המחברים אסירי תודה למכון המקסיקני לביטוח לאומי (IMSS) ולבית החולים לילדים של מקסיקו, פדריקו גומז (HIMFG) ולצוות Bioterio של תיאום המחקר של IMSS, על התמיכה שניתנה לביצוע פרויקט זה. אנו מודים למועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה על מלגת AOC (815290) ולאנטוניו דוארטה רייס על התמיכה הטכנית בחומר האודיו-ויזואלי.

כל ההליכים הניסיוניים בוצעו בהתאם להנחיות המקסיקניות לטיפול בבעלי חיים, בהתבסס על המלצות האגודה להערכה והסמכה של טיפול בחיות מעבדה בינלאומיות (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, מקסיקו). הפרוטוקול נבדק, אושר ונרשם על ידי ועדת האתיקה לחקר הבריאות של המכון המקסיקני דל סגורו חברתי (R-2021-785-092).
1. הסרת רקמת שומן מחולדות על ידי כריתה כירורגית
<ol><li>הכינו שני צינורות חרוטיים עם 20 מ"ל של תמיסת מלח אנטי-מיקרוטית סטרילית 1x פוספט חוצץ (PBS-AA) (1x PBS, גנטמיצין [20 מיקרוגרם/מ"ל], ואמפוטריצין [0.5 מיקרוגרם/מ"ל]) ושמרו על קרח.</li>
	<li>בחר שני זכרים בוגרים של חולדות Sprague Dawley (R. norvegicus) במצב בריאותי טוב. ודאו שהחולדות בנות 3-4 חודשים ומשקלן הקופורלי הוא 350-450 גרם.</li>
	<li>המשך להרגעה עם 20 מ"ג / ק"ג קסילזין הידרוכלוריד, וכעבור 5 דקות, מתן הרדמה עם מינון של 120 מ"ג / ק"ג קטמין הידרוכלוריד תוך צפקי. יש לשמן את שתי העיניים במשחה אופתלמית למניעת התייבשות. לאחר מכן, יש לוודא את עומק ההרדמה באמצעות חוסר רפלקס דוושה.</li>
	<li>לגלח ולחטא את אזור הבטן והמפשעה עם תמיסת יוד. החל וילונות כירורגיים כדי לשמור על סטריליות. לאחר מכן, בצע חתך אורכי חציוני מעצם החזה לאזור האשכים.</li>
	<li>הסר את רקמת השומן המקיפה הן את האפידידימיס והן את הכליות באמצעות מלקחיים סטריליים ומקם בתמיסת PBS-AA 1x. שמור את הדגימות על קרח.</li>
	<li>יש לתפור את החתך סגור במידת הצורך בהתאם להנחיות המוסדיות ולהרדים את בעלי החיים במינון תוך לבבי של 40 מ"ג/ק"ג נתרן פנטוברביטל. לאחר אישור המוות, יש להשליך את הפגר בהתאם להליכים מוסדיים. הערה: המוות מעורר מנגנוני איתות המשפיעים על אימונופנוטיפ, יכולת התמיינות והשפעה פרקרינית של תאים מזנכימליים. לפיכך, איסוף רקמות מבוצע לפני המתת חסד. </li>
</ol>2. בידוד תאים מזנכימליים מרקמת השומן
<ol><li>הסר את רקמת השומן עם מלקחיים סטריליים בתוך ארון בטיחות ביולוגית והנח אותה על נייר סינון סטרילי בצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ כדי לספוג PBS עודף.</li>
	<li>מעבירים את רקמת השומן לצלחת פטרי אחרת ומבצעים שלוש שטיפות במשך 5 דקות כל אחת עם 10 מ"ל של תמיסת PBS-AA אחת באמצעות פיפטה של 10 מ"ל.</li>
	<li>מכנית לפרק את הרקמה לשברים של כ 1 ס"מ2 באמצעות מספריים ואזמל.</li>
	<li>הכינו collagenase סוג IV (0.075%) ב 20 מ"ל של מדיום הנשר של Dulbecco ללא תוספת (DMEM). יש לסנן דרך מסנן מזרקים בגודל 0.22 מיקרומטר ולשמור על טמפרטורה של 37°C.</li>
	<li>הוסף את תמיסת הקולגנאז (20 מ"ל) שהוכנה בשלב 2.4 לתוך קריסטל עם הרקמה המקוטעת ופס מגנטי. יש לאטום את המיכל ולדגור תחת תסיסה איטית ומתמשכת בטמפרטורה של 37°C. הערה: העיכול האנזימטי אורך כ-90 דקות (יש לשמור על ערבוב איטי כדי לשמור על שלמות קרומי התא).</li>
	<li>סנן את ההומוגנט דרך נירוסטה, 40 רשת, מסנן צמצם 0.38 מ"מ על צלחת פטרי 100 מ"מ ולאסוף את מתלה התא בצינור חרוטי סטרילי 50 מ"ל.</li>
	<li>הוסף 20 מ"ל של DMEM מחומם בתוספת (10% סרום בקר עוברי [FBS], 2 מ"מ גלוטמין, 2 מ"מ נתרן פירובט, 100x תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות, ותמיסה אנטי-מיקוטית אנטיביוטית 100x [AA]). בזהירות להשעות את מקטע כלי הדם סטרומה (SVE).</li>
	<li>צנטריפוגה את תרחיף התא ב 290 x גרם במשך 10 דקות, להשליך את supernatant עם פיפטה 25 מ"ל, ולשטוף בעדינות את התאים עם 40 מ"ל של מדיום DMEM ללא תוספת.</li>
	<li>חזור על שלב זה. השתמש בצינור חרוטי סטרילי חדש בין השלבים כדי לגרור את הכמות הקטנה ביותר של פסולת תאית ושומן.</li>
	<li>להשעות את הגלולה ב 5 מ"ל של DMEM בתוספת עם פיפטה 5 מ"ל ולהעביר T-25 ס"מ2 בקבוק. יש לדגור במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.</li>
	<li>למחרת, בצע שלוש שטיפות עם 5 מ"ל של PBS-AA מחומם 1x ושתי שטיפות עם DMEM ללא תוספת כדי להסיר פסולת תאים ותאים שאינם דבקים. הוסף 5 מ"ל של DMEM טרי, מחומם, בתוספת פיפטה 5 מ"ל ולשנות את המדיום כל 3-4 ימים.</li>
</ol>3. שימור והרחבה של התרבויות הראשוניות של ASC
<ol><li>ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 90%-100% (8 ± יומיים), יש לשטוף פעמיים עם 5 מ"ל DMEM ללא תוסף. הוסף 1 מ"ל של 0.025% מחומם טריפסין-2 mM חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA) ודגור במשך 5-7 דקות ב 37 ° C.</li>
	<li>כאשר monolayer התא מנותק, להוסיף 4 מ"ל של DMEM בתוספת בעדינות לפרק את השעיית התא.</li>
	<li>מעבירים את תרחיף התא לצינור חרוטי של 15 מ"ל, מוסיפים 5 מ"ל של DMEM מחומם, בתוספת ומשהה בעדינות להומוגניזה.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 290 x גרם במשך 5 דקות. יש להשליך את הסופרנאטנט ולערבב בעדינות את הגלולה ב-1 מ"ל של תוסף DMEM. ספרו את התאים בתא נויבאואר לאחר צביעה בכחול טריפאן.</li>
	<li>לבסוף, זרע 2.5 x 103 תאים/ס"מ2 ביחס פיצול של 1:4 בצלוחיות T-75. צעד זה מבטיח היווצרות מושבות וקצב ריבוי גבוה.</li>
</ol>4. אפיון מורפולוגיה של תרבויות ראשוניות ASC
<ol><li>שימו לב למורפולוגיה של ASCs תחת מיקרוסקופ הפוך. הערה: לפני ההרכבה לצורך זיהוי היסטולוגיה ואוטיזם, יש לטפל בכיסויים בתמיסת ג'לטין 1%. הקרינו עם UV במשך 15 דקות.<ol><li>הסירו את הכיסויים מתמיסת אתנול 70% והניחו להם להתייבש במשך 5 דקות.</li>
		<li>יש לטבול את החלקות בתמיסת ג'לטין סטרילית 1%, לנקז ולייבש בטמפרטורת החדר (RT).</li>
		<li>הכניסו כל מכסה לכל באר של צלחת בעלת 6 בארות והקרינו את הצלחות באור UV למשך 15 דקות.</li>
		<li>זרעו טיפה המכילה 25X103 תאים במרכז הבאר, המתינו דקה והוסיפו 1 מ"ל של מדיום DMEM מוסף. יש לדגור במשך 96 שעות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.</li>
		<li>מוציאים את המדיום ומבצעים שלוש שטיפות עם 1x PBS-AA באמצעות פיפטת העברה.</li>
		<li>הוסף 1 מ"ל של פורמלין נייטרלי 3.5% לכל באר ודגר במשך שעה אחת ב- RT. בזהירות להסיר את הפורמלין ולהוסיף 1 מ"ל של אתנול קר 70% לכל באר.</li>
		<li>אטמו את הצלחת בפרפילם עד לשימוש, כדי למנוע התייבשות. הערה: המורפולוגיה התאית של ASCs מוערכת גם על ידי צביעת hematoxylin-eosin במהלך מעברים שונים.</li>
		<li>הסר את 70% אתנול מכל באר ולחות את התאים במשך 5 דקות עם מים מזוקקים. בינתיים, סננו את פתרונות הצביעה.</li>
		<li>מוציאים את המים ומכתימים את התאים בתסיסה איטית למשך 15 דקות עם תמיסת המטוקסילין של האריס.</li>
		<li>הסירו את תמיסת הכתמים ובצעו שתי שטיפות עם PBS אחד.</li>
		<li>מכתימים את התאים בתמיסת אאוזין תחת תסיסה איטית למשך דקה אחת. לאחר מכן, הסר את התמיסה ובצע שתי שטיפות עם PBS 1x.</li>
		<li>הסר בזהירות את הכיסויים מכל באר והרכיב את המגלשות על טיפה של תמיסת הרכבה PBS-גליצרול (1:1 v/v).</li>
		<li>הניחו קו של לכה סביב הכיסוי והתבוננו בשקופיות ההיסטולוגיות מתחת למיקרוסקופ האור.</li>
	</ol></li>
</ol>5. סמני ביטוי של ASCs על ידי immunofluorescence
<ol><li>הכינו את מאגר הכביסה המכיל 1x PBS-0.05% Tween 20. בצעו את השטיפות ב-RT ובטלטול איטי. לשטוף את הצלחות שלוש פעמים עם 2 מ"ל של חיץ / באר (לדגור במשך 3 דקות עבור כל כביסה).</li>
	<li>מניחים 1 מ"ל של מגיב חוסם (1:10) ודגורים עם תסיסה איטית במשך 20 דקות.</li>
	<li>הוסף 200 μL (דילול 1:50) של הנוגדנים העיקריים הבאים לכל באר: CD9 (עכבר חד שבטי), CD34 (ארנב רב-שבטי) ואנטי-CD63 (עז רב-שבטית). לדגור לילה ב 4 °C (75 °F).</li>
	<li>שטפו את הצלחות שלוש פעמים שוב ודגרו עם 200 μL (דילול 1:50) של הנוגדנים המשניים הבאים: עז מצומדת נגד עכבר IgG FITC, חמור נגד עז IgG DyeLight 550, ועז נגד ארנב IgG Cy3.</li>
	<li>יש לשטוף שלוש פעמים עם 1x PBS-0.05% Tween 20 ולהכתים את גרעיני התא ב-100 μL של DRAQ-7 (דילול: 17 μL ב-1 מ"ל מים מזוקקים כפול) למשך 20 דקות.</li>
	<li>שטפו שלוש פעמים נוספות והרכיבו את המגלשות לפי שלבים 4.1.12-4.1.13. יש לאחסן את הדגימות מוגנות מפני אור ומוקפאות עד לשימוש.</li>
	<li>דמיינו את הדגימות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי אפיפלואורסצנטי באמצעות ההגדרות והתוכנה המתאימות המומלצות לציוד זה.</li>
</ol>6. סמני ביטוי של ASCs לפי ציטומטריית זרימה
<ol><li>התאם תרחיף תא בודד מתאים שעברו טריפסינזציה או הפשרה (תת-מעברים 3 או 4) בריכוז של 1 x 106 תאים/מ"ל של 1x PBS-5% FBS. Aliquot 100 μL עם 100,000 תאים בצינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל. השתמש ב- aliquot אחד ללא תיוג עבור בקרת הפלואורסצנטיות האוטומטית.</li>
	<li>הוסף למנוחה את כל הכמויות המתאימות של Anti-CD105 AF-594 ו- Anti-CD31 AF-680, בהתאם להוראות היצרן. לדגור בחושך במשך 20 דקות ב 4 ° C.</li>
	<li>יש לשטוף את הכתם העודף עם 1 מ"ל של 1x PBS-5% FBS על ידי צנטריפוגה ב 250 x גרם במשך 5 דקות ולהשהות ב 300 μL של 1% פורמלין.</li>
	<li>בצע רכישת דגימה על ציטומטר זרימה. אסטרטגיית ה-gating של התאים מבוססת על גידור FSC-A לעומת SSC-A, תאים בודדים מגודרים באמצעות SSC-H לעומת SSC-A ואחריו FSC-A לעומת FSC-H.</li>
	<li>השתמש בגלאי Y610-mCherry-A עבור CD105 AF-594 וגלאי R660-APC-A עבור CD31 AF-680.</li>
</ol>7. בידול ASCs לשושלת האדיפוגנית
<ol><li>בצלחת 6 בארות, זרע 1 x 10 4 תאים (P-4) לכל ס"מ 2 ודגור ב 37 ° C, 5% CO2, עד 60-80% מפגש (~ 72-96 שעות). השראת התמיינות ישירות על מדיום התרבית: 4 מיקרומטר אינסולין, 1 מיקרומטר דקסמתזון 21-אצטט (Dxa), ו-0.5 מילימטר של 3-איזובוטיל-1-מתיל-קסנטין (MIX). שנה את מדיום הבידול כל 2-3 ימים.</li>
	<li>הכינו תמיסת מלאי של 800 מיקרומטר אינסולין ב-2 מ"ל מים סטריליים אולטרה-טהורים (הוסיפו 20 מיקרוליטר של 1 N HCl כדי להבטיח פירוק מלא) ואחסנו בטמפרטורה של -20°C. הוסף 10 μL של מלאי אינסולין, בעבר מדולל 1:100, ולהחיל 10 μL בנפח הסופי של 2 מ"ל לכל באר.</li>
	<li>הכינו תמיסת מלאי של 1 mM Dxa ב 5 מ"ל של מים סטריליים טהורים במיוחד (שים לב כי המסה מלאה אינה מתרחשת). יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. הוסף 40 μL/well של דילול 1:4 של מלאי Dxa.</li>
	<li>הכינו מלאי של 100 מילימטר של MIX ב-2.5 מ"ל של 0.1 N NaOH, מערבולת, והוסיפו 40 מיקרוליטר של 1 N NaOH לפירוק מלא. יש לאחסן בטמפרטורה של -70°C. הוסף 10 μL / באר של מלאי MIX.</li>
	<li>סנן את תמיסות המלאי דרך מסנן מזרק סטרילי בגודל 0.22 מיקרומטר לפני האחסון.</li>
	<li>ביום ה-12, יש לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS 1x ולדגור עם 500 μL של 4% פורמלין במשך שעה אחת ב-RT. לשטוף כל באר פעמיים עם מים מזוקקים ולאחר מכן, על ידי 60% איזופרופנול במשך 5 דקות ולתת להתייבש.</li>
	<li>הוסיפו 0.5% שמן אדום O מדולל ב-60% איזופרופנול (500 מיקרוליטר/באר) ודגרו במשך 20 דקות ב-RT. שטפו עם 1 מ"ל מים מזוקקים שלוש פעמים והתבוננו תחת מיקרוסקופ הפוך. הערה: לקבלת ריאגנטים, ציוד וחומרים נדרשים, עיין בטבלת החומרים.</li>
</ol>

בידוד ואפיון תאי גזע שמקורם ברקמת שומן

<ol>
	<li>Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+\anatomic+site+and+age+on+the+replication+and+differentiation+of+rat+adipocyte+precursors+in+culture.">Influence of \anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture.</a> The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).</li><li>Greenwood, M. R., Hirsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+development+of+adipocyte+cellularity+in+the+normal+rat.">Postnatal development of adipocyte cellularity in the normal rat.</a> Journal of Lipid Research. 15 (5), 474-483 (1974).</li><li>Gonz&#225;lez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineering of the cartilage tissue: application of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow for use in cartilage tissue regeneration. , (2014).</li><li>Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cell+yield+and+growth+characteristics+are+affected+by+the+tissue-harvesting+procedure.">Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure.</a> Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).</li><li>Sherman, L. S., Conde-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-free+method+for+isolation+and+expansion+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).</li><li>Cowan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+adult+stromal+cells+heal+critical-size+mouse+calvarial+defects.">Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects.</a> Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).</li><li>Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose+tissue-derived+stem+cells:+enzymatic+digestion+in+combination+with+mechanical+distortion+to+increase+adipose+tissue-derived+stem+cell+yield+from+human+aspirated+fat.">Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).</li><li>Gittel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+equine+multipotent+mesenchymal+stromal+cells+by+enzymatic+tissue+digestion+or+explant+technique:+comparison+of+cellular+properties.">Isolation of equine multipotent mesenchymal stromal cells by enzymatic tissue digestion or explant technique: comparison of cellular properties.</a> BMC Veterinary Research. 9, 221 (2013).</li><li>Aliborzi, G., Vahdati, A., Mehrabani, D., Hosseini, S. E., Tamadon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization+and+growth+kinetic+comparison+of+bone+marrow+and+adipose+tissue+mesenchymal+stem+cells+of+guinea+pig.">Isolation, characterization and growth kinetic comparison of bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells of guinea pig.</a> International Journal of Stem Cells. 9 (1), 115-123 (2016).</li><li>Jurgens, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+tissue-harvesting+site+on+yield+of+stem+cells+derived+from+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Cell and Tissue Research. 332 (3), 415-426 (2008).</li><li>Secunda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+expansion+and+characterisation+of+mesenchymal+stem+cells+from+human+bone+marrow,+adipose+tissue,+umbilical+cord+blood+and+matrix:+a+comparative+study.">Isolation, expansion and characterisation of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood and matrix: a comparative study.</a> Cytotechnology. 67 (5), 793-807 (2015).</li><li>Tholpady, S. S., Katz, A. J., Ogle, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+from+rat+visceral+fat+exhibit+multipotential+differentiation+in+vitro.">Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibit multipotential differentiation in vitro.</a> The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 272 (1), 398-402 (2003).</li><li>Yoshimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-assisted+lipotransfer+for+cosmetic+breast+augmentation:+supportive+use+of+adipose-derived+stem/stromal+cells.">Cell-assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation: supportive use of adipose-derived stem/stromal cells.</a> Aesthetic Plastic Surgery. 32 (1), 48-57 (2008).</li><li>Si, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells:+Sources,+potency,+and+implications+for+regenerative+therapies.">Adipose-derived stem cells: Sources, potency, and implications for regenerative therapies.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 114, 108765 (2019).</li><li>Hammoud, S. H., AlZaim, I., Al-Dhaheri, Y., Eid, A. H., El-Yazbi, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perirenal+adipose+tissue+inflammation:+Novel+insights+linking+metabolic+dysfunction+to+renal+diseases.">Perirenal adipose tissue inflammation: Novel insights linking metabolic dysfunction to renal diseases.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 707126 (2021).</li><li>Liu, B. X., Sun, W., Kong, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perirenal+fat:+A+unique+fat+pad+and+potential+target+for+cardiovascular+disease.">Perirenal fat: A unique fat pad and potential target for cardiovascular disease.</a> Angiology. 70 (7), 584-593 (2019).</li><li>Lee, J., Han, D. J., Kim, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+human+adipose+tissue-derived+stem+cells+into+cells+with+pancreatic+phenotype+by+regenerating+pancreas+extract.">In vitro differentiation of human adipose tissue-derived stem cells into cells with pancreatic phenotype by regenerating pancreas extract.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 375 (4), 547-551 (2008).</li><li>Chandra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet-like+cell+aggregates+generated+from+human+adipose+tissue+derived+stem+cells+ameliorate+experimental+diabetes+in+mice.">Islet-like cell aggregates generated from human adipose tissue derived stem cells ameliorate experimental diabetes in mice.</a> PLoS One. 6 (6), e20615 (2011).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Huang, S. J., Yang, W. S., Lin, Y. W., Wang, H. C., Chen, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+of+insulin+sensitivity+and+reversal+of+age-dependent+glucose+intolerance+with+inhibition+of+ASIC3.">Increase of insulin sensitivity and reversal of age-dependent glucose intolerance with inhibition of ASIC3.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 729-734 (2008).</li><li>Jang, H. J., Cho, K. S., Park, H. Y., Roh, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue-derived+stem+cells+for+cell+therapy+of+airway+allergic+diseases+in+mouse.">Adipose tissue-derived stem cells for cell therapy of airway allergic diseases in mouse.</a> Acta Histochemica. 113 (5), 501-507 (2011).</li><li>Haasters, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+immunocytochemical+characteristics+indicate+the+yield+of+early+progenitors+and+represent+a+quality+control+for+human+mesenchymal+stem+cell+culturing.">Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing.</a> Journal of Anatomy. 214 (5), 759-767 (2009).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+pig+adipose-derived+progenitor+cells.">Identification and characterization of pig adipose-derived progenitor cells.</a> Canadian Journal of Veterinary Research. 80 (4), 309-317 (2016).</li><li>Varma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypical+and+functional+characterization+of+freshly+isolated+adipose+tissue-derived+stem+cells.">Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells.</a> Stem Cells and Development. 16 (1), 91-104 (2007).</li><li>Palumbo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolation,+characterization+and+expansion+of+human+adipose-derived+stem+cells+(ASCs):+An+overview.">Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): An overview.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).</li><li>Yu, B., Zhang, X., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+mesenchymal+stem+cells.">Exosomes derived from mesenchymal stem cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).</li><li>Maumus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+human+adipose+stromal+cells:+localization,+morphology,+and+phenotype.">Native human adipose stromal cells: localization, morphology, and phenotype.</a> International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).</li><li>Helmy, M. A., Mohamed, A. F., Rasheed, H. M., Fayad, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+primary+isolation+and+culture+of+adipose-derived+stem+cells+and+their+phenotypic+profile.">A protocol for primary isolation and culture of adipose-derived stem cells and their phenotypic profile.</a> Alexandria Journal of Medicine. 56 (1), 42-50 (2020).</li><li>He, Q., Ye, Z., Zhou, Y., Tan, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+mesenchymal+stem+cells+from+rat+bone+marrow+and+adipose+tissue.">Comparative study of mesenchymal stem cells from rat bone marrow and adipose tissue.</a> Turkish Journal of Biology. 42 (6), 477-489 (2018).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים.

בארבעת העשורים האחרונים מאז גילוי MSCs, כמה קבוצות של חוקרים תיארו הליכים להשגת MSCs מרקמות ומינים שונים. אחד היתרונות של שימוש בחולדות כמודל של בעלי חיים הוא התחזוקה הקלה וההתפתחות המהירה שלהן, כמו גם הקלות של קבלת MSCs מרקמת השומן. מקורות רקמה שונים תוארו לקבלת ASCs, כגון ויסצרלי, פריrenal, epididymal, ו?...

תאי גזע מזנכימליים (MSCs) השפיעו מאוד על הרפואה הרגנרטיבית בשל יכולתם הגבוהה להתחדשות עצמית, התפשטות, הגירה והתמיינות לשושלות תאים שונות 1,2. כיום, מחקרים רבים מתמקדים בפוטנציאל שלהם לטיפול ואבחון של מחלות שונות.
ישנם מקורות שונים של תאים מזנכימליים: מח עצם, שרירי שלד, מי שפיר, זקיקי שיער, שליה ורקמת שומן, בין היתר. הם מתקבלים ממינים שונים, כולל בני אדם, עכברים, חולדות, כלבים וסוסים3. MSCs שמקורם במח עצם (BMSCs) שימשו במשך שנים רבות כמקור עיקרי לתאי גזע ברפואה רגנרטיבית וכחלופה לשימוש בתאי גזע עובריים4. עם זאת, MSCs נגזר שומן, או תאי גזע נגזר שומן (ASC), הם חלופה חשובה עם יתרונות גדולים בשל קלות האיסוף והבידוד שלהם, כמו גם את התשואה של תאים המתקבלים לכל גרם של רקמת שומן 5,6. דווח כי קצב הקציר של ASCs הוא בדרך כלל גבוה יותר מזה של BMSCs7. בתחילה הוצע כי יכולת התיקון/התחדשות של ASCs נובעת מיכולתם להתמיין לשושלות תאים אחרות8. עם זאת, מחקרים בשנים האחרונות חיזקו את התפקיד העיקרי של גורמים פרקריניים ששוחררו על ידי ASCs בפוטנציאל התיקון שלהם 9,10.
רקמת השומן (AT), בנוסף להיותה עתודת אנרגיה, מקיימת אינטראקציה עם המערכת האנדוקרינית, העצבים והלב וכלי הדם. הוא מעורב גם בצמיחה והתפתחות לאחר הלידה, תחזוקה של הומאוסטזיס רקמות, תיקון רקמות, והתחדשות. ה- AT מורכב מאדיפוציטים, תאי שריר חלק של כלי הדם, תאי אנדותל, פיברובלסטים, מונוציטים, מקרופאגים, לימפוציטים, פרדיפויטים ו- ASC. אלה האחרונים בעלי תפקיד חשוב ברפואה רגנרטיבית בשל האימונוגניות הנמוכה שלהם11,12. ASCs ניתן להשיג על ידי עיכול אנזימטי ועיבוד מכני או על ידי חצילים רקמת שומן. תרבויות ראשוניות של ASCs קלות לתחזוקה, צמיחה והרחבה. אפיון פנוטיפי של ASCs חיוני כדי לאמת את זהות התאים על ידי הערכת הביטוי של סמנים ספציפיים בממברנה באמצעות שיטות כגון immunofluorescence ו cytometry זרימה13. הפדרציה הבינלאומית לטיפולי שומן ומדע (IFATS) והאגודה הבינלאומית לטיפול תאי (ISCT) הגדירו כי ASCs מבטאים CD73, CD90 ו- CD105, בעוד שחסרים את הביטוי של CD11b, CD14, CD19, CD45 ו- HLA-DR14. סמנים אלה, הן חיוביים והן שליליים, נחשבים לפיכך אמינים לאפיון ASC.
פרויקט זה התמקד בתיאור הליך לבידוד וזיהוי של תאים מזנכימליים בוגרים שהופקו מתאי AT, שכן מקור תאים זה אינו מציב אתגרים אתיים, בניגוד לתאי גזע עובריים. זה ממצק את ההליך כאפשרות מעשית בגלל קלות הגישה והשיטה הזעיר פולשנית בהשוואה לתאי גזע שמקורם במח עצם. 
לתאים מזנכימליים ממקור רקמה זה יש תפקיד חשוב ברפואה רגנרטיבית בגלל יכולותיהם האימונומודולטוריות ודחייה חיסונית נמוכה. לכן, המחקר הנוכחי הוא חלק מהותי במחקר עתידי על הפרשתם ויישומם כטיפול רגנרטיבי במחלות שונות, כולל מחלות מטבוליות כגון סוכרת.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30078.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>AX224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti- CD9 (C-4)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-13118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-CD34 (C-18)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-7045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-C63</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-5275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 </td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-18838A594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-18916AF680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 </td>
			<td>Novus</td>
			<td>NB 120-6939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SA5-10087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab&#180;)</td>
			<td>RD Systems.</td>
			<td>No. F103B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Top Filter Sterile</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>10718003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell and Tissue Culture Flasks</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>170718-312B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides</td>
			<td>SIGMA Aldrich </td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell wells: 6 well with Lid</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>25810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge conical tubes</td>
			<td>HeTTICH</td>
			<td>ROTANA460R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge eppendorf tubes</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>M0018242_44797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV </td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial</td>
			<td>SPL Life Science</td>
			<td>43112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One </td>
			<td>191180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytExpert 2.0</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Free version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFlex LX cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>FLOW-2463VID03.17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31600-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td> 67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DraQ7 Dye</td>
			<td>Thermo Sc. </td>
			<td>D15106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin yellowish</td>
			<td>Hycel</td>
			<td>300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>Baker</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One </td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One </td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum </td>
			<td>CORNING</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>128111163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15750045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin-High Purity</td>
			<td>Herschi Trading </td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>AMRESCO </td>
			<td>0701-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 240i CO2 Incubator </td>
			<td>Thermo Sc.</td>
			<td>50116047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate)</td>
			<td>Aranda</td>
			<td>SV057430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine </td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc. </td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM software Zen 2009 V5.5</td>
			<td></td>
			<td>Free version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet Class II</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>12082100801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent microscope </td>
			<td>Zeiss Axiovert 100M</td>
			<td>21.0028.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope </td>
			<td>Olympus CK40</td>
			<td>CK40-G100 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids 100X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 2 mL </td>
			<td>Sarstedt </td>
			<td>72695400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 1,5 mL</td>
			<td>Sarstedt </td>
			<td>72706400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 0.2-2 &#956;L</td>
			<td>Finnpipette</td>
			<td>E97743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 2-20 &#956;L</td>
			<td>Finnpipette</td>
			<td>F54167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 20-200 &#956;L</td>
			<td>Finnpipette</td>
			<td>G32419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 100-1000 &#956;L</td>
			<td>Finnpipette</td>
			<td>FJ39895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen tank liquid</td>
			<td>Taylor-Wharton</td>
			<td>681-021-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>SLBC3029V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / Streptomycin </td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc. </td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish Cell culture</td>
			<td>CORNING Inc</td>
			<td>480167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tips</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>301-03-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pisabental (pentobarbital sodium)</td>
			<td>PISA Agropecuaria</td>
			<td>Q-7833-215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride </td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>J.T Baker</td>
			<td>2139900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1 Pipette Fillers</td>
			<td>Thermo Sc</td>
			<td>9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 5 mL</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>L010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10 mL</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>L010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>J.T Baker</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride </td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>15368426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>J.T Baker</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td>11840-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter Sterile</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>431222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>PerkinElmer Lambda 25</td>
			<td>L6020060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titer plate shaker</td>
			<td>LAB-LINE</td>
			<td>1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipets</td>
			<td>Samco/Thermo Sc</td>
			<td>728NL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>1198566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin From Porcine Pancreas</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>102H0234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Blocking Reagent 10x</td>
			<td>BioGenex</td>
			<td>HK085-GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xilapet 2% (xylazine hydrochloride)</td>
			<td>Pet&#39;s Pharma</td>
			<td>Q-7972-025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and identification of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue of sprague dawley rats

תאים מזנכימליים בוגרים חוללו מהפכה בביולוגיה המולקולרית ובביולוגיה התאית בעשורים האחרונים. הם יכולים להתמיין לסוגי תאים מיוחדים שונים, בנוסף ליכולתם הגדולה להתחדשות עצמית, הגירה והתפשטות. רקמת השומן היא אחד המקורות הפחות פולשניים והנגישים ביותר של תאים מזנכימליים. כמו כן, דווח כי יש לו תשואות גבוהות יותר בהשוואה למקורות אחרים, כמו גם תכונות אימונומודולטוריות מעולות. לאחרונה פורסמו נהלים שונים להשגת תאים מזנכימליים בוגרים ממקורות רקמה שונים וממיני בעלי חיים. לאחר הערכת הקריטריונים של מחברים מסוימים, תיקננו מתודולוגיה ישימה למטרות שונות וניתנת לשחזור בקלות. מאגר של מקטע כלי דם סטרומה (SVF) מרקמת שומן פרירנלית ואפידידימלית איפשר לנו לפתח תרביות ראשוניות עם מורפולוגיה ופונקציונליות אופטימליות. התאים נצפו דבוקים למשטח הפלסטיק במשך 24 שעות, והציגו מורפולוגיה דמוית פיברובלסט, עם הארכות ונטייה ליצור מושבות. טכניקות ציטומטריית זרימה (FC) ואימונופלואורסנציה (IF) שימשו להערכת הביטוי של סמני הממברנה CD105, CD9, CD63, CD31 ו- CD34. יכולתם של תאי גזע שמקורם בשומן (ASC) להתמיין לשושלת האדיפוגנית הוערכה גם באמצעות קוקטייל של גורמים (4 מיקרומטר אינסולין, 0.5 מילימטר 3-מתיל-איזו-בוטיל-קסנטין ו-1 מיקרומטר דקסמתזון). לאחר 48 שעות, אובדן הדרגתי של מורפולוגיה פיברובלסטואיד נצפתה, ובגיל 12 ימים, נוכחות של טיפות שומנים חיובי שמן כתמים אדום אושר. לסיכום, מוצע הליך להשגת תרביות ASC אופטימליות ותפקודיות ליישום ברפואה רגנרטיבית.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have strongly impacted regenerative medicine due to their high capacity for self-renewal, proliferation, migration, and differentiation into different cell lineages1,2. Currently, a great deal of research is focusing on their potential for the treatment and diagnosis of various diseases.
There are different sources of mesenchymal cells: bone marrow, skeletal muscle, amniotic fluid, hair follicles, placenta, and adipose tissue, among others. They are obtained from different species, including humans, mice, rats, dogs, and horses3. Bone marrow-derived MSCs (BMSCs) have been used for many years as a major source of stem cells in regenerative medicine and as an alternative to the use of embryonic stem cells4. However, adipose-derived MSCs, or adipose-derived stem cells (ASCs), are an important alternative with great advantages due to their ease of collection and isolation, as well as the yield of cells obtained per gram of adipose tissue5,6. It has been reported that the harvest rate of ASCs is generally higher than that of BMSCs7. It was initially proposed that the reparative/regenerative capacity of ASCs was due to their ability to differentiate into other cell lineages8. However, research in recent years has reinforced the primary role of paracrine factors released by ASCs in their reparative potential9,10.
Adipose tissue (AT), in addition to being an energy reserve, interacts with the endocrine, nervous, and cardiovascular systems. It is also involved in postnatal growth and development, the maintenance of tissue homeostasis, tissue repair, and regeneration. The AT is composed of adipocytes, vascular smooth muscle cells, endothelial cells, fibroblasts, monocytes, macrophages, lymphocytes, preadipocytes, and ASCs. The latter possess an important role in regenerative medicine due to their low immunogenicity11,12. ASCs can be obtained by enzymatic digestion and mechanical processing or by adipose tissue explants. Primary cultures of ASCs are easy to maintain, grow, and expand. Phenotypic characterization of ASCs is essential to verify the identity of the cells by assessing the expression of specific membrane markers using methods such as immunofluorescence and flow cytometry13. The International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT) have defined that ASCs express CD73, CD90, and CD105, while lacking the expression of CD11b, CD14, CD19, CD45, and HLA-DR14. These markers, both positive and negative, are therefore considered reliable for the characterization of ASCs.
This project was focused on describing a procedure for the isolation and identification of adult mesenchymal cells extracted from rats' AT, as this source of cells does not present ethical challenges, unlike embryonic stem cells. This solidifies the procedure as a viable option because of the ease of access and minimally invasive method compared to bone marrow-derived stem cells. 
Mesenchymal cells from this tissue source have an important role in regenerative medicine because of their immunomodulatory capabilities and low immune rejection. Therefore, the present study is a fundamental part of future research into their secretome and their application as regenerative therapy in different diseases, including metabolic diseases such as diabetes.

מחבר זרקור: בידוד וזיהוי של תאי גזע מזנכימליים שמקורם ברקמת שומן של חולדות Sprague Dawley  

בידוד וזיהוי תאי גזע מזנכימליים שמקורם ברקמת שומן של חולדות Sprague Dawley

Mesenchymal stem cells have a really broad role in cellular communication due to their paracrine function. This protocol obtains adipose-derived mesenchymal stem cells with morphological, immunophenotypical, and adequate functionality for use in studying therapies for pancreatic regeneration and diabetes. There has been increased use of cell therapies in the treatment of diabetes.These therapies include allogenic transplants of pancreatic cells, autologous stem cell-derived products of insulin-producing cells, and 3D-printed pancreatic tissue using biological inks. Most research primarily studied the secretome components and the role in the regulation of different cellular processes. New techniques like microarrays and next-generation sequencing can investigate the function of miRNAs.A challenge in this area is to achieve greater stimulation of mesenchymal cells, reaching precise molecular composition in the secretome, and directing it to the treatment of a specific conditions. We will be evaluating how an miRNAs contribute to pancreatic tissue degeneration exposed to oxidative stress. The study will involve usage of stem cells from adipose tissue.

רקמת השומן התקבלה מחולדות בוגרות של Sprague Dawley בגילאי 3-4 חודשים ומשקל גוף של 401 ± 41 גרם (ממוצע גיאומטרי ± SD). ערך ממוצע של 3.8 גרם של רקמת שומן אפידידימלית ופרירנלית התאים לניתוח של 15 מיצויים ניסיוניים. לאחר 24 שעות של תרבית, אוכלוסיות התאים נותרו דבוקות למשטח הפלסטיק והציגו מורפולוגיה הטרוגנית. ה...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats at JoVE.com

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה לבידוד וזיהוי תאי גזע מזנכימליים (MSC) שמקורם ברקמת שומן מחולדות Sprague Dawley.

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

לתאי גזע מזנכימליים יש תפקיד רחב מאוד בתקשורת התאית בשל תפקודם הפרקריני. פרוטוקול זה משיג תאי גזע מזנכימליים שמקורם בשומן עם פונקציונליות מורפולוגית, אימונופנוטיפית ונאותה לשימוש בחקר טיפולים להתחדשות הלבלב ולסוכרת. יש שימוש מוגבר בטיפולים תאיים בטיפול בסוכרת.טיפולים אלה כוללים השתלות אלוגניות של תאי לבלב, מוצרים אוטולוגיים שמקורם בתאי גזע של תאים מייצרי אינסולין, ורקמת לבלב מודפסת בתלת-ממד באמצעות דיו ביולוגי. רוב המחקרים עסקו בעיקר במרכיבי ההפרשה ובוויסות תהליכים תאיים שונים. טכניקות חדשות כמו מיקרו-מערכים וריצוף הדור הבא יכולות לחקור את תפקודם של miRNA.אתגר בתחום זה הוא להשיג גירוי גדול יותר של תאים מזנכימליים, להגיע להרכב מולקולרי מדויק בהפרשה, ולכוון אותה לטיפול במצב מסוים. אנו נעריך כיצד miRNA תורם לניוון רקמת הלבלב החשופה לעקה חמצונית. המחקר יכלול שימוש בתאי גזע מרקמת שומן.

isolation-identification-mesenchymal-stem-cells-derived-from-adipose

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

1.9K Views.  Universidad Autónoma Metropolitana. לתאי גזע מזנכימליים יש תפקיד רחב מאוד בתקשורת התאית בשל תפקודם הפרקריני. פרוטוקול זה משיג תאי גזע מזנכימליים שמקורם בשומן עם פונקציונליות מורפולוגית, אימונופנוטיפית ונאותה לשימוש בחקר טיפולים להתחדשות הלבלב ולסוכרת. יש שימוש מוגבר בטיפולים תאיים בטיפול בסוכרת.טיפול?...

Video: מחבר זרקור: בידוד וזיהוי של תאי גזע מזנכימליים שמקורם ברקמת שומן של חולדות Sprague Dawley  

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in addition to their great capacity for self-renewal, migration, and proliferation. Adipose tissue is one of the least invasive and most accessible sources of mesenchymal cells. It has also been reported to have higher yields compared to other sources, as well as superior immunomodulatory properties. Recently, different procedures for obtaining adult mesenchymal cells from different tissue sources and animal species have been published. After evaluating the criteria of some authors, we standardized a methodology that is applicable to different purposes and easily reproducible. A pool of stromal vascular fraction (SVF) from perirenal and epididymal adipose tissue allowed us to develop primary cultures with optimal morphology and functionality. The cells were observed adhered to the plastic surface for 24 h, and exhibited a fibroblast-like morphology, with prolongations and a tendency to form colonies. Flow cytometry (FC) and immunofluorescence (IF) techniques were used to assess the expression of the membrane markers CD105, CD9, CD63, CD31, and CD34. The ability of adipose-derived stem cells (ASCs) to differentiate into the adipogenic lineage was also assessed using a cocktail of factors (4 &#181;M insulin, 0.5 mM 3-methyl-iso-butyl-xanthine, and 1 &#181;M dexamethasone). After 48 h, a gradual loss of fibroblastoid morphology was observed, and at 12 days, the presence of lipid droplets positive to oil red staining was confirmed. In summary, a procedure is proposed to obtain optimal and functional ASC cultures for application in regenerative medicine.

This protocol describes a methodology for isolating and identifying adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (MSCs) from Sprague Dawley rats.

Murine Adipose Tissue Excision

Shave the abdominal and inguinal regions of two sedated adult male Sprague Dawley rats. Disinfect the shaved regions with an iodine solution. Make a medial longitudinal incision from the sternum to the testicular region, Using a pair of sterile forceps, remove the adipose tissue from the epididymidis and the kidneys.Place the tissue in conical tubes containing 20 milliliters of cold, sterile PBS-AA solution.

כריתת רקמת שומן מורין

Murine Adipose-Derived Mesenchymal Cell Isolation, Maintenance and Characterization

Inside a biosafety cabinet, remove the murine adipose tissue with sterile forceps. Once excess PBS is removed, transfer the tissue to another petri dish and wash twice for five minutes each with 10 milliliters of PBS AA solution. Add 20 milliliters of prepared collagenase solution into a crystal beaker containing one square centimeter sized fragmented tissue and a magnetic bar.Incubate the sealed beaker at 37 degrees Celsius with continuous agitation. Filter the homogenate through a 40-mesh 0.38-millimeter stainless steel aperture Filter on a petri dish and collect the cell suspension in a sterile 50-milliliter conical tube. Carefully suspend the stromal vascular fraction in 20 milliliters of warm supplemented DMEM and centrifuge the suspension.After discarding the supernatant, gently wash the cells twice with 40 milliliters of non-supplemented DMEM medium. Suspend the palate in five milliliters of supplemented DMEM. Transfer the suspension to a 25-square centimeter T bottle and incubate.Wash cells three times with five milliliters of warm PBS AA and twice with non-supplemented DMEM. To remove any cell debris and non-murine cells add five milliliters of fresh, warm supplemented DMEM and change the medium every three to four days. Once the cells reach 90 to 100%confluency, add one milliliter of warm trypsin EDTA solution to the DMEM washed cells.Incubate for five to seven minutes at 37 degrees Celsius. Add four milliliters of supplemented DMEM to the detached cell monolayer and gently disaggregate the suspension. Suspend the cells in five milliliters of warm supplemented DMEM.After centrifuging and discarding the supernatant, gently mix the pellet in one milliliter of supplemented DMEM. Stain the cells with trypan blue and count them in a Neubauer chamber. Seed cells in T-75 flasks.To ensure colony formation and high proliferation, observe the morphology of the hematoxylin and eosin-stained cells under an optical microscope. hematoxylin and eosin staining reveal extensive cytoplasm with elongated prolongations and abundant intracellular microfilaments.

בידוד תאים מזנכימליים שמקורם בשומן מורין, תחזוקה ואפיון

Immunofluorescent Detection of Adipose-Derived Stem Cell Expression Markers

Begin by washing murine adipose-derived stem cells in a six-well plate with two milliliters of wash buffer. Add one milliliter of blocking reagent after incubating and washing the cells thrice. Incubate the cells with slow agitation for 20 minutes.Add 200 microliters of the primary antibodies to each well and incubate overnight at four degrees Celsius. After washing the plates thrice as demonstrated previously, incubate with 200 microliters of the secondary antibodies. Counterstain the cell nuclei with 100 microliters of DRAQ7 for 20 minutes after washing the plates thrice.Repeat washing and mount slides. Visualize the mounted slides under epifluorescence confocal microscopy. Adipose-derived stem cells were 100%positive for CD9 surface markers in all subpassages tested.All cells expressed CD63 markers in the subpassages one, three and nine, while 49.3%of the cells expressed it in passage seven. CD34 markers were absent in passages one, seven, and nine, but visible in passage three.

זיהוי אימונופלואורסצנטי של סמני ביטוי תאי גזע שמקורם בשומן

Flow Cytometric Detection of Adipose-Derived Stem Cell Expression Markers

Begin by adjusting the concentration of thawed murine adipose-derived stem cell suspension using PBS with 5%fetal bovine serum. Aliquot 100 microliters of the suspension containing 100, 000 cells into a 1.5 milliliter centrifuge tube. Add appropriate amounts of anti-CD105 AF594 and anti-CD31 AF680 as per the manufacturer's instructions.Incubate for 20 minutes in the dark at four degrees Celsius. Remove excess stain by washing with PBS/FBS and centrifuge at 250 x g for five minutes. Resuspend the cells in 300 microliters of 1%formalin.Create a dot plot graph by clicking on the polygon symbol to select the subpopulation of interest and exclude the debris areas using FSC-A versus SSC-A gating. Next, click on the polygon symbol to generate a new dot plot and exclude the duplexes and multiples cells using SSC-H versus SSC-A followed by FSC-H and FSC-A. Use Y610-mCHERRY for the AF594 and the R660 APC-A detectors for the AF680 fluorophores, respectively.Click on the quadrant symbol and set each detector's threshold for autofluorescence cells. Select samples labeled with CD105 and positive population to be shown on Q1LR. Next, choose samples labeled with CD31 and positive population to be shown on Q1LR.Immunophenotyping showed that 98.7%of the cell population was positive for CD105, while only 5.88%expressed the CD31 marker.

זיהוי ציטומטרי זרימה של סמני ביטוי תאי גזע שמקורם בשומן

Adipose-Derived Stem Cell Differentiation to the Adipogenic Lineage

Begin by seeding a six well plate with 10, 000 adipose-derived stem cells per square centimeter. Once cells become 60 to 80%confluent add the differentiation medium. On day 12, wash the cells trice with PBS and incubate them with 500 microliters of 4%formalin for one hour at room temperature.Once the cells are washed with distilled water, wash them with 60%isopropanol for five minutes and let them dry. Add 500 microliters of 0.5%oil red O staining dye diluted in 60%alcohol. After incubation at room temperature wash the wells twice with one milliliter of distilled water and observe the plate under an inverted microscope.Adipose-derived stem cells differentiated towards the adipogenic lineage showing reduced cell size and rounded shape within 48 hours. After seven days, lipid vesicles were visible, which were positive for oil red staining 12 days after differentiation.