	<ol>
<li>הפעל את המיקרוסקופ ואת מקור אור פלורסנט ההוראות של היצרן.</li>
		<li>למצוא את התאים תחת מסנן RFP ו להתמקד פלורסצנטיות ג'ין הכתב.</li>
		<li>באמצעות מונה יד-טלי, לספור את כל התאים RFP-חיוביות בשדה הראייה. להקליט את המספר.</li>
		<li>תוך שמירה על visual באותו השדה, להחליף מסנן GFP (או מסנן YFP אם הוא זמין), באמצעות מונה יד-טלי, לספור את מספר כדוריות אדומות שהם גם ירוק (ונוס-חיוביים). מעבר הלוך ושוב בין שני מסננים כדי לוודא כי רק כדוריות אדומות מחושבת עבור ונוס-חיוביות. להקליט את המספר (איור 3).</li>
		<li>ספירת לפחות 100 תאים RFP-חיוביות מכל שלושה תחומים נפרדים של הצלחת.</li>
		<li>בכל אזור, לחשב את אחוז ונוס-חיוביות transfected תאים (קרי אדום תאים שהם גם ירוק). ממוצע האחוזים המתקבלת כדי לקבל את סטיית התקן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הדמיה תלת-ממדית של קספאז BiFC
	<ol>
<li>הפעל המיקרוסקופ ההוראות של היצרן ולאחר ההשקה רכישת התוכנה.</li>
		<li>בחר את x 60 או המטרה שמן x 63 ומניחים טיפת שמן על המטרה</li>
		<li>המקום המנה תרבות על הבמה מיקרוסקופ באמצעות בעל לוחית הנכון.</li>
		<li>באמצעות מקור אור epifluorescence ואת היצירה עין המיקרוסקופ או לייזרים קונאפוקלית או מסך המחשב, נווט אל שדה עניין.</li>
		<li>מתמקדים קרינה פלואורסצנטית הכתב באמצעות לייזר RFP או המסנן.</li>
		<li>אם epifluorescence שימש עד לנקודה זו, מקור האור לעבור לייזרים קונאפוקלית והמחש תמונה חיה של התאים שנרכשו על ידי המצלמה, המוצג על ידי רכישת תוכנת על מסך המחשב.</li>
		<li>באמצעות הפקד ג'ויסטיק ואת הגלגל המוקד, לכוונן את המוקד והמיקום התאים כך התאים נמצאים במרכז התצוגה מהבורר. בחר תאים מופרדים אחד מהשני, לא חופפות.</li>
		<li>קלט את עוצמת הלייזר אחוז כדי 50% וזמן החשיפה ב-100 מילישניות עבור ונוס ו- RFP כנקודת התחלה כדי לקבוע את ההגדרות האופטימליות לשימוש עבור הניסוי.</li>
		<li>להפעיל את לכידת חיות ולבדוק את התמונה המתקבלת, היסטוגרמות התצוגה המלווה את שני הערוצים.</li>
		<li>אם האות הוא נמוך, התמונה היא קשה להתמזמז להגדיל אחוזי לייזר הזמן כוח ו/או חשיפה בתוספות עד האות בתמונה נראה טוב.</li>
		<li>ודא כי האות לא מגיעים לרוויה. לבדוק את ההיסטוגרמה התצוגה כדי לוודא לשיא ברורים לעין כל עבור חיל הים. אם הפסגה מקיפה את הצגת היסטוגרמה כולו, קלט נמוך לייזר כוח החשיפה והגדרות (איור 2).</li>
		<li>דמיינו תאים שליטה (ללא טיפול או שאינם transfected) תחת באותם תנאים כדי להבטיח האות ספציפיים. הערה: transfectants צבע אחד יכול לשמש גם כדי לשלוט מוצלב, אך אם הסימנים במרחב נפרדות (למשל מיטוכונדריאלי לעומת cytosolic) זה לא נחוץ.</li>
		<li>בחר או לפתוח את המודול מחסנית Z בתוכנה מיקרוסקופ.</li>
		<li>באמצעות הידית המוקד, להעריך את מיקום מוקד התואם למרכז של התא.</li>
		<li>התאם את המוקד בכיוון אחד עד התא אינה גלויה, בחר באפשרות זו כמו המיקום העליון.</li>
		<li>התאם את המוקד בכיוון ההפוך עד התא הוא שוב אינו גלוי, בחר באפשרות זו גם מיקום התחתון.</li>
		<li>לבחור את גודל הצעד אופטימלית (בדרך כלל כ- 20 מיקרומטר) ולהתחיל הרכישה על מנת להנחות את המצלמה לקחת באופן אוטומטי תמונה אחת בכל אחד מהערוצים בכל אחד מהשלבים מיקרומטר 20 בין המיקומים העליונים והתחתונים.</li>
		<li>השתמש בתוכנת עיבוד תלת-ממד כדי לשחזר את התמונה תלת-ממד (איור 4סרט 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הדמיה בצילום מואץ של קספאז BiFC
	<ol>
<li>לפחות שעה לפני הניסוי, הפעלת המיקרוסקופ והגדר את הטמפרטורה 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>בחר 40 x, 60 x או המטרה שמן x 63 ומניחים טיפת שמן על המטרה.</li>
		<li>המקום המנה תרבות על הבמה מיקרוסקופ באמצעות בעל לוחית הנכון.</li>
		<li>אם מקור2 CO זמין, למקם התקן משלוח של2 CO (בדרך כלל פלקסיגלס מכסה מחובר הצינור המעביר את CO2) על גבי לוחית. הגדר CO2 רמת 5% והפעל את בקר2 CO מ בתוך התוכנה. אם מקור2 CO אינה זמינה, לכלול 20 מ מ Hepes להעברה למאגר המדיה.</li>
		<li>נווט אל שדה של תאים transfected והמחש תמונה חיה של התאים על ידי המצלמה, המוצג על-ידי רכישת התוכנה על גבי מסך המחשב באמצעות הלייזר RFP.</li>
		<li>בעקבות צעדים 4.2.8-4.2.12, קלט את ההגדרות עבור אחוז לייזר זמן כוח וחשיפה הלייזר RFP. לשמור ערכים אלה נמוך ככל האפשר תוך עדיין היכולת לזהות את האות פלורסנט.</li>
		<li>באמצעות פקד חיובי לטעום (ראו טבלה 3 לקבלת דוגמאות), עקוב אחר השלבים 4.2.8-4.2.12 קלט את ההגדרות בפעם אחוז לייזר כוח וחשיפה אור הלייזר YFP. לשמור ערכים אלה נמוך ככל האפשר תוך שהם עדיין יוכלו לזהות אות ונוס.</li>
		<li>כל טוב של הצלחת, בחר במספר תפקידים שונים המכילים תא אחד או יותר לבטא את הכתב.</li>
		<li>קלט את מרווח הזמן בין כל מסגרת של זמן לשגות, הכולל מספר מסגרות שיש לנקוט. ודא זמן לרכוש כל המיקומים שנבחרו לפני המסגרת הבאה היא שיש לנקוט.</li>
		<li>ביקור חוזר לכל תפקיד, לתקן ולעדכן את המוקד לפי הצורך.</li>
		<li>לתיקון להיסחף מוקד יכול לנבוע שינויי טמפרטורה או ויברציות חיצוני, להפעיל את המוקד להיסחף תיקון מערכת (אם זמין).</li>
		<li>להתחיל מואץ ולשמור את הנתונים.</li>
		<li>לנתח את הנתונים באמצעות תוכנות הדמיה זמינים (איור 52 סרט).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Salvesen, G. S., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+mechanisms.">Caspase mechanisms.</a> Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).</li><li>Boatright, K. M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+caspase+activation.">Mechanisms of caspase activation.</a> Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).</li><li>Luthi, A. U., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CASBAH:+a+searchable+database+of+caspase+substrates.">The CASBAH: a searchable database of caspase substrates.</a> Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).</li><li>Baliga, B. C., Read, S. H., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemical+mechanism+of+caspase-2+activation.">The biochemical mechanism of caspase-2 activation.</a> Cell Death Differ. 11 (11), 1234-1241 (2004).</li><li>Boatright, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+model+for+apical+caspase+activation.">A unified model for apical caspase activation.</a> Mol Cell. 11 (2), 529-541 (2003).</li><li>Aravind, L., Dixit, V. M., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+domains+of+death:+evolution+of+the+apoptosis+machinery.">The domains of death: evolution of the apoptosis machinery.</a> Trends Biochem Sci. 24 (2), 47-53 (1999).</li><li>Salvesen, G. S., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+activation:+the+induced-proximity+model.">Caspase activation: the induced-proximity model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 10964-10967 (1999).</li><li>Oberst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+dimerization+and+inducible+cleavage+reveal+a+requirement+for+both+processes+in+caspase-8+activation.">Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation.</a> J Biol Chem. 285 (22), 16632-16642 (2010).</li><li>Riedl, S. J., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+apoptosome:+signalling+platform+of+cell+death.">The apoptosome: signalling platform of cell death.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).</li><li>Kischkel, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity-dependent+APO-1+(Fas/CD95)-associated+proteins+form+a+death-inducing+signaling+complex+(DISC)+with+the+receptor.">Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor.</a> EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).</li><li>Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome:+a+molecular+platform+triggering+activation+of+inflammatory+caspases+and+processing+of+proIL-beta.">The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta.</a> Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).</li><li>Tinel, A., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PIDDosome,+a+protein+complex+implicated+in+activation+of+caspase-2+in+response+to+genotoxic+stress.">The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress.</a> Science. 304 (5672), 843-846 (2004).</li><li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions.">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).</li><li>Bouchier-Hayes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cytoplasmic+caspase-2+activation+by+induced+proximity.">Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity.</a> Mol Cell. 35 (6), 830-840 (2009).</li><li>Manzl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-2+activation+in+the+absence+of+PIDDosome+formation.">Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation.</a> J Cell Biol. 185 (2), 291-303 (2009).</li><li>Manzl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIDDosome-independent+tumor+suppression+by+Caspase-2.">PIDDosome-independent tumor suppression by Caspase-2.</a> Cell Death Differ. 19 (10), 1722-1732 (2012).</li><li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPM1+directs+PIDDosome-dependent+caspase-2+activation+in+the+nucleolus.">NPM1 directs PIDDosome-dependent caspase-2 activation in the nucleolus.</a> J Cell Biol. , (2017).</li><li>Sanders, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+inflammatory+caspase+dimerization+reveals+differential+recruitment+to+inflammasomes.">Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes.</a> Cell Death Dis. 6, e1813 (2015).</li><li>Aaronson, D. S., Horvath, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+road+map+for+those+who+don't+know+JAK-STAT.">A road map for those who don't know JAK-STAT.</a> Science. 296 (5573), 1653-1655 (2002).</li><li>Manton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cell+death+by+the+novel+proteasome+inhibitor+marizomib+in+glioblastoma+in+vitro+and+in+vivo.">Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo.</a> Sci Rep. 6, 18953 (2016).</li><li>Fan, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+mCherry+as+a+new+red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+for+visualizing+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).</li><li>Chu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+far-red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+that+allows+for+efficient+visualization+of+protein+interactions+under+physiological+conditions.">A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions.</a> Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).</li><li>Karbowski, M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+mitochondrial+morphology+in+healthy+cells+and+during+apoptosis.">Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis.</a> Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).</li><li>Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CARD+plays+a+critical+role+in+ASC+foci+formation+and+inflammasome+signalling.">The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling.</a> Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).</li><li>Szymczak, A. L., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+2A+peptide-based+strategies+in+the+design+of+multicistronic+vectors.">Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors.</a> Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).</li><li>Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdimer+processing+mechanism+of+procaspase-8+activation.">Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation.</a> EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).</li><li>Stennicke, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-9+can+be+activated+without+proteolytic+processing.">Caspase-9 can be activated without proteolytic processing.</a> J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).</li><li>Slee, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordering+the+cytochrome+c-initiated+caspase+cascade:+hierarchical+activation+of+caspases-2,+-3,+-6,+-7,+-8,+and+-10+in+a+caspase-9-dependent+manner.">Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner.</a> J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).</li><li>McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases:+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways.">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

משפחת פרוטאז קספאז ידועים שלהם תפקידים חיוניים אפופטוזיס, מולדת חסינות 1. בשל חשיבותם, קביעה מתי, היכן, באיזו מידת יעילות caspases ספציפי מופעלים יכול לספק תובנות מנגנוני קספאז מכריע הפעלה מסלולים. פרוטוקול מבוסס הדמיה המתוארים כאן מאפשר את החזיית בשלבים המוקדמים קספאז הפעלת המפל. טכניקה זו לוקח את היתרונות של אינטראקציות חלבון דינמי: הפעלת קספאז באותו כונן.
Caspases ניתן לחלק לשתי קבוצות: caspases המאתחל (קספאז-1,-2,-4,-5, -8,-9,-10 ו-12), את caspases התליין (קספאז-3,-6 ו-7). Caspases התליין נמצאים בתא כמו הדימרים preformed, מופעלים על-ידי פצילות בין יחידת משנה קטנים וגדולים 2. כשהוא מופעל, הם קליב חלבונים מבניים ותקינה רבים וכתוצאה מכך אפופטוזיס 3. Caspases המאתחל הן caspases הראשונה תופעל ב מסלול, בדרך כלל להפעיל את ההפעלה של caspases התליין. בניגוד caspases התליין, יוזם caspases מופעלים על ידי 4,dimerization5. Dimerization הזה הוא הקל על ידי גיוס של מונומרים לא פעיל כדי מתחמי משקל מולקולרי גדול ספציפי ידוע as פלטפורמות הפעלה. הרכבה של פלטפורמות הפעלה נשלטת על ידי סדרה של אינטראקציות חלבון: חלבון ספציפי. אלה מתווכת על ידי מוטיבים אינטראקציית חלבון שנשמרת נוכח proform של קספאז המאתחל, כוללים את תחום המוות (DD), תחום אפקטור מוות (DED) קספאז גיוס לתחום (כרטיס) 6 (איור 1 א'). פלטפורמות הפעלה כוללים בדרך כלל חלבון קולטן וחלבון של מתאם. הקולטן מופעל בדרך כלל בעת איגוד של ליגנד, וגורם לשינוי הסתגלותי המאפשר oligomerization של מולקולות רבות. הקולטן ואז גם מגייס את קספאז ישירות או מולקולות מתאם בתורו להביא את קספאז המתחם. לפיכך, מולקולות קספאז רבים להיכנס בסמיכות המתיר dimerization. זה נקרא את המודל של קרבה המושרה 7. ברגע dimerized, קספאז עובר עיבוד אוטומטי, אשר משמש כדי לייצב את האנזים פעיל 4,8. לדוגמה, הרכבה של apoptosome Apaf1 המופעלת על-ידי ציטוכרום c בעקבות השקתו של המיטוכונדריה בתהליך הקרוי הממברנה החיצונית מיטוכונדריאלי permeabilization (MOMP). Apaf1 מגייס בתורו קספאז-9 על-ידי אינטראקציה זה מתווך על ידי כרטיס נוכחות שני חלבונים 9. אינטראקציות חלבון דומה לגרום ההרכבה של CD95 המוות גרימת איתות מורכבים (דיסק) שמוביל הפעלה קספאז-8; PIDDosome, אשר ניתן להפעיל קספאז-2; מתחמי inflammasome שונים כי ליזום הפעלה קספאז-1 10,11,12. לפיכך, יוזם caspases מגויסים כדי פלטפורמות הפעלה ספציפית ע י מנגנון משותף וכתוצאה מכך מושרה הקרבה, dimerization, אשר בלעדיו לא יתרחש הפעלה.
קספאז ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה קרינה פלואורסצנטית (BiFC) הוא assay מבוססת הדמיה שפותחה כדי למדוד את זה הצעד הראשון בהפעלת caspases היוזם, ומאפשר פריט חזותי ישיר של הגיינה קספאז הנגרמת בעקבות הפעלת פלטפורמה הרכבה. שיטה זו מנצלת המאפיינים של החלבון הניאון פיצול ונוס. ונוס היא של יותר ויותר בהיר יותר photostable גירסה של חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) כי ניתן להפריד לשני מקטעים שאינם-פלורסנט, מעט חופפים: N-הסופית של נוגה (ונוס N או VN) ו- C-הסופית של נוגה (ונוס C או VC). קטעים אלה שומרים על היכולת לקפל ולהפוך פלורסנט כאשר אתה נמצא בסמיכות 13. כל שבר ונוס היא דבוקה prodomain של קספאז, המהווה החלק מינימלי של קספאז המאגד פלטפורמת הפעלה. פעולה זו מבטיחה כי caspases אינם שומרים על פעילות אנזימטיות, לכן ניתוח בו-זמניות של הזרם באירועים המשויכים אירועים אנדוגני הוא אפשרי. . ונוס קטעים לקפל כאשר prodomains קספאז גייסו פלטפורמת הפעלה ומבצעת קרבה המושרה. (איור 1B). קרינה פלואורסצנטית וכתוצאה מכך ונוס ניתן לעקוב במדויק, במיוחד ההתאמה subcellular, קינטיקה של, ואת היעילות של הרכבה של יוזם קספאז פלטפורמות הפעלה של תאים בודדים. הדמיה נתונים ניתן לרכוש על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית או על-ידי קרינה פלואורסצנטית רגילה במיקרוסקופ, ניתן להתאים מספר גישות מיקרוסקופיה שונים כולל: הדמיה בצילום מואץ כדי לעקוב אחר קספאז הפעלה בזמן אמת; הדמיה ברזולוציה גבוהה עבור מדויק ועיונם לוקליזציה subcellular; נקודת הקצה כימות של היעילות של ההפעלה.
שיטה זו פותחה לראשונה כדי לחקור את ההפעלה של קספאז-214. בעוד הפלטפורמה הפעלה קספאז-2 נחשב להיות PIDDosome, המורכב של הקולטן PIDD (חלבון p53-induced עם תחום המוות), את מתאם RAIDD (RIP-הקשורים ICH-1/CAD-3 הומולוגי חלבון עם תחום המוות), דווח PIDDosome תלויית הפעלה קספאז-2. הדבר מצביע על כי פלטפורמות הפעלה נוספים קספאז-2 קיימים 15,16. למרות הידיעה הרכיבים המלאה של פלטפורמת הפעלה קספאז-2, אפשרה קספאז טכניקה BiFC לחקירה מוצלחת של המסלולים איתות קספאז-2 של ה ברמה המולקולרית 14,17. אנחנו גם בהצלחה הסתגלו פרוטוקול זה עבור caspases דלקתיות (קספאז-1, ארבע,-5 ו-12) 18 , בעקרון, אותה גישה צריך להספיק באופן דומה לנתח את כל caspases יוזם הנותרים. פרוטוקול זה דומה יכול להיות מותאם כדי לחקור את המסלולים אחרות היו dimerization הוא אות הפעלת מרכזי. לדוגמה, חלבונים STAT מופעלים על ידי dimerization בעקבות זרחון יאנוס קינאז (JAK) 19. לפיכך, מערכת BiFC יכול לשמש כדי להמחיש הפעלת STAT, כמו גם משעולים רבים אחרים מוסדר על ידי אינטראקציות חלבון דינמי. פרוטוקול הבאים מספק הוראות מפורטות על כניסתה של הכתבים לתוך תאים, כמו גם שיטות עבור ייבוא תמונות וניתוח.

<table><tbody><tr><td>6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes</td><td>Mattek</td><td>P06G-1.5-20-F</td><td></td></tr><tr><td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein</td><td>Millipore</td><td>FC010-10MG</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma</td><td>D8537-6x500ML</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>OPTI MEM I</td><td>Invitrogen</td><td>31985088</td><td></td></tr><tr><td>C2-Pro VC plasmid</td><td>Addgene</td><td>49261</td><td></td></tr><tr><td>C2-Pro VN plasmid</td><td>Addgene</td><td>49262</td><td></td></tr><tr><td>Inflammatory caspase BiFC plasmids</td><td></td><td></td><td>available by request from LBH</td></tr><tr><td>HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components</td><td></td><td></td><td>available by request from LBH</td></tr><tr><td>DsRed mito plasmid</td><td>Clontech</td><td>632421</td><td>similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>2 Mercaptoethanol 1000X</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>q-VD-OPH</td><td>Apex Bio</td><td>A1901</td><td></td></tr></tbody></table>

lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation

משפחת קספאז של פרוטאזות ממלאים תפקידים חיוניים אפופטוזיס, מולדת חסינות. בין אלה, קבוצת משנה המכונה יוזם caspases הם הראשונים להיות מופעל בתוך המסלולים הללו. קבוצה זו כוללת קספאז-2-8, ו-9, וכן את caspases דלקתיות, קספאז-1, ארבע, ו-5. Caspases המאתחל כולם מופעלים על ידי dimerization בעקבות גיוס קומפלקסים multiprotein ספציפי שנקרא הפעלת פלטפורמות. קספאז ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה קרינה פלואורסצנטית (BiFC) היא גישה מבוססת הדמיה איפה לפצל חלבונים פלורסנט דבוקה יוזם caspases משמשים כדי להמחיש את גיוס יוזם caspases פלטפורמות הפעלה שלהם, וכתוצאה מכך הקרבה המושרה. קרינה פלואורסצנטית הזה מספק את הבדיקה של אחד השלבים המוקדמים הנדרשים להפעלת קספאז יוזם. שימוש במספר גישות שונות מבוסס מיקרוסקופיה, טכניקה זו יכולה לספק נתונים כמותיים על היעילות של קספאז הפעלה ברמת האוכלוסייה, כמו גם את קינטיקה של קספאז ההפעלה ואת גודל מספר קספאז מפעיל מתחמי על בסיס לכל תא.

דוגמה של קספאז-2 BiFC הנגרם על ידי נזק לדנ א מוצג באיור3. Camptothecin, טופואיזומראז אני מעכב, שימש לזירוז ההפעלה נזק וקספאז-2 ה-DNA. MCherry חלבון פלואורסצנטי אדום שימש ככתב להראות כי התאים להביע את המכשיר BiFC שיעזרו להמחיש את המספר הכולל של תאים. קרינה פלואורסצנטית וונוס מוצג בצבע ירוק ולייצג puncta גדול קספאז-2 המושרה קרבה. ניתן לספור תאים אלה כדי לקבוע את אחוז תאים ונוס-חיוביות. מסקנות לגבי לוקליזציה subcellular יכולים להתבצע גם מתמונות כאלה. בדוגמה המוצגת, קרבה המושרה קספאז-2 זוהה גם גרעינון. כמו הציטופלסמה 17. כדי לספק הדמיה ברזולוציה גבוהה של לוקליזציה subcellular של הפעלת קספאז מורכבים, תאים בודדים יכולים לדימות בשלושה ממדים. איור 4 מציג שתי דרכים לייצג את תמונות תלת-ממד כזה. הראשון הוא ליצור שחזור תלת-ממד של התא. הדוגמה מראה camptothecin-induced קספאז-2 BiFC גרעין באדום וירוק. שחזור תלת-ממד מראה לוקליזציה היחסי של שני fluorophores לאורך כל התאים. תוצאות תצוגה מסוג זה יעיל במיוחד כאשר מוצג בתור סרט, סיבוב התא סביב ציר יחיד (1 סרטים). הפאנל השני הוא הנוף אורתוגונלית באותו התא. פעולה זו מספקת את הפריט החזותי xy, xz yz ימאהה של התא בנקודה מסוימת בתא. תיאור של תוצאות באופן זה יכול להיות מתאים יותר על מצגת נייר כגון במאמר כמו זה קל יותר לפרש 3D הנתונים המוצגים בתבנית דו-ממדית. איור 5 מראה דוגמה של הדמיה בצילום מואץ של קספאז-2 BiFC בקו תא גליובלסטומה שטופלו של bortezomib מעכבי פרוטאוזום (ראה גם סרט 2). הגרף מראה את העלייה בעוצמת ונוס הממוצע בכל תא בממוצע על פני מספר תאים (הותאם מ -20). ניתן גם להציג סוג נתונים זה כמו מספר של תא בודד עקבות על גרף אחד. בדוגמה המוצגת, תחילתה של קספאז המושרה הקרבה הוא בערך 2 h לאחר הטיפול.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57316/57316fig1.jpg"> איור 1: סכימטי של קספאז מבנה ומתודולוגיה פלורסצנטיות ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה (BiFC). (א) מבנה כללי של קספאז היוזם. את subunits prodomain, גדולים וקטנים, מוטיב QACRG שנשמרת המכיל את אתר פעיל ציסטאין מתוארים. (B) BiFC משתמש פיצול פלורסנט חלבונים לבד אינם פלורסנט אך ניתן לשייך לבצע רפורמה המולקולה פלורסנט כאשר התמזגו חלבונים אינטראקציה. עבור קספאז BiFC, prodomain (Pro) או באורך מלא קספאז מותך לטרמינל-N חצי (ונוס-N), C-לתחנה המרכזית חצי (ונוס-C) של ונוס. כאשר הן מופיעות במצבן monomeric החלבונים פיוז'ן קספאז אינם פלורסנט. על הגיוס פלטפורמת הפעלה, כגון PIDDosome, כפי שמוצג להלן, איגוד של שני החצאים של ונוס נאכף המייצג קרבה קספאז המושרה הנמדדים כמו עלייה בזריחה נוגה. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57316/57316fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57316/57316fig2.jpg"> איור 2: תמונת הנציגה עבור זיהוי רוויה באמצעות הצגת היסטוגרמה. יוצגו דוגמאות של האופטימלית (החלונית העליונה) אותות רוויים (החלונית התחתונה). ונוס (שיא צהוב) ואת אותות RFP (שיא אדום) מוצגים. ציר ה-x מציינת בעוצמה, ציר ה-y היא מספר הפיקסלים. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57316/57316fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57316/57316fig3.jpg"> איור 3: קומפלמנטציה פלורסצנטיות ריאקציה דו-מולקולרית קספאז-2 (BiFC) בעקבות נזק לדנ א. הלה התאים לבטא את הרכיבים BiFC קספאז-2 היו עזבה ללא טיפול (א) או מטופלים עם camptothecin (100 מיקרומטר) (B) בנוכחות qVD-OPH (20 מיקרומטר). mCherry היה שותף ביטוי ככתב פלורסנט. להחליפן בתמונות יציג תאים (אדום) עם BiFC קספאז-2 (ירוק) בתאים שטופלו camptothecin 16 שעות לאחר הטיפול. סולם העמודות מייצגות 20 מיקרומטר. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57316/57316fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57316/57316fig4.jpg"> איור 4: לוקליזציה של זריחה ריאקציה דו-מולקולרית קספאז-2 קומפלמנטציה (BiFC). הלה תאים המבטאים את הרכיבים BiFC קספאז-2, כתבת גרעיני פלורסנט טופלו על-camptothecin (20 מיקרומטר) בנוכחות qVD-OPH (20 מיקרומטר). שחזורים תלת-ממדי מורכב מתמונות 0.1 μm טורי קונאפוקלית עד z-המטוס של התא נעשו לאחר 24 שעות ולהציג את הגרעין ב BiFC ואדום קספאז-2 בצבע ירוק. החלונית השמאלית מציגה את שחזור עיבוד הקרנה תלת-ממדי העוצמה המקסימלית (ראה גם סרט 1). הלוח נכון מציג את התצוגה אורתוגונלית פרוסות באותו התא. התיבה האמצעית (כחול) מישור xy , התיבה הימנית (צהוב) זה המטוס yz ימאהה , התיבה העליונה (לבן) זה המטוס xz . המטוסים yz ימאהה , xz מצטלבות על פי העדשה. סולם העמודות מייצגות 10 מיקרומטר. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57316/57316fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57316/57316fig5.jpg"> איור 5: בצילום מואץ של קספאז פלורסצנטיות ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה (BiFC) (א) LN18 גליובלסטומה תאים transfected עם הרכיבים BiFC קספאז-2, פלורסנט מיטוכונדריאלי סמן אדום (DsRed-mito, אדום) טופלו bortezomib (15 ננומטר) בנוכחות qVD-OPH (20 מיקרומטר). התאים הונחו על מיקרוסקופ קונפוקלי ב 37 מעלות צלזיוס, התמונות צולמו כל 2 דקות בשביל ה 8 תמונות של תאים נציג מהתוכנית זמן לשגות שתוצאתם המושרה הקרבה של שני הרכיבים BiFC קספאז-2 בגידול ונוס קרינה פלואורסצנטית ( ירוק) לאורך זמן. (ב') העוצמה הממוצעת של ונוס בכל תא בכל נקודה בזמן נמדדה. זריחה נוגה מוגברת לאורך זמן לאחר הטיפול bortezomib. חטיבת בפקד שאינו מטופל ציינו כי התנאים רעילות נמוכה או זניח של אור לייזר (איור משנת 20). גודל ברים מייצגים 20 מיקרומטר. קווי שגיאה לייצג את שגיאת התקן של הממוצע (SEM) 8 (בקרה) 14 (bortezomib) תאים בודדים (ראה גם סרט 2). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57316/57316fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>בגודל של צלחת</td>
			<td>מספר תאים</td>
			<td>נפח של המדיה</td>
		</tr>
<tr>
<td>6. ובכן לוחית רישוי</td>
			<td>עונה 1 פרק 105 תאים / טוב</td>
			<td>2 מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>12. ובכן לוחית רישוי</td>
			<td>5 x 104 תאים / טוב</td>
			<td>1 מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>24. ובכן לוחית רישוי</td>
			<td>2.5 x 104 תאים / טוב</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 הקאמרית המנה</td>
			<td>2.5 x 104 תאים / קאמרית</td>
			<td>1 מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>צלחת הקאמרית 8</td>
			<td>1.25 x 104 תאים / קאמרית</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: הנחיות מספר של תאים לצלחת. אם משתמש תאים stably לבטא את הרכיבים קומפלמנטציה (BiFC) של קספאז פלורסצנטיות ריאקציה דו-מולקולרית, צלחת כפול הסכומים המוצגים כאן.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>בגודל של צלחת</td>
			<td>ריאגנט תרביות תאים</td>
			<td>מדיה מופחת סרום</td>
			<td>כתב פלסמיד</td>
			<td>פלסמיד VC קספאז-pro</td>
			<td>פלסמיד VN קספאז-pro</td>
			<td>מופחת סרום מדיה שיתווספו פלסמיד מיקס</td>
			<td>תרביות תאים ריאגנט פתרון נוסף מיקס פלסמיד</td>
			<td>סרום מדיה פנויה נוספת לתאים</td>
		</tr>
<tr>
<td>6. ובכן לוחית רישוי</td>
			<td>פלטה/µL 12</td>
			<td>750 ΜL</td>
			<td>10 ng</td>
			<td>20 ng</td>
			<td>20 ng</td>
			<td>לסך 100 µL</td>
			<td>100 ΜL</td>
			<td>800 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>12. ובכן לוחית רישוי</td>
			<td>פלטה/µL 12</td>
			<td>750 ΜL</td>
			<td>5 ng</td>
			<td>10 ng</td>
			<td>10 ng</td>
			<td>לסך 50 µL</td>
			<td>50 ΜL</td>
			<td>400 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>24. ובכן לוחית רישוי</td>
			<td>פלטה/µL 12</td>
			<td>750 ΜL</td>
			<td>2.5 ng</td>
			<td>5 ng</td>
			<td>5 ng</td>
			<td>לסך 25 µL</td>
			<td>25 ΜL</td>
			<td>200 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 הקאמרית המנה</td>
			<td>פלטה/µL 4</td>
			<td>250 ΜL</td>
			<td>2.5 ng</td>
			<td>5 ng</td>
			<td>5 ng</td>
			<td>לסך 25 µL</td>
			<td>25 ΜL</td>
			<td>200 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>צלחת הקאמרית 8</td>
			<td>פלטה/µL 4</td>
			<td>250 ΜL</td>
			<td>1.25 ng</td>
			<td>2.5 ng</td>
			<td>2.5 ng</td>
			<td>לסך 12.5 µL</td>
			<td>12.5 ΜL</td>
			<td>100 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>בטבלה 2: מומלץ כרכים של ריאגנטים המשמש עבור תקנים ארעית. הערה: כמות פלסמיד הציע היא רק נקודת התחלה. אם אין אות זוהה, מומלץ titrate את פלסמיד מ 20-200 ng לכל טוב של צלחת 6-. טוב.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>קספאז</td>
			<td>טיפול</td>
			<td>ריכוז</td>
			<td>זמן</td>
			<td>התוצאות הצפויות</td>
		</tr>
<tr>
<td>קספאז-1</td>
			<td>עולה ביטוי יתר על המידה</td>
			<td>250 ng/טוב של צלחת טוב 6</td>
			<td>48 שעות</td>
			<td>50% BiFC חיובית</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">קספאז-2</td>
			<td>ביטוי יתר RAIDD</td>
			<td>500 ng/טוב של צלחת טוב 6</td>
			<td>h 24 שעות ביממה</td>
			<td>90% BiFC חיובית</td>
		</tr>
<tr>
<td>Camptothecin</td>
			<td>100 מיקרומטר</td>
			<td>16 h</td>
			<td>30-60% BiFC חיובית</td>
		</tr>
<tr>
<td>הלם חום</td>
			<td>h 1 ב 45 מעלות צלזיוס</td>
			<td>16 h</td>
			<td>80% BiFC חיובית</td>
		</tr>
<tr>
<td>קספאז-4</td>
			<td>Overexpressed NALP1</td>
			<td>250 ng/טוב של צלחת טוב 6</td>
			<td>48 שעות</td>
			<td>30% BiFC חיובית</td>
		</tr>
<tr>
<td>קספאז-5</td>
			<td>Overexpressed IPAF</td>
			<td>250 ng/טוב של צלחת טוב 6</td>
			<td>48 שעות</td>
			<td>15% BiFC חיובית</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 3: דוגמאות לפקדי חיובי עבור קספאז פלורסצנטיות ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה (BiFC). התנאים ואת התוצאות הצפויות מבוססים על נתונים שפורסמו באמצעות ה-Pro בונה 14,17,18. פלסמידים ביטוי משותף צריך להיות transfected לצד פלסמידים BiFC (שלב 2.1.4)
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57316/57316video1.jpg"> סרט 1: לוקליזציה תלת-ממד של זריחה ריאקציה דו-מולקולרית קספאז-2 קומפלמנטציה (BiFC). שחזור תלת-ממד, לסובב y-ציר של תמונות קונאפוקלית עד z-מטוס של הלה תאים המבטאים את הרכיבים קספאז-2-BiFC, כתב גרעיני פלורסנט טופלו עם camptothecin (20 מיקרומטר) במשך 16 h. הסרט מראה קספאז-2 (ירוק) BiFC את הגרעין (אדום). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57316/3D_(Turn_around_Y).avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57316/57316video2.jpg"> סרט 2: בצילום מואץ של זריחה ריאקציה דו-מולקולרית קספאז-2 קומפלמנטציה (BiFC). LN18 גליובלסטומה תאים transfected עם הרכיבים BiFC קספאז-2 ו שטופלו bortezomib (15 ננומטר) היו עם תמונה כל 2 דקות במשך 8 שעות. הסרט מראה BiFC קספאז-2 (ירוק), המיטוכונדריה (אדום). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57316/Movie2.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation at JoVE.com

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

פרוטוקול זה מתאר קספאז פלורסצנטיות ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה (BiFC); מבוססת הדמיה בשיטת יכול לשמש כדי להמחיש המושרה הקרבה של יוזם caspases, וזה הצעד הראשון ההפעלה שלהם.

מאיר את המסלולים להפעלה קספאז באמצעות קרינה פלואורסצנטית ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

lighting-up-pathways-to-caspase-activation-using-bimolecular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.0K Views.  Baylor College of Medicine. פרוטוקול זה מתאר קספאז פלורסצנטיות ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה (BiFC); מבוססת הדמיה בשיטת יכול לשמש כדי להמחיש המושרה הקרבה של יוזם caspases, וזה הצעד הראשון ההפעלה שלהם.

Video: Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and decreases waste in costs and reagents. Here we describe optimization of a multiplex assay to assess apoptosis following a palmitic acid (PA) challenge in an in vitro hypothalamic model, using both fluorescent and luminescent based assays to measure viable cell counts and caspase-3/7 activity in a 96-well microtiter plate format. Following PA challenge, viable cells were determined by a resazurin-based fluorescent assay. Caspase-3/7 activity was then determined using a luminogenic substrate, DEVD, and normalized to cell number. This multiplexing assay is a useful technique for determining change in caspase activity following an apoptotic stimulus, such as saturated fatty acid challenge. The saturated fatty acid PA can increase hypothalamic oxidative stress and apoptosis, indicating the potential importance of assays such as that described here in studying the relationship between saturated fatty acids and neuronal function.

Multiplex assays can provide beneficial information for basic cellular mechanisms&#160;and eliminate waste of reagents and unnecessary repetitive experiments. We describe here a multiplex caspase-3/7 activity assay, using fluorescent- and luminescent-based methods, to determine cell viability in an in vitro hypothalamic model following oxidative challenge with palmitic acid.

שימוש בcaspase ריבוב Assay לקביעת אפופטוזיס בדגם נייד ההיפותלמוס

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Neuroscience

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators and executioners of apoptosis, the most studied form of programmed cell death. Apoptosis occurs during developmental processes and is a necessary event in tissue homeostasis. Pyroptosis is another form of cell death that utilizes caspases and is a critical process in activating the immune system through the activation of the inflammasome, which results in the release of members of the interleukin-1 (IL-1) family. To assess caspase activity, target substrates can be assessed. However, sensitivity can be an issue when examining single cells or low-level activity. We demonstrate how a fluorogenic substrate can be used with a population-based assay or single-cell assay by flow cytometry. With proper controls, different amino acid sequences can be used to identify which caspases are active. Using these assays, the simultaneous loss of the inhibitors of apoptosis proteins upon tumor necrosis factor (TNF) stimulation has been identified, which primarily induces apoptosis in macrophages rather than other forms of cell death.

The present protocol describes two methods to measure caspase activity through a fluorogenic substrate using flow cytometry or a spectrofluorometer.

מדידת פעילות קספז באמצעות בדיקה פלואורומטרית או ציטומטריית זרימה

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as immunoprecipitation do not provide information on the spatial localization of complexes. In contrast, BiFC monitors the interaction and subcellular compartmentalization of protein complexes. In this method, a fluororescent protein is split into amino- and carboxy-terminal non-fluorescent fragments which are then fused to two proteins of interest. Interaction of the proteins results in reconstitution of the fluorophore (Figure 1)1,2. A limitation of BiFC is that once the fragmented fluorophore is reconstituted the complex is irreversible3. This limitation is advantageous in detecting transient or weak interactions, but precludes a kinetic analysis of complex dynamics. An additional caveat is that the reconstituted flourophore requires 30min to mature and fluoresce, again precluding the observation of real time interactions4. BiFC is a specific example of the protein fragment complementation assay (PCA) which employs reporter proteins such as green fluorescent protein variants (BiFC), dihydrofolate reductase, b-lactamase, and luciferase to measure protein:protein interactions5,6. Alternative methods to study protein:protein interactions in cells include fluorescence co-localization and F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)7. For co-localization, two proteins are individually tagged either directly with a fluorophore or by indirect immunofluorescence. However, this approach leads to high background of non-interacting proteins making it difficult to interpret co-localization data. In addition, due to the limits of resolution of confocal microscopy, two proteins may appear co-localized without necessarily interacting. With BiFC, fluorescence is only observed when the two proteins of interest interact. FRET is another excellent method for studying protein:protein interactions, but can be technically challenging. FRET experiments require the donor and acceptor to be of similar brightness and stoichiometry in the cell. In addition, one must account for bleed through of the donor into the acceptor channel and vice versa. Unlike FRET, BiFC has little background fluorescence, little post processing of image data, does not require high overexpression, and can detect weak or transient interactions. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) is a method similar to FRET except the donor is an enzyme (e.g. luciferase) that catalyzes a substrate to become bioluminescent thereby exciting an acceptor. BRET lacks the technical problems of bleed through and high background fluorescence but lacks the ability to provide spatial information due to the lack of substrate localization to specific compartments8. Overall, BiFC is an excellent method for visualizing subcellular localization of protein complexes to gain insight into compartmentalized signaling.

The subcellular localization of proteins is important in determining the spatio-temporal regulation of cell signaling. Here, we describe bimolecular fluorescence complementation (BiFC) as a straightforward method for monitoring the spatial interactions of proteins in the cell.

השלמה Fluorescence bimolecular

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Biology

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death processes that are generally assumed to be intrinsically irreversible. Promoting anastasis could in principle rescue or preserve injured cells that are difficult to replace such as cardiomyocytes or neurons, thereby facilitating tissue recovery. Conversely, suppressing anastasis in cancer cells, undergoing apoptosis after anti-cancer therapies, may ensure cancer cell death and reduce the chances of recurrence. However, these studies have been hampered by the lack of tools for tracking the fate of cells that undergo anastasis in live animals. The challenge is to identify the cells that have reversed the cell death process despite their morphologically normal appearance after recovery. To overcome this difficulty, we have developed Drosophila and mammalian CaspaseTracker biosensor systems that can identify and permanently track the anastatic cells in vitro or in vivo. Here, we present in vivo protocols for the generation and use of the CaspaseTracker dual biosensor system to detect and track anastasis in Drosophila melanogaster after transient exposure to cell death stimuli. While conventional biosensors and protocols can label cells actively undergoing apoptotic cell death, the CaspaseTracker biosensor can permanently label cells that have recovered after caspase activation - a hallmark of late-stage apoptosis, and simultaneously identify active apoptotic processes. This biosensor can also track the recovery of the cells that attempted other forms of cell death that directly or indirectly involved caspase activity. Therefore, this protocol enables us to continuously track the fate of these cells and their progeny, facilitating future studies of the biological functions, molecular mechanisms, physiological and pathological consequences, and therapeutic implications of anastasis. We also discuss the appropriate controls to distinguish cells that undergo anastasis from those that display non-apoptotic caspase activity in vivo.

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis is technically challenging to detect in vivo because the cells that have reversed the cell death process can be morphologically indistinguishable from normal healthy cells. Here we describe protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis in live animals by using our newly developed in vivo CaspaseTracker biosensor system.

גילוי Anastasis In Vivo מאת CaspaseTracker ביוסנסור

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

Medicine

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct regulation of inflammatory signaling and is activated by proximity-induced dimerization following recruitment to inflammasomes. Caspase-1 is abundant in the monocytic cell lineage and induces maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1&#946; and IL-18 to active secreted molecules. The other inflammatory caspases, caspase-4 and -5 (and their murine homolog caspase-11) promote IL-1&#946; release by inducing pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is a tool used to measure inflammatory caspase induced proximity as a readout of caspase activation. The caspase-1, -4, or -5 prodomain, which contains the region that binds to the inflammasome, is fused to non-fluorescent fragments of the yellow fluorescent protein Venus (Venus-N [VN] or Venus-C [VC]) that associate to reform the fluorescent Venus complex when the caspases undergo induced proximity. This protocol describes how to introduce these reporters into primary human monocyte-derived macrophages (MDM) using nucleofection, treat the cells to induce inflammatory caspase activation, and measure caspase activation using fluorescence and confocal microscopy. The advantage of this approach is that it can be used to identify the components, requirements, and localization of the inflammatory caspase activation complex in living cells. However, careful controls need to be considered to avoid compromising cell viability and behavior. This technique is a powerful tool for the analysis of dynamic caspase interactions at the inflammasome level as well as for the interrogation of the inflammatory signaling cascades in living MDM and monocytes derived from human blood samples.

This protocol describes the workflow to obtain monocytes-derived macrophages (MDM) from human blood samples, a simple method to efficiently introduce inflammatory caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reporters into human MDM without compromising cell viability and behavior, and an imaging-based approach to measure inflammatory caspase activation in living cells.

הדמיה של קספאזות דלקתיות המושרות קרבה במקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Immunology and Infection

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is the initiation of innate immune programmed cell death (PCD) to eliminate infected or damaged cells and propagate immune responses. However, excess PCD is associated with inflammation and pathology. Therefore, understanding the activation and regulation of PCD is a central aspect of characterizing innate immune responses and identifying new therapeutic targets across the disease spectrum.
This protocol provides methods for characterizing innate immune PCD activation by monitoring caspases, a family of cysteine-dependent proteases that are often associated with diverse PCD pathways, including&#160;apoptosis,&#160;pyroptosis, necroptosis, and PANoptosis. Initial reports characterized caspase-2, caspase-8, caspase-9, and caspase-10 as initiator caspases and caspase-3, caspase-6, and caspase-7 as effector caspases in apoptosis, while later studies found the inflammatory caspases, caspase-1, caspase-4, caspase-5, and caspase-11, drive pyroptosis. It is now known that there is extensive crosstalk between the caspases and other innate immune and&#160;cell death molecules across the previously defined PCD pathways, identifying a key knowledge gap in the mechanistic understanding of innate immunity and PCD and&#160;leading to the characterization of PANoptosis. PANoptosis is a unique innate immune inflammatory PCD pathway regulated by PANoptosome complexes, which integrate components, including caspases,&#160;from other cell death pathways.
Here, methods for assessing the activation of caspases in response to various stimuli are provided. These methods allow for the characterization of PCD pathways both in vitro and in vivo, as activated caspases undergo proteolytic cleavage that can be visualized by western blotting using optimal antibodies and blotting conditions. A protocol and western blotting workflow have been established that allow for the assessment of the activation of multiple caspases from the same cellular population, providing a comprehensive characterization of the PCD processes. This method can be applied across research areas in development, homeostasis, infection, inflammation, and cancer to evaluate PCD pathways throughout cellular processes in health and disease.

This protocol describes a comprehensive method for assessing caspase activation (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9, and caspase-11) in response to both in vitro and in vivo (in mice) models of infection, sterile insults, and cancer to determine the initiation of cell death pathways, such as pyroptosis, apoptosis, necroptosis, and PANoptosis.

הערכת הפעלת קספז להערכת מוות מולד של תאי מערכת החיסון

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important checkpoints of apoptosis, including mitochondrial fragmentation, release of mitochondrial cytochrome c into the cytosol, activation of caspases, chromatin condensation, DNA damage, nuclear fragmentation, plasma membrane blebbing, cell shrinkage, cell surface exposure of phosphatidylserine, and formation of apoptotic bodies. Anastasis can occur when apoptotic stimuli are removed prior to death, thereby allowing dying cells to reverse apoptosis and potentially other death mechanisms. Therefore, anastasis appears to involve physiological healing processes that could also sustain damaged cells inappropriately. The functions and mechanisms of anastasis are still unclear, hampered in part by the limited tools for detecting past events after the recovery of apparently healthy cells. Strategies to detect anastasis will enable studies of the physiological mechanisms, the hazards of undead cells in disease pathology, and potential therapeutics to modulate anastasis. Here, we describe effective strategies using live cell microscopy and a mammalian caspase biosensor&#160;for identifying and tracking anastasis in mammalian cells.

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

אסטרטגיות למעקב Anastasis, תופעת הישרדות תא שהיפוך אפופטוזיס

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

To detect healthy cells in whole animals that contain low levels of caspase activity, the highly sensitive biosensor designated CaspaseTracker was generated for Drosophila. Caspase-dependent biosensor activity is detected in long-lived healthy cells throughout the internal organs of adult animals reared under optimized conditions in the absence of death stimuli.

In vivo biosensor Tracks ללא אפופטוטיים caspase פעילות תסיסנית

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

Visualization of Caspase Activation in Human Monocyte-Derived Macrophages

Source: Bol&#237;var, B. E., et. al., <a href="https://app.jove.com/v/63162">Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2022).
This video demonstrates the activation of caspase proteins in human macrophages using bimolecular fluorescence complementation reporter proteins. The pro-domains of caspase-1 are fused with non-fluorescent fragments of Venus proteins, which are recruited to inflammasome complexes. The proximity of inflammasomes induces the refolding and fluorescence of Venus fragments, confirming caspase activation in the macrophages.

הדמיה של הפעלת קספז במקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים

Source: Bol&#237;var, B. E., et. al., Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. 
...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immune Response

Immune Modulation

Chemiluminescent Western Blot Assay for Protein Processing

Source: Hillert-Richter, L. K. et al., <a href="https://app.jove.com/v/62842">Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video describes the chemiluminescence-based western blotting of immunoprecipitated lysates. The technique helps determine protein processing and activation. The chemiluminescent signal detected is proportional to the level of protein processing during its activation.

בדיקת כתם מערבי Chemiluminescent לעיבוד חלבונים

Source: Hillert-Richter, L. K. et al., Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex. J. ...