Neovascularization, יצירת כלי דם חדשים הוא תהליך מוסדר מאוד באירועים נורמליים ופתולוגיים כאחד. כדי להבין טוב יותר את הניאו-סקולריזציה, חשוב לשחזר את התהליך במיקרו-וירוס תאי טבעי במבחנה. פיתחנו שבב מיקרופלואידי ובקרה אוטומטית.
מחזורים יעילים מאוד נעשה כדי ליצור מיקרו צינורות זלוף לדמות להשתמש בחלבון כדי recapitulate לאירוע הראשוני של כלי דם חדשים. שבב הנבט המיקרופלואידי היה מורכב משלושה ערוצים. ערוץ תרבית תאי אנדותל וערוץ נוזלי הופרדו על ידי ערוץ הידרוג'ל מרכזי רחב.
מערכת הבקרה המיקרופלואידית הורכבה ממשאבת מיקרו-סירינג ושסתום צביטה אלקטרומגנטי. שבב מלכודת בועה, שבב נבט מיקרופלואידי, משאבה מיקרו-פריסטלית ומאגר תרבות בינוני. עם מערכת microfluidic, תאים אנדותל יכול להיות מגורה על ידי מתח גזירה זוהר גבוה, רמה פיזיולוגית של זרימה transendothelial והתפלגות גורם גדילה אנדותל כלי דם שונים בו זמנית.
פיפט 20 מיקרוליטר של 125 מיקרוגרם למיליליטר של פיברונקטין ליציאת הזרקת מדיה אחת של ערוץ תרבות התא. חותכים קצה פיפטה כדי להתאים את היציאה של ערוץ תרבות התא עם מספריים. הכנס את קצה הפיפט ליציאת הזרקת המדיה האחרת של ערוץ תרבות התאים.
לאחר מכן, פיפטה את האוויר מערוץ תרבות התא כדי למלא אותו עם פיברונקטין. דגירה השבבים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לפני זריעת תאים, פיפטה 20 מיקרוליטר של מדיום תא אנדותל לתוך כל יציאת הזרקת מדיה להדגיר את השבבים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
לאחר מכן, פיפטה הוציאה את כל המדיה בכל יציאות הזרקת המדיה. לאחר מכן, פיפטה חמש מיקרוליטר של השעיית תאים ליציאת הזרקת מדיה אחת של ערוץ תרבות התא. לאחר מכן, תאי אנדותל התפשטו במהירות על פני התעלה כולה תחת לחץ הידרוסטטי דיפרנציאלי.
הוסף כארבעה עד שישה מיקרוליטר של מדיה ECM ליציאה השנייה כדי להתאים את הלחץ ההידרוסטטי ולהפסיק את נעת התא. תריח את השבבים לחממה הסלולרית. לאחר מכן, להפוך את השבבים כל 30 דקות עד תאי אנדותל מעיל סביב פני השטח הפנימיים של ערוץ תרבות התא, שעתיים מאוחר יותר.
השתמש טיפ פיפטה כדי להסיר תאים מחוברים ביציאות ההזרקה בזהירות רבה. לאחר מכן, הכנס ארבעה מתאמי Luer נקבה דוקרני לתוך יציאות הזרקת מדיה ולמלא עם מדיה ECM. הסר את השבבים לאינקובטור התא, לשנות מדיה ECM ומתאמי לור כל 12 שעות.
כדי להרכיב את מערכת הבקרה המיקרופלואידית, הכינו שני צינורות פוליטרה-פלואורותילן, שני צינורות סיליקון קצרים, שלושה צינורות סיליקון ארוכים, מתאם לואר נקבה דוקרני אחד, מחבר אחד מסוג Y ולאחר מכן שלושה מחברים מסוג L. ממלאים את המזרק ב-10 מיליליטר של מדיום ECM שחומם מראש. חבר צינור פוליטרפלואורותילן למזרק על ידי מתאם לואר נקבה דוקרני.
לאחר מכן, חבר את הקצה השני של צינור פוליטרה-פלואוראתילן למחבר מסוג Y. לאחר מכן, חבר שני צינורות סיליקון ארוכים לשני הקצוות האחרים של מחבר מסוג Y. אנחנו משתמשים בצינור אחד כדי להתחבר למאגר ולצינור השני כדי להתחבר לשבב מלכודת בועה.
חבר צינור סיליקון ארוך נוסף למאגר. לאחר מכן, השתמש בשני צינורות סיליקון קצרים כדי לחבר את כל חורי כניסת ושקע בשכבה העליונה של שבב מלכודת בועה. חבר צינור פוליטרה-פלואורותילן לחלק האחורי של השבב.
לאחר מכן, לתקן מזרק על משאבת מזרק מיקרו. תקצץ שני צינורות סיליקון ארוכים לתוך שסתום הצביטה האלקטרומגנטית. לאחר מכן, החלף את שסתום הצביטה האלקטרומגנטית כדי לפתוח את הצינור בין המזרק למאגר.
להזריק מדיה למאגר באמצעות משאבת microsyringe כדי למצות את האוויר בצינור. לאחר מכן, החלף שוב את השסתום כדי לפתוח את הצינור בין המזרק לשבב מלכודת הבועה. להזריק מדיה כדי למלא את התא הנוזלי צינור backend של שבב מלכודת בועה.
מוציאים שבבי נבטי אנדותל מאינקובטור התאים, ואז מסירים מתאמי לור בצד תרבות התא. הכנס שני תקעי צינור ליציאות הזרקת הידרוג'ל של שבב נבט מיקרופלואידי. חבר את הצינור האחורי של שבב מלכודת בועה ליציאה אחת של ערוץ תרבות התא.
הכנס מחבר מסוג T ליציאה האחרת וחבר אותו לצינור סיליקון ארוך המחובר למאגר. חותכים את צינור הסיליקון הארוך לתוך משאבת מיקרו פריסטלית. לאחר מכן, הכנס מסנן אוויר למאגר.
לאחר מכן, להרכיב את שבב נבטי מיקרופלואידי לחממה העליונה הבמה. לאחר מכן, חבר את משאבת הוואקום לחורים בשכבה התחתונה של שבב מלכודת בועה על ידי צינור TPU. הגדר נפח מחזור הפוך וקצב זרימה בתוכנית המותאמת אישית השולטת במשאבת microsyringe ושסתום קמצוץ אלקטרומגנטי בו זמנית.
לאחר מכן, הגדר את קצב הזרימה של משאבה מיקרו פריסטלית. הפעל את משאבת המיקרו-מזרק. לאחר מכן, מערכת בקרת זרימת הדם הוקמה.
אנו בודקים את פונקציית המחסום של כמה מיקרו-כלי במודל שלנו על ידי מדידת מקדם החדירות הדיפוזינלי של 40 kDa F-I-T-C dextrin. כפי שמוצג באיור, מקדם החדירות הדיפוזיונית של שבב תרבות סטטית עם רירית התא הוא 0.1 פלוס או מינוס 0.3 מיקרומטר לשנייה. ומקדם החדירות הדיפוזינלי של ערוץ ריק ללא בטנת תאים הוא 5.4 פלוס או מינוס 0.7 מיקרומטר לשנייה.
בדיקת נבטי אנדותל הראתה כי תאי אנדותל צמחו לתוך הידרוג'ל המרכזי בעיקר לאחר 24 שעות של פולחן סטטי, בעוד מידת הנבטים ירדה באופן משמעותי עם העלייה של מתח גזירה זוהר. מבחינה כמותית, לחץ גזירה זוהר ירד נבטי אנדותל באופן משמעותי במונחים של שטח נבטים, אורך נבט ממוצע, ואת אורך הנבט הארוך ביותר. עם המערכת שלנו, לחץ גזירה על תאי אנדותל יכול להיות שונה באופן אופציונלי בכל עת במהלך הניסוי בעוד זרימת transendothelial נשאר ברמה הפיזיולוגית.
מודל זה במבחנה 3D ביומימטי יכול להיות מיושם ישירות על המחקר של מנגנון neovasularization, ומחזיק את ההבטחה הפוטנציאלית כפלטפורמה בעלות נמוכה עבור סינון תרופות ויישומי טוקסיקולוגיה.
