Concentration de particules virales provenant d’échantillons d’eau et d’eaux usées prélevés dans l’environnement par floculation et ultrafiltration du lait écrémé

L’épidémiologie de l’eau et des eaux usées est apparue comme une méthode alternative pour surveiller et prédire l’évolution des éclosions dans les collectivités. La méthode de floculation du lait écrémé représente une approche alternative aux microbes concentrés. La méthode de floculation du lait écrémé représente une méthode polyvalente, peu coûteuse et facile à utiliser pour concentrer les fractions microbiennes sans différences significatives par rapport aux approches d’ultrafiltration ou de filtration à flux tangentiel.

Cette approche est utilisée pour la métagénomique ou les études PCR ciblées. Une fois que les fractions microbiennes sont concentrées, l’extraction des acides nucléiques peut être effectuée à l’aide de kits d’extraction commerciaux ou d’un protocole interne. La méthode de floculation du lait écrémé est relativement plus facile pour les grands ou petits volumes d’échantillons d’eau ou d’eaux usées.

Un contrôle de fond avec de l’eau Milli-Q devrait être inclus dans le cadre de cette méthode. Kadir Yanac, Jhannelle Francis et Jocelyn Zambrano-Alvarado, étudiants diplômés du laboratoire de Miguel Uyaguari, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, prélevez deux litres d’échantillons composites d’eaux usées brutes proportionnels au débit sur 24 heures.

Transporter les échantillons au laboratoire dans des bouteilles résistantes à la lumière dans une glacière et les traiter dans les 24 heures. Obtenez les données sur les caractéristiques des eaux usées auprès du personnel technique de l’usine de traitement des eaux usées. Pour chaque méthode d’ultrafiltration, piquer cinq fois 10 à la quatrième copie d’ARN blindé dans 140 millilitres de chacun des six échantillons d’eaux usées fraîches prélevés à une date et six échantillons d’eaux usées fraîches à une autre date.

Homogénéiser l’ARN blindé dans l’échantillon en agitant pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius sous agitation magnétique. Pour la floculation de lait écrémé ou SMF, préparer une solution de lait écrémé à 1% en dissolvant 0,5 gramme de lait écrémé en poudre dans 50 millilitres d’eau de mer synthétique. Ajuster le pH de l’AMS à 3,5 en utilisant un acide chlorhydrique normal.

Ajouter cinq millilitres de solution de lait écrémé à 500 millilitres d’échantillon d’eaux usées brutes. Remuer l’échantillon pendant huit heures et laisser les troupeaux formés se déposer pendant huit heures supplémentaires à température ambiante. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique sans déranger les troupeaux installés.

Transférer un volume final de 50 millilitres contenant les flocages dans un tube à centrifuger et centrifuger à 8 000 g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Retirer le surnageant et mettre soigneusement la pastille au crible à l’aide d’une spatule stérilisée. Remettez en suspension la pastille restante dans 250 microlitres de tampon phosphate de sodium 0,2 molaire.

Transférer les pastilles raclées et remises en suspension dans le même mini tube centrifuge de 1,5 millilitre. Effectuer l’extraction de l’ARN viral à partir de concentrés viraux d’échantillons d’eaux usées et des tests d’efficacité de récupération à l’aide d’une trousse d’extraction d’ARN avec un rapport de 25:24:2:1 de phénol/chloroforme, d’alcool isoamylique et de bêta-mercaptoéthanol selon les instructions du fabricant. Enfin, éluer l’ARN dans 50 microlitres de tampon d’élution.

Pour l’analyse RT-qPCR, quantifier l’ARN blindé en utilisant des dilutions décuplées d’un ADN simple brin synthétique ou d’une construction gBlock. Obtenez des courbes d’étalonnage pour chaque exécution RT-qPCR. Inclure les témoins négatifs et exécuter les échantillons en trois exemplaires.

Prélever 10 litres d’échantillon d’eau de surface environnementale. Inclure 10 litres d’eau désionisée pour le contrôle du fond. Effectuez la filtration par capsule et sous vide à l’aide de filtres à disque à membrane de 0,45, 0,2 et 0,1 micron pour minimiser le bruit pendant le séquençage métagénomique.

Après filtration, ajuster le pH de l’échantillon d’eau à 3,5 en utilisant un acide chlorhydrique normal. Préparer une solution de lait écrémé préfloculée à 1 % et ajuster le pH à 3,5. Ajouter 100 millilitres de solution de lait écrémé acidifié à 10 litres d’échantillon d’eau ambiante acidifiée.

Remuer l’échantillon pendant huit heures à température ambiante sur un agitateur magnétique et laisser les troupeaux sédimenter par gravité pendant huit heures supplémentaires. Après le décantage, retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pompe à vide sans déranger les troupeaux. Aliquote et équilibrer les troupeaux restants en fonction du poids dans un tube à centrifuger de 50 millilitres et une centrifugeuse.

Retirer le surnageant et dissoudre la pastille dans 200 microlitres de tampon de phosphate de sodium 0,2 molaire. Traiter les pastilles dissoutes avec la DNase I et la RNase A en suivant les instructions du fabricant pour éliminer l’ADN libre et l’ARN coprécipités pendant le processus d’extraction. Après incubation, inactiver la DNase I et la RNase A.Extraire les acides nucléiques de la pastille dissoute à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN ou d’ARN.

Quantifier la quantité totale d’ADN ou d’ARN extrait de l’échantillon d’eau de surface environnementale à l’aide d’un fluoromètre. Effectuer une analyse qPCR pour cibler les virus entériques d’intérêt et le séquençage Illumina pour identifier la structure de la communauté virale. Prélever deux litres d’échantillons d’eau dans les cours d’eau protégés et contaminés.

Si l’échantillon contient beaucoup de débris, utilisez une étamine pour les enlever. Ajouter 20 millilitres de solution de lait écrémé à 1% à l’échantillon d’eau douce de deux litres précédemment ajusté au pH. Remuer l’échantillon pendant huit heures à température ambiante et laisser les troupeaux sédimenter par gravité pendant huit heures supplémentaires.

Après le décantage, retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pompe péristaltique. Transférer les troupeaux sédimentés dans un tube à centrifuger de 50 millilitres et les centrifuger à 8 000 g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Jeter le surnageant et remettre les pastilles en suspension dans 200 microlitres de tampon de phosphate de sodium 0,2 molaire.

Sélectionnez environ 0,5 gramme du troupeau pour l’extraction de l’ADN à l’aide du kit d’isolation des acides nucléiques de votre choix en suivant les instructions du fabricant. Déterminer la concentration et la pureté de l’ADN à l’aide d’un fluoromètre. Les six échantillons traités par ultrafiltration à 3 000 G étaient positifs.

En revanche, un seul échantillon était positif lorsque les échantillons ont été traités par ultrafiltration à 7 500 g.Tous les échantillons traités avec SMF étaient positifs et ont entraîné une meilleure récupération. Les taux de récupération moyens de 3 000 g et de SMF étaient significativement et systématiquement plus élevés que ceux de l’ultrafiltration à 7 500 g.Les paramètres de qualité de l’eau dans les échantillons influencés et les acides nucléiques extraits d’échantillons d’eau environnementale prélevés à Winnipeg pendant trois saisons sont résumés ici. Les échantillons prélevés d’avril à octobre 2022 dans l’eau de la rivière Assiniboine ont donné la concentration d’ADN la plus élevée dans la forêt 1 et la concentration la plus faible a été relevée sur le site agricole trois.

Il est très important d’utiliser la bonne concentration de lait écrémé et d’acidifier l’échantillon avant utilisation. Cette technique permet de dépister rapidement différents agents pathogènes microbiens présents dans les échantillons environnementaux tels que l’eau et les eaux usées. Des modifications supplémentaires peuvent être mises en œuvre à l’aide de matrices solides telles que le sol ou les sédiments.