Concentração de Partículas de Vírus de Amostras Ambientais de Água e Efluentes Usando Floculação e Ultrafiltração de Leite Desnatado

A epidemiologia da base hídrica e das águas residuais tem emergido como um método alternativo para monitorar e prever o curso de surtos em comunidades. O método de floculação do leite desnatado representa uma abordagem alternativa para os micróbios concentrados. O método de floculação de leite desnatado representa um método versátil, barato e fácil de concentrar frações microbianas sem diferenças significativas em comparação com as abordagens de ultrafiltração ou filtração tangencial em fluxo.

Essa abordagem é usada para estudos de metagenômica ou PCR direcionados. Uma vez que as frações microbianas são concentradas, a extração de ácido nucleico pode ser conduzida usando kits de extração comerciais ou protocolo interno. O método de floculação de leite desnatado é relativamente mais fácil para grandes ou pequenos volumes de amostras de água ou águas residuais.

Um controle de fundo com água Milli-Q deve ser incluído como parte deste método. Quem demonstrará o procedimento serão Kadir Yanac, Jhannelle Francis e Jocelyn Zambrano-Alvarado, alunas de pós-graduação do laboratório de Miguel Uyaguari. Para começar, colete dois litros de amostras de efluentes brutos compostos proporcionais à vazão de 24 horas.

Transportar as amostras para o laboratório em frascos à prova de luz em uma caixa de gelo e processá-las dentro de 24 horas. Obtenha os dados de características de águas residuais da equipe técnica da estação de tratamento de efluentes. Para cada método de ultrafiltração, aumente cinco vezes 10 a quarta cópias de RNA blindado em 140 mililitros de cada uma das seis amostras de águas residuais frescas coletadas em uma data e seis amostras de águas residuais frescas em outra data.

Homogeneizar o RNA blindado na amostra agitando por 30 minutos a quatro graus Celsius em uma agitação magnética. Para floculação de leite desnatado ou SMF, prepare uma solução de leite desnatado a 1% dissolvendo 0,5 gramas de leite em pó desnatado em 50 mililitros de água do mar sintética. Ajustar o pH da FME para 3,5 utilizando um ácido clorídrico normal.

Adicione cinco mililitros de solução de leite desnatado a 500 mililitros de amostra de águas residuais brutas. Mexa a amostra durante oito horas e deixe que os bandos formados se acomodem por mais oito horas à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante usando uma pipeta sorológica sem perturbar os rebanhos assentados.

Transfira um volume final de 50 mililitros contendo os bandos para um tubo de centrífuga e centrífuga a 8.000 G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Retire o sobrenadante e raspe cuidadosamente o pellet usando uma espátula esterilizada. Ressuspender o pellet restante em 250 microlitros de tampão fosfato de sódio 0,2 molar.

Transfira os pellets raspados e ressuspensos para o mesmo tubo de mini centrífuga de 1,5 mililitro. Realizar extração de RNA viral de concentrados virais de amostras de águas residuais e ensaios de eficiência de recuperação usando um kit de extração de RNA com uma proporção de 25:24:2:1 de fenol para clorofórmio para álcool isoamílico e beta mercaptoetanol de acordo com as instruções do fabricante. Finalmente, eluir o RNA em 50 microlitros de tampão de eluição.

Para análise de RT-qPCR, quantificar o RNA blindado usando diluições de dez vezes de um DNA sintético de fita simples ou construção gBlock. Obter curvas de calibração para cada execução de RT-qPCR. Inclua controles negativos e execute as amostras em triplicata.

Coletar 10 litros de amostra de água superficial ambiental. Inclua 10 litros de água deionizada para controle de fundo. Realize filtração de cápsulas e vácuo usando filtros de disco de membrana de tamanhos de 0,45, 0,2 e 0,1 mícron para minimizar o ruído durante o sequenciamento metagenômico.

Após filtração, ajustar o pH da amostra de água para 3,5 utilizando um ácido clorídrico normal. Preparar uma solução de leite desnatado pré-floculado a 1% e ajustar o pH para 3,5. Adicionar 100 mililitros da solução de leite desnatado acidificado a 10 litros de amostra de água ambiental acidificada.

Agitar a amostra durante oito horas à temperatura ambiente num agitador magnético e deixar sedimentar os bandos por gravidade durante mais oito horas. Após o assentamento, remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma bomba de vácuo sem perturbar os rebanhos. Alíquota e balanceamento dos lotes remanescentes de acordo com o peso em tubo centrífugo de 50 mililitros e centrífuga.

Retire o sobrenadante e dissolva o pellet em 200 microlitros de tampão fosfato de sódio 0,2 molar. Tratar os pellets dissolvidos com DNase I e RNase A seguindo as instruções do fabricante para eliminar o DNA livre e o RNA coprecipitados durante o processo de extração. Após a incubação, inative DNase I e RNase A.Extraia ácidos nucleicos do pellet dissolvido usando um kit de extração de DNA ou RNA.

Quantificar a quantidade total de DNA ou RNA extraído da amostra de água superficial ambiental usando um fluorômetro. Realizar análise de qPCR para atingir vírus entéricos de interesse e sequenciamento Illumina para identificar a estrutura da comunidade viral. Coletar amostras de dois litros de água de cursos d'água protegidos e impactados.

Se a amostra contiver detritos consideráveis, use um pano de queijo para removê-los. Adicionar 20 mililitros de solução de leite desnatado a 1% à amostra de água doce de dois litros previamente ajustada para pH. Agitar a amostra durante oito horas à temperatura ambiente e deixar sedimentar os bandos por gravidade durante mais oito horas.

Após o assentamento, remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma bomba peristáltica. Transfira os bandos sedimentados para um tubo de centrífuga de 50 mililitros e centrifuga-os a 8.000 G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante e ressuspenda os pellets em 200 microlitros de tampão fosfato de sódio 0,2 molar.

Selecione cerca de 0,5 gramas do rebanho para extração de DNA usando o kit de isolamento de ácido nucleico de escolha seguindo as instruções do fabricante. Determinar a concentração e pureza do DNA usando um fluorômetro. Todas as seis amostras processadas com ultrafiltração a 3.000 G foram positivas.

Em contraste, apenas uma amostra foi positiva quando as amostras foram processadas com ultrafiltração a 7.500 G. Todas as amostras processadas com FME foram positivas e resultaram em melhor recuperação. As taxas médias de recuperação de 3.000 G e SMF foram significativa e consistentemente maiores do que a ultrafiltração em 7.500 G. Os parâmetros de qualidade da água em amostras influenciadas e ácidos nucleicos extraídos de amostras ambientais de água coletadas em Winnipeg ao longo de três estações são resumidos aqui. Amostras coletadas de abril a outubro de 2022 na água do rio Assiniboine produziram a maior concentração de DNA da Floresta 1 e a menor concentração foi recuperada do sítio agrícola três.

É muito importante usar a concentração certa de leite desnatado e acidificar a amostra antes de usar. Esta técnica pode fornecer uma triagem rápida de diferentes patógenos microbianos presentes em amostras ambientais, como água e águas residuais. Modificações adicionais podem ser implementadas usando matrizes sólidas, como solo ou sedimentos.