אפידמיולוגיה מבוססת מים ושפכים התפתחה כשיטה חלופית לניטור וחיזוי מהלך ההתפרצויות בקהילות. שיטת פלוקולציית חלב דל שומן מייצגת גישה חלופית לריכוז חיידקים. שיטת פלוקולציית חלב דל שומן מייצגת שיטה רב-תכליתית, זולה וקלה לריכוז שברים מיקרוביאליים ללא הבדלים משמעותיים בהשוואה לגישות סינון אולטרה או סינון זרימה משיק.
גישה זו משמשת למטגנומיקה או מחקרי PCR ממוקדים. לאחר ריכוז השברים המיקרוביאליים, ניתן לבצע מיצוי חומצות גרעין באמצעות ערכות מיצוי מסחריות או פרוטוקול פנימי. שיטת החלב הרזה קלה יחסית לכמויות גדולות או קטנות של דגימות מים או שפכים.
כחלק משיטה זו יש לכלול בקרת רקע עם מי Milli-Q. מי שידגימו את ההליך יהיו קאדיר ינאק, ג'אנל פרנסיס וג'וסלין זמבראנו-אלווראדו, סטודנטים לתואר שני במעבדה של מיגל אויאגוארי. כדי להתחיל, לאסוף שני ליטרים של דגימות שפכים גולמיים מרוכבים פרופורציונליים זרימה של 24 שעות.
העבירו את הדגימות למעבדה בבקבוקים חסיני אור בארגז קרח ועבדו אותן תוך 24 שעות. קבל את נתוני מאפייני השפכים מהצוות הטכני של מכון טיהור השפכים. עבור כל שיטת סינון אולטרה, יש לזנק חמש פעמים 10 לעותק הרביעי של RNA משוריין ל-140 מיליליטר מכל אחת משש דגימות שפכים מתוקים שנאספו בתאריך אחד ושש דגימות שפכים מתוקים בתאריך אחר.
הומוגניזציה של RNA משוריין בדגימה על ידי ערבוב במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס על ערבוב מגנטי. עבור חלב דל שומן flocculation או SMF, להכין 1% תמיסת חלב דל שומן על ידי המסת 0.5 גרם של אבקת חלב דל שומן ב 50 מיליליטר של מי ים סינתטיים. התאימו את רמת החומציות של SMF ל-3.5 באמצעות חומצה הידרוכלורית רגילה אחת.
הוסף חמישה מיליליטר של תמיסת חלב דל שומן ל 500 מיליליטר של דגימת שפכים גולמיים. מערבבים את הדגימה במשך שמונה שעות ומניחים ללהקות שנוצרו להסתפק בשמונה שעות נוספות בטמפרטורת החדר. מוציאים את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה סרולוגית מבלי להפריע לעדרים המיושבים.
מעבירים נפח סופי של 50 מיליליטר המכיל את הצאן לצינור צנטריפוגה וצנטריפוגה ב 8, 000 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מוציאים את הסופרנאטנט ומגרדים בזהירות את הגלולה בעזרת מרית מעוקרת. השהה מחדש את הגלולה הנותרת ב 250 מיקרוליטר של חיץ נתרן פוספט מולארי 0.2.
מעבירים את הכדוריות המרוטשות והתלויות מחדש לאותו צינור צנטריפוגה מיני של 1.5 מיליליטר. ביצוע מיצוי RNA נגיפי מתרכיזים נגיפיים של דגימות שפכים ומבחני יעילות התאוששות באמצעות ערכת מיצוי RNA עם יחס של 25:24:2:1 בין פנול לכלורופורם לאלכוהול איזואמיל ובטא מרקפטואתנול בהתאם להוראות היצרן. לבסוף, לטשטש את הרנ"א ב 50 מיקרוליטר של חיץ אלוציה.
עבור ניתוח RT-qPCR, כמת RNA משוריין באמצעות דילולים פי עשרה של DNA סינתטי חד-גדילי או מבנה gBlock. השג עקומות כיול עבור כל ריצת RT-qPCR. כלול בקרות שליליות והפעל את הדגימות בשלשה.
אספו 10 ליטר דגימת מים עיליים סביבתיים. כלול 10 ליטר מים נטולי יונים, לשליטה ברקע. בצע סינון קפסולות ואקום באמצעות מסנני דיסק ממברנה בגדלים 0.45, 0.2 ו- 0.1 מיקרון כדי למזער רעש במהלך ריצוף מטגנומי.
לאחר הסינון, התאימו את רמת החומציות של דגימת המים ל-3.5 באמצעות חומצה הידרוכלורית רגילה אחת. הכינו תמיסת חלב דל שומן 1% מראש והתאימו את ה- pH ל -3.5. הוסף 100 מיליליטר של תמיסת חלב דל שומן חומצי ל -10 ליטר דגימת מים סביבתיים חומציים.
ערבבו את הדגימה במשך שמונה שעות בטמפרטורת החדר על שייקר מגנטי ואפשרו ללהקות לשקוע באמצעות כוח הכבידה למשך שמונה שעות נוספות. לאחר השיקוע, מוציאים בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות משאבת ואקום מבלי להפריע ללהקות. יש לאזן את שאר הצאן בהתאם למשקל בצינור צנטריפוגה 50 מ"מ וצנטריפוגה.
מוציאים את הסופרנאטנט וממיסים את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של חיץ נתרן פוספט מולארי 0.2. טפל בכדוריות המומסות עם DNase I ו- RNase A בהתאם להוראות היצרן לסילוק DNA ו- RNA חופשיים המואצים בתהליך המיצוי. לאחר הדגירה, יש להשבית את DNase I ו-RNase A.לחלץ חומצות גרעין מהגלולה המומסת באמצעות ערכת מיצוי DNA או RNA.
כמת את הכמות הכוללת של DNA או RNA שחולץ מדגימת המים העיליים הסביבתית באמצעות פלואורומטר. בצע ניתוח qPCR כדי להתמקד וירוסים אנטריים מעניינים וריצוף Illumina כדי לזהות את מבנה הקהילה הנגיפית. אספו שני ליטרים של דגימות מים מנתיבי מים מוגנים ומושפעים.
אם הדגימה מכילה פסולת ניכרת, השתמש בבד גבינה כדי להסיר אותם. הוסף 20 מיליליטר של תמיסת חלב דל שומן 1% לדגימת המים המתוקים של שני ליטר שהותאמו בעבר ל- pH. ערבבו את הדגימה במשך שמונה שעות בטמפרטורת החדר ואפשרו ללהקות לשקוע בכוח הכבידה במשך שמונה שעות נוספות.
לאחר השיקוע, הסר בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות משאבה פריסטלטית. מעבירים את להקות המשקע לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר וצנטריפוגות אותם ב 8, 000 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הכדוריות ב-200 מיקרוליטר של חיץ נתרן פוספט מולארי 0.2.
בחר כ -0.5 גרם של הלהקה למיצוי DNA באמצעות ערכת בידוד חומצות גרעין לפי בחירת הוראות היצרן. לקבוע את ריכוז ה- DNA ואת טוהר באמצעות fluorometer. כל שש הדגימות שעובדו עם סינון אולטרה ב -3, 000 גרם היו חיוביות.
לעומת זאת, רק דגימה אחת הייתה חיובית כאשר הדגימות עובדו עם סינון אולטרה ב 7, 500 G.כל הדגימות שעובדו עם SMF היו חיוביות והביאו להתאוששות טובה יותר. שיעורי ההתאוששות הממוצעים של 3, 000 G ו- SMF היו גבוהים באופן משמעותי ועקבי מאשר סינון אולטרה ב 7, 500 G.פרמטרים של איכות מים בדגימות מושפעות וחומצות גרעין שהופקו מדגימות מים סביבתיות שנאספו בוויניפג על פני שלוש עונות מסוכמים כאן. דגימות שנאספו בחודשים אפריל עד אוקטובר 2022 ממי נהר אסיניבואין הניבו את ריכוז הדנ"א הגבוה ביותר מיער 1 והריכוז הנמוך ביותר נמצא באתר חקלאי שלוש.
חשוב מאוד להשתמש בריכוז הנכון של חלב דל שומן ולהחמיץ, את הדגימה לפני השימוש. טכניקה זו יכולה לספק סריקה מהירה של פתוגנים מיקרוביאליים שונים הנמצאים בדגימות סביבתיות כגון מים ושפכים. שינויים נוספים יכולים להיות מיושמים באמצעות מטריצות מוצקות כגון אדמה או משקעים.
