העבודה שנעשתה לפיתוח פרוטוקול זה נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות [AR072609].

עקרונות ופרוטוקולים של בדיקות מכניות לרגישות לשבר עצם

<ol>
	<li>Vesper, E. O., Hammond, M. A., Allen, M. R., Wallace, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even+with+rehydration,+preservation+in+ethanol+influences+the+mechanical+properties+of+bone+and+how+bone+responds+to+experimental+manipulation.">Even with rehydration, preservation in ethanol influences the mechanical properties of bone and how bone responds to experimental manipulation.</a> Bone. 97, 49-53 (2017).</li><li>Jepsen, K. J., Silva, M. J., Vashishth, D., Guo, X. E., van der Meulen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+biomechanical+mechanisms+in+mouse+models:+practical+guidelines+for+systematically+evaluating+phenotypic+changes+in+the+diaphyses+of+long+bones.">Establishing biomechanical mechanisms in mouse models: practical guidelines for systematically evaluating phenotypic changes in the diaphyses of long bones.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (6), 951-966 (2015).</li><li>Eds Burr, D. B., Allen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic and Applied Bone Biology. , (2019).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> microCT SkyScan 1272 User Manual. , (2018).</li><li>Kim, Y., Brodt, M. D., Tang, S. Y., Silva, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+for+scanning+and+analysis+of+mouse+bones.">MicroCT for scanning and analysis of mouse bones.</a> Methods in Molecular Biology. 2230, 169-198 (2021).</li><li>Bouxsein, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+assessment+of+bone+microstructure+in+rodents+using+micro-computed+tomography.">Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Micro-CT specimen scanner, Centre for high-throughput phenogenomics. , (2023).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard test method for flexural properties of unreinforced and reinforced plastics and electrical insulating materials by four-point bending. , (2020).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard test methods for flexural properties of unreinforced and reinforced plastics and electrical insulating materials. , (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruker+microCT+NRecon:+An+overview.">Bruker microCT NRecon: An overview.</a> , (2023).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

לאורך כל תהליך הסריקה והבדיקה, ישנם רגעים שבהם פתרון בעיות ואופטימיזציה מתאימים. הראשון שבהם מתרחש בעת סריקת עצמות באמצעות μCT. בעוד שמערכות רבות מגיעות עם מחזיק שבו ניתן להחזיק ולסרוק חפץ אחד, ניתן לייצר מחזיקים מותאמים אישית כדי לסרוק מספר עצמות בו זמנית. סריקת עצמות מרובות יכולה להיות נ?...

בדיקה מכנית של עצם היא השיטה העיקרית לחלץ מידע פונקציונלי הקשור לרגישות של עצם לשבר. במחקרים פרה-קליניים ניתן להשתמש במספר שיטות בדיקה, אך ללא ספק הנפוצה ביותר היא כיפוף עצמות ארוכות. בדיקות אלה קלות לביצוע וניתן להשתמש בהן על עצמות שגודלן נע בין אדם לעכבר. מכיוון שעכברים הם אחד מבעלי החיים הנחקרים ביותר במחקר פרה-קליני, פרוטוקול זה יתמקד בבדיקות כיפוף המבוצעות על עצם הירך והטיביה של עכברים.
לפני ביצוע בדיקות כיפוף, יש לקצור ולאחסן עצמות כראוי. שיטות האחסון הנפוצות ביותר היו באופן מסורתי הקפאת עצמות בגזה ספוגה במי מלח, הקפאה במי מלח בלבד, או התייבשות עצמות באתנול 1. עצמות המאוחסנות באתנול הוכחו כבעלות קשיחות מוגברת ומודולוס אלסטי וירידה בפרמטרים של עיוות לעומת אלה המאוחסנים קפואים1. אפילו החזרת לחות העצמות לפני הבדיקה אינה מחזירה תכונות אלה לרמות נורמליות 1. אחסון שקוע במי מלח עלול לגרום נזק לעצם מכיוון שהלחץ מופעל ככל שהמלח מתרחב. בנוסף, תידרש הפשרה מלאה של התמיסה כדי להסיר את העצמות לסריקת טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (μCT). כתוצאה מכך, הקפאת עצמות טריות שנקטפו בגזה ספוגה במי מלח הפכה לשיטת האחסון הסטנדרטית ומומלצת לאורך פרוטוקול זה.
מכיוון שגודלה וצורתה של עצם משפיעים על חוזקה בתפזורת ומודלים רבים של מחלות משנים באופן משמעותי את גודל העצם ואת המורפולוגיה, עקרונות הנדסיים משמשים לנרמל את השפעות הגודל כדי לייצר תכונות המעריכות את התנהגות הרקמה2. גישה זו דורשת גיאומטריית חתך של מיקום הכשל, אשר נרכשת בדרך כלל באמצעות μCT כדי ליצור סריקות של העצמות לפני הבדיקה. μCT נמצא בשימוש נרחב בשל זמינותו ורזולוציית התמונה הגבוהה. יתר על כן, תרומות של רקמות רכות אינן כלולות, וסריקה אינה דורשת קיבוע כימי או שינויים אחרים לעצם 3,4. בכל צורות ה- CT, מקור רנטגן מתמקד באובייקט בעוד גלאי בצד השני של האובייקט מודד את אנרגיית הרנטגן המתקבלת. פעולה זו מייצרת צל רנטגן של הדגימה שניתן להמיר לתמונה 3,5. האובייקט הנסרק מסובב (או שמקור קרני הרנטגן והגלאי מסובבים סביב הדגימה), ויוצרים תמונות שניתן לשחזר למערך נתונים תלת ממדי המייצג את האובייקט5.
רזולוציית הסריקה, או עד כמה שני אובייקטים יכולים להיות קרובים זה לזה ועדיין להיפתר בנפרד, נשלטת על ידי שינוי גודל הווקסל הנומינלי או גודל הפיקסל בתמונה המתקבלת. מקובל לחשוב שעצמים חייבים להיות לפחות פי שניים מגודלו של ווקסל בודד כדי להיות מזוהים3, אך יחס גבוה יותר יאפשר דיוק משופר. יתר על כן, ווקסלים גדולים נוטים יותר להשפעות נפח חלקיות: כאשר ווקסל יחיד מכיל רקמות בצפיפויות שונות, הוא מוקצה לממוצע של צפיפויות אלה, ולא לצפיפות הספציפית של רקמה בודדת, מה שעלול להוביל להערכת יתר או חסר של אזורי הרקמה וצפיפות המינרלים3. בעוד שניתן להקל על בעיות אלה על ידי בחירת גדלי ווקסל קטנים יותר, שימוש ברזולוציה גבוהה יותר אינו מבטיח ביטול אפקטים של נפח חלקי ועשוי לדרוש זמני סריקה ארוכים יותר3. בעת סריקת עצמות ex vivo, גודל ווקסל של 6-10 מיקרומטר מומלץ בדרך כלל כדי להעריך במדויק את הארכיטקטורה trabecular של עצמות עכבר. גודל ווקסל גדול יותר של 10-17 מיקרומטר יכול לשמש לעצם קליפת המוח, אם כי יש להשתמש בגודל הווקסל הסביר הקטן ביותר. פרוטוקול זה משתמש בגודל ווקסל של 10 מיקרומטר, שהוא קטן מספיק כדי להבדיל בין תכונות טרבקולריות מרכזיות ולמזער השפעות נפח חלקי ללא זמן סריקה נרחב.
יש לבחור בקפידה גם את הגדרות אנרגיית הרנטגן ומסנן האנרגיה, שכן צפיפות ועובי המינרלים הגבוהים של רקמת העצם מחלישים מאוד ומשנים את ספקטרום אנרגיית הרנטגן המועברת. ההנחה הרווחת היא שמכיוון שספקטרום קרני הרנטגן הנפלט שווה ערך לספקטרום היוצא מהאובייקט6, שימוש בקרני רנטגן באנרגיה נמוכה על עצמים צפופים כגון עצם יכול להוביל לחפץ המכונה התקשות קרן7. מתח גבוה יותר של 50-70 kVp מומלץ בעת סריקת דגימות עצם כדי להפחית את השכיחות של ממצאים אלה5. בנוסף, הכנסת מסנן אנרגיה מאלומיניום או נחושת יוצרת קרן אנרגיה מרוכזת יותר, מה שממזער עוד יותר את הממצאים 4,7. מסנן אלומיניום 0.5 מ"מ ישמש לאורך פרוטוקול זה.
לבסוף, שלב סיבוב הסריקה ואורך הסיבוב (לדוגמה, 180°-360°), שולטים יחד במספר התמונות שצולמו, מה שקובע את כמות הרעש בסריקההסופית 4. ממוצע מסגרות מרובות בכל שלב יכול להפחית את הרעש, אך עשוי להאריך את זמן הסריקה4. פרוטוקול זה משתמש בשלב סיבוב של 0.7 מעלות ומסגרת ממוצעת של 2.
הערה אחרונה לגבי הסריקה: יש לסרוק פאנטום כיול הידרוקסיאפטיט באמצעות אותן הגדרות סריקה כמו עצמות הניסוי כדי לאפשר המרה של מקדמי הנחתה לצפיפות מינרלים בגרם / ס"מ35. פרוטוקול זה משתמש בפנטום של 0.25 גרם/ס"מ 3 ו-0.75 גרם/ס"מ3 של הידרוקסיאפטיט, אם כי קיימים פאנטום שונים. שים לב שחלק ממערכות הסריקה משתמשות בפנטום פנימי כחלק מכיול המערכת היומי.
לאחר השלמת הסריקה, ההקרנות הזוויתיות משוחזרות לתמונות חתך רוחב של האובייקט, בדרך כלל באמצעות התוכנה הנלווית של היצרן. לא משנה באיזו מערכת משתמשים, חשוב לוודא כי העצם כולה נלכדת בשחזור וכי הסף מוגדר כראוי כדי לאפשר זיהוי של עצם לעומת לא עצם. לאחר השחזור, קריטי לסובב את כל הסריקות בתלת מימד, כך שהעצמות מכוונות באופן עקבי ומיושר כראוי עם הציר הרוחבי, שוב באמצעות תוכנת היצרן.
לאחר הסיבוב, ניתן לבחור אזורי עניין (ROI) לניתוח בהתבסס על האם תכונות קליפת המוח, תכונות טרבקולריות או גיאומטריית שבר לנורמליזציה מכנית רצויות. עבור האחרונים, יש לבחור ROI לאחר בדיקה על ידי מדידת המרחק מאתר השבר לקצה אחד של העצם ושימוש בגודל ווקסל כדי לקבוע את מיקום הפרוסה המתאים בקובץ הסריקה. האזור שנבחר צריך להיות לפחות 100 מיקרומטר אורך, עם נקודת השבר במרכז המשוער של החזר ההשקעה, כדי לספק הערכה נאותה4.
כאשר ROI נבחרים, נדרשות שתי תכונות לנורמליזציה מכנית (כדי לחשב מתח כיפוף ומתח): המרחק המרבי מציר הכיפוף הנייטרלי למשטח שבו מתחיל הכשל (ההנחה היא שהוא המשטח הטעון במתח, שנקבע על ידי מערך הבדיקה), ומומנט השטח של האינרציה סביב הציר הנייטרלי, (תלוי גם בהגדרת הבדיקה). פרוטוקול זה ממליץ על שימוש בקוד מותאם אישית כדי לקבוע ערכים אלה. לקבלת גישה לקוד, פנה ישירות למחבר המתאים או בקר באתר המעבדה בכתובת https://bbml.et.iupui.edu/ לקבלת מידע נוסף.
לאחר השלמת סריקת μCT, ניתן להתחיל בבדיקות מכניות. ניתן לבצע בדיקות כיפוף בתצורות של ארבע נקודות או שלוש נקודות. בדיקות כיפוף ארבע נקודות עדיפות מכיוון שהן מבטלות לחץ גזירה בעצם בין נקודות העמסה, ומאפשרות כיפוף טהור להתרחש באזור זה3. לאחר מכן העצם תישבר עקב מתח, מה שייצור כשל שמייצג יותר את תכונות הכיפוף האמיתיות של העצם3. עם זאת, יש להעמיס את העצם באופן כזה שיעביר את אותו עומס בשתי נקודות ההעמסה (ניתן להקל על כך עם ראש העמסה מסתובב). במבחני כיפוף תלת נקודתיים, יש שינוי גדול בלחץ הגזירה שבו נקודת העומס פוגשת את העצם, מה שגורם לעצם להישבר בנקודה זו עקב גזירה, ולא מתח3. תקני ASTM ממליצים שחומרים שעוברים כיפוף צריכים להיות בעלי יחס אורך-רוחב של 16:1, כלומר אורך טווח התמיכה צריך להיות גדול פי 16 מרוחב העצם כדי למזער את ההשפעות של גזירה 8,9. לעתים קרובות זה בלתי אפשרי להשיג בעת בדיקת עצמות מכרסמים קטנות, ולכן טווח ההעמסה פשוט נעשה גדול ככל האפשר אבל עם שינוי קטן ככל האפשר בצורת חתך רוחב. יתר על כן, בעת ביצוע כיפוף ארבע נקודות, היחס בין אורכי התוחלת התחתונה והעליונה צריך להיות ~ 3:18, אשר בדרך כלל ניתן להשיג בשוקה, אך קשה בעצם הירך הקצרה יותר. בנוסף, הדפנות הקורטיקליות הדקות יותר של עצם הירך הופכות אותן לרגישות לעיוות מסוג טבעת המשנה את צורת חתך העצם במהלך הבדיקה (ניתן להדגיש זאת בבדיקות של ארבע נקודות מכיוון שנדרש כוח גדול יותר כדי לגרום לאותו רגע כיפוף בהשוואה לכיפוף של שלוש נקודות). לכן, כיפוף תלת נקודתי ישמש עבור עצם הירך של העכבר ואילו כיפוף ארבע נקודות ישמש עבור tibiae לאורך פרוטוקול זה.
לבסוף, חשוב להפעיל כראוי את המחקר לניתוח סטטיסטי. המלצה כללית לבדיקות מכניות היא גודל מדגם של 10-12 עצמות לכל קבוצת ניסוי כדי להיות מסוגל לזהות הבדלים, שכן תכונות מכניות מסוימות, במיוחד פרמטרים לאחר התפוקה, יכולות להיות משתנות מאוד. במקרים מסוימים, משמעות הדבר עשויה להיות התחלה עם גודל דגימה גבוה יותר של בעלי חיים בהתחשב בשחיקה שעלולה להתרחש במהלך המחקר. יש להשלים ניתוח גודל מדגם באמצעות נתונים קיימים לפני ניסיון מחקר.
ישנן מגבלות והנחות רבות, אך מבחני כיפוף יכולים לספק תוצאות מדויקות למדי, במיוחד כאשר הבדלים יחסיים בין קבוצות מעניינים. מאפיינים אלה, יחד עם ניתוח של ארכיטקטורה טרבקולרית ומורפולוגיה קליפת המוח, יכולים לספק תובנה טובה יותר לגבי מצבי מחלה ומשטרי טיפול. אם נקפיד על אותם היבטים של הניסוי שנמצאים בשליטתנו (למשל, קציר, אחסון, סריקה ובדיקות), נוכל להיות בטוחים שהושגו תוצאות מדויקות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CTAn</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>NA</td>
			<td>CT Scan Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DataViewer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>NA</td>
			<td>CT Scan Rotation Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>NA</td>
			<td>Coding platform used for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRecon</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>NA</td>
			<td>CT Scan Reconstruction software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software&#160;&#160;</td>
			<td>Micro Photonics Inc</td>
			<td>SKY-016814</td>
			<td>Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

practical considerations for the design, execution, and interpretation of studies involving whole-bone bending tests of rodent bones

שבריריות השלד המובילה לשבר היא משבר בריאות הציבור בארה"ב הגורם ל-1.5 מיליון שברים מדי שנה ולעלויות טיפול ישיר בסך 18 מיליארד דולר. היכולת להבין את המנגנונים העומדים בבסיס מחלת העצם ואת התגובה לטיפול היא לא רק רצויה, אלא קריטית. בדיקה מכנית של עצם משמשת כטכניקה רבת ערך להבנה וכימות של רגישות העצם לשבר. בעוד שיטה זו נראית פשוטה לביצוע, ניתן להגיע למסקנות לא הולמות ולא מדויקות אם המשתמש מתעלם מההנחות השולטות ומשלבי המפתח. זה נצפה על פני דיסציפלינות כמו מחקרים ממשיכים להתפרסם עם שימוש לרעה בשיטות ופרשנות שגויה של תוצאות. פרוטוקול זה ישמש כבסיס לעקרונות הקשורים לבדיקות מכניות יחד עם היישום של טכניקות אלה - החל משיקולים של גודל הדגימה, דרך קצירת רקמות ואחסונן, וכלה בניתוח נתונים ופרשנות. עם זה ביד, מידע רב ערך לגבי הרגישות של עצם לשבר ניתן להשיג, קידום הבנה הן עבור מחקר אקדמי ופתרונות קליניים.

Mechanical testing of bone is the primary method to extract functional information related to a bone&#39;s susceptibility to fracture. In preclinical studies, several testing modalities can be used but by far the most common is the bending of long bones. These tests are easy to perform and can be used on bones ranging in size from human to mouse. As mice are one of the most commonly studied animals in preclinical research, this protocol will focus on bending tests performed on the femora and tibiae of mice.
Prior to performing bending tests, bones must be properly harvested and stored. The most common storage methods have traditionally been freezing bones in saline-soaked gauze, freezing in saline alone, or dehydrating bones in ethanol 1. Bones stored in ethanol have been shown to have increased stiffness and elastic modulus and decreased deformation parameters versus those stored frozen1. Even rehydrating the bones prior to testing does not recover these properties back to normal levels 1. Storing submerged in saline could cause damage to the bone since pressure is exerted as the saline expands. In addition, a complete thaw of the solution would be required to remove the bones for microcomputed tomography (&#181;CT) scanning. Consequently, freezing freshly harvested bones in saline-soaked gauze has become the standard storage method and is recommended throughout this protocol.
Because the size and shape of a bone affect its bulk strength and many disease models significantly alter bone size and morphology, engineering principles are used to normalize away the effects of size to produce properties that estimate the behavior of the tissue2. This approach requires cross-sectional geometry of the failure location, which is most commonly acquired using &#181;CT to create scans of the bones prior to testing. &#181;CT is widely used due to its availability and high image resolution. Moreover, contributions of soft tissue are not included, and scanning does not require chemical fixation or other modifications to the bone3,4. In all forms of CT, an X-ray source is focused on an object while a detector on the other side of the object measures the resulting X-ray energy. This produces an X-ray shadow of the sample that can be converted into an image3,5. The object being scanned is rotated (or the X-ray source and detector are rotated around the sample), generating images that can be reconstructed into a three-dimensional data set representing the object5.
Scan resolution, or how close together two objects can be and still be resolved individually, is controlled by changing the nominal voxel size or the size of a pixel in the resulting image. It is generally accepted that objects must be at least two times the size of a single voxel to be identified3, but a higher ratio will allow for improved precision. Further, larger voxels are more prone to partial volume effects: when a single voxel contains tissues of varying densities, it is assigned the average of these densities, rather than the specific density of a single tissue, which may lead to an over- or under-estimation of tissue areas and mineral density3. While these issues can be mitigated by choosing smaller voxel sizes, using a higher resolution does not ensure the elimination of partial volume effects and may require longer scan times3. When scanning bones ex vivo, a voxel size of 6-10 &#181;m is generally recommended to accurately assess the trabecular architecture of mouse bones. A larger voxel size of 10-17 &#181;m can be used for cortical bone, although the smallest reasonable voxel size should be used. This protocol uses a 10 &#181;m voxel size, which is small enough to differentiate key trabecular properties and minimize partial volume effects without extensive scan time.
X-ray energy and energy filter settings must also be selected carefully, as the high mineral density and thickness of bone tissue greatly attenuates and alters the transmitted X-ray energy spectrum. It is generally assumed that because the emitted X-ray spectrum is equivalent to the spectrum that exits the object6, using low-energy X-rays on dense objects such as bone can lead to an artifact known as beam hardening7. A higher voltage of 50-70 kVp is recommended when scanning bone samples to reduce the incidence of these artifacts5. In addition, inserting an aluminum or copper energy filter creates a more concentrated energy beam, further minimizing artifacts4,7. A 0.5 mm aluminum filter will be used throughout this protocol.
Finally, the scan rotation step and rotation length (e.g., 180&#176;-360&#176;), together control the number of images captured, which determines the amount of noise in the final scan4. Averaging multiple frames in each step can reduce noise but may increase scan time4. This protocol uses a rotation step of 0.7 degrees and a frame averaging of 2.
One final note about scanning: hydroxyapatite calibration phantoms should be scanned using the same scan settings as the experimental bones to enable the conversion of attenuation coefficients to mineral density in g/cm35. This protocol uses phantoms of 0.25 g/cm3 and 0.75 g/cm3 of hydroxyapatite, although different phantoms are available. Note that some scanning systems use internal phantoms as part of daily system calibration.
Once scanning is complete, the angular projections are reconstructed into cross-sectional images of the object, typically using the manufacturer&#39;s accompanying software. Whatever system is used, it is important to ensure that the whole bone is captured in the reconstruction and that thresholding is set appropriately to allow for the recognition of bone versus non-bone. After reconstruction, it is critical to rotate all scans in three dimensions so that bones are oriented consistently and properly aligned with the transverse axis, again using the manufacturer&#39;s software.
Following rotation, regions of interest (ROI) for analysis may be selected based on whether cortical properties, trabecular properties, or fracture geometry for mechanical normalization are desired. For the latter, ROIs should be selected after testing by measuring the distance from the fracture site to one end of the bone and using voxel size to determine the corresponding slice location in the scan file. The selected region should be at least 100 &#181;m in length, with the fracture point at the approximate center of the ROI, to provide adequate estimation4.
With ROIs selected, two properties are needed for mechanical normalization (to calculate bending stress and strain): the maximum distance from the neutral bending axis to the surface where failure is initiated (assumed to be the surface loaded in tension, determined by the testing setup), and the area moment of inertia around the neutral axis, (also dependent on testing setup). This protocol recommends the use of a custom code to determine these values. For access to the code, contact the corresponding author directly or visit the lab website at&#160;https://bbml.et.iupui.edu/ for more information.
Once &#181;CT scanning has been completed, mechanical testing can begin. Bending tests can be performed in either four-point or three-point configurations. Four-point bending tests are preferred as they eliminate shear stress in the bone between loading points, allowing for pure bending to occur in this region3. The bone will then fracture due to tension, creating a failure that is more representative of the true bending properties of the bone3. However, the bone must be loaded in such a way as to deliver the same load at both loading points (this can be facilitated with a pivoting loading head). In three-point bending tests, there is a large change in shear stress where the load point meets the bone, which causes the bone to break at this point due to shear, not tension3. ASTM standards recommend materials undergoing bending should have a length-to-width ratio of 16:1, meaning the length of the support span should be 16 times larger than the width of the bone to minimize impacts of shear8,9. This is often impossible to achieve when testing small rodent bones, so the loading span is simply made as large as possible but with as small of a change in cross-sectional shape as possible. Moreover, when performing four-point bending, the ratio between the lengths of the lower and upper span should be ~3:18, which can usually be achieved in the tibia, but it is difficult in the shorter femur. In addition, the thinner cortical walls of femurs make them susceptible to ring-type deformation which changes the shape of the bone cross-section during the test (this can be accentuated in four-point tests as a greater force is required to induce the same bending moment compared to three-point bending). Therefore, three-point bending will be utilized for mouse femora while four-point bending will be used for tibiae throughout this protocol.
Finally, it is important to properly power the study for statistical analysis. A general recommendation for mechanical testing is to have a sample size of 10-12 bones per experimental group to be able to detect differences, as some mechanical properties, especially postyield parameters, can be highly variable. In some cases, this may mean starting with a higher animal sample size given attrition that could occur during the study. Sample size analysis using existing data should be completed prior to attempting a study.
There are numerous limitations and assumptions, but bending tests can provide quite accurate results, especially when relative differences between groups are of interest. These properties, together with the analysis of trabecular architecture and cortical morphology, can provide better insight into disease states and treatment regimens. If care is taken with those aspects of the experiment that are in our control (e.g., harvesting, storing, scanning, and testing), we can feel confident that accurate results have been generated.

מחבר זרקור: שיפור הדיוק והשחזור בבדיקות כיפוף עצם שלמות 

שיקולים מעשיים לתכנון, ביצוע ופרשנות של מחקרים הכוללים בדיקות כיפוף עצם שלמות של עצמות מכרסמים

The current experimental challenges of bending tests include:Consistent placing of the bones in the same orientation, documenting the break progress of the bone during the test, and interpretation of complex results. Our protocol provides a guide not only for the testing procedure and data analysis for whole-bone bending tests, but also for sample preparation and storage. And this is the first instance where the entire protocol has been presented.Whole-bone mechanical testing is a quick and simple method to obtain measures of bone fracture susceptibility when compared to other testing methods.

עם השלמת סריקת CT, רוב הסריקות הלא מספקות יכולות להיתפס בשחזור. לעתים קרובות, סריקות גרועות יגרמו לפיצוי גבוה על חוסר התאמה המהווה אינדיקטור ברור לשגיאה במהלך הסריקה. עם זאת, שגיאות עלולות להתרחש בשלבים אחרים ועלולות גם להוביל לנתונים לא מדויקים. לעתים קרובות ניתן לאתר טעויות אלה כאשר בוחנ?...

Watch this Scientific Journal Video about Enhancing Accuracy and Reproducibility in Whole Bone Bending Tests at JoVE.com

בדיקה מכנית של עצמות מכרסמים היא שיטה חשובה לחילוץ מידע לגבי רגישות העצם לשברים. בהיעדר הבנה מעשית מתאימה, התוצאות עלולות להתפרש יתר על המידה או חסרות תוקף. פרוטוקול זה ישמש כמדריך כדי להבטיח בדיקות מכניות מבוצעות במדויק כדי לספק נתונים תקפים ופונקציונליים.

Skeletal fragility leading to fracture is an American public health crisis resulting in 1.5 million fractures each year and $18 billion in direct care ...

האתגרים הניסיוניים הנוכחיים של בדיקות כיפוף כוללים: מיקום עקבי של העצמות באותו כיוון, תיעוד התקדמות השבירה של העצם במהלך הבדיקה, ופרשנות של תוצאות מורכבות. הפרוטוקול שלנו מספק מדריך לא רק להליך הבדיקה וניתוח הנתונים לבדיקות כיפוף עצם שלמה, אלא גם להכנת דגימות ואחסונן. וזה המקרה הראשון שבו הוצג הפרוטוקול כולו.בדיקה מכנית של עצם שלמה היא שיטה מהירה ופשוטה להשגת מדדים של רגישות לשברים בעצם בהשוואה לשיטות בדיקה אחרות.

practical-considerations-for-design-execution-interpretation-studies

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Practical Considerations for the Design, Execution, and Interpretation of Studies Involving Whole-Bone Bending Tests of Rodent Bones

585 Views.  Indiana University-Purdue University Indianapolis. האתגרים הניסיוניים הנוכחיים של בדיקות כיפוף כוללים: מיקום עקבי של העצמות באותו כיוון, תיעוד התקדמות השבירה של העצם במהלך הבדיקה, ופרשנות של תוצאות מורכבות. הפרוטוקול שלנו מספק מדריך לא רק להליך הבדיקה וניתוח הנתונים לבדיקות כיפוף עצם שלמה, אלא גם להכנת דגימות ואחסונן. וזה ?...

Video: מחבר זרקור: שיפור הדיוק והשחזור בבדיקות כיפוף עצם שלמות 

Skeletal fragility leading to fracture is an American public health crisis resulting in 1.5 million fractures each year and $18 billion in direct care costs. The ability to understand the mechanisms underlying bone disease and the response to treatment is not only desired, but critical. Mechanical testing of bone serves as a valuable technique for understanding and quantifying a bone&#39;s susceptibility to fracture. While this method appears simple to perform, inappropriate and inaccurate conclusions may be reached if governing assumptions and key steps are disregarded by the user. This has been observed across disciplines as studies continue to be published with misuse of methods and incorrect interpretation of results. This protocol will serve as a primer for the principles associated with mechanical testing along with the application of these techniques-from considerations of sample size through tissue harvesting and storage, to data analysis and interpretation. With this in hand, valuable information regarding a bone&#39;s susceptibility to fracture may be obtained, furthering understanding for both academic research and clinical solutions.

Mechanical testing of rodent bones is a valuable method for extracting information regarding a bone's susceptibility to fracture. Lacking proper practical understanding, the results may be overinterpreted or lack validity. This protocol will serve as a guide to ensure mechanical tests are performed accurately to provide valid and functional data.

Mechanical Testing Procedure to Check Bone&#39;s Susceptibility to Fracture

Mechanical Testing Procedure to Check Bone&#039;s Susceptibility to Fracture  

After harvesting the femur and tibia from the euthanized mouse, obtain a six to 10 micrometer resolution micro CT scan reconstructed for each sample to calculate for exercise geometry. Thaw all the bones for testing, and ensure to test all bones from the same experiment in one session. Now locate a load cell with sensitivity and capacity suitable for the specimen.Considering the failure range of the specimen, select a load cell with 50%more capacity while maximizing sensitivity. Locate the loading and support span fixtures. Install the load cell and fixtures by screwing the load cell onto the upper support of the tester, attaching the upper loading fixture to the load cell and mounting the lower fixture to the bottom support of the tester.Then select a support span length, which will remain constant for all samples. Use the shortest bone in the sample set to determine the support span distance, and properly orient the bone between the fixtures. To perform a three-point bending test of the femur.place the anterior surface of the bone against the support span, ensuring the position is within the diaphysis of the sample. Exclude the third trochanter on the proximal end and the transition point where the bone widens into the metaphysis and condyles on the distal end. Ensure the loading span is centered within the support span and contains a uniform region of the bone.Then measure and record the support span distance. Once the support span has been set and recorded, bring the lower fixture close to the upper fixture with enough room between the two for a bone to be placed. Place the bone back into saline or rehydrated with a saline bolus.Ensure all fixture parts are tight and free of movement. In the mechanical tester software, design a bending test profile with a slow displacement ramp rate to avoid viscoelastic effects to load the bone until it fails. After creating a testing profile, create distinct folders for every study group.Select a properly thawed bone, then measure and record its full length using calipers. Load the bone sample onto the fixture in the proper orientation. Alter the file name to reflect the particulars of the sample being tested and save each test in its corresponding folder.Zero the load and activate the system's mover, ensuring it's not in load or displacement control. Carefully apply a slight preload to the bone to secure its position. Avoid compromising the sample.Aim for a preload of about 0.25 Newtons. Make sure the desired bone orientation is kept consistent before moving forward. Hydrate the sample by generously dousing it with saline.On the software, initiate the bending test by selecting start or run. It's crucial to observe the sample for the duration of the test accurately, noting down any occurrences of issues. Monitor closely as the bone starts to fracture.Tests stop automatically when they reach their set limits. But if there's a failure, stop the test manually to avoid damaging the load cell. Once testing is complete, measure the length from the distal end to the breakpoint using calipers and record it.