تم دعم العمل المنجز لتطوير هذا البروتوكول من قبل المعاهد الوطنية للصحة [AR072609].

مبادئ وبروتوكولات الاختبارات الميكانيكية لحساسية كسور العظام

<ol>
	<li>Vesper, E. O., Hammond, M. A., Allen, M. R., Wallace, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even+with+rehydration,+preservation+in+ethanol+influences+the+mechanical+properties+of+bone+and+how+bone+responds+to+experimental+manipulation.">Even with rehydration, preservation in ethanol influences the mechanical properties of bone and how bone responds to experimental manipulation.</a> Bone. 97, 49-53 (2017).</li><li>Jepsen, K. J., Silva, M. J., Vashishth, D., Guo, X. E., van der Meulen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+biomechanical+mechanisms+in+mouse+models:+practical+guidelines+for+systematically+evaluating+phenotypic+changes+in+the+diaphyses+of+long+bones.">Establishing biomechanical mechanisms in mouse models: practical guidelines for systematically evaluating phenotypic changes in the diaphyses of long bones.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (6), 951-966 (2015).</li><li>Eds Burr, D. B., Allen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic and Applied Bone Biology. , (2019).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> microCT SkyScan 1272 User Manual. , (2018).</li><li>Kim, Y., Brodt, M. D., Tang, S. Y., Silva, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+for+scanning+and+analysis+of+mouse+bones.">MicroCT for scanning and analysis of mouse bones.</a> Methods in Molecular Biology. 2230, 169-198 (2021).</li><li>Bouxsein, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+assessment+of+bone+microstructure+in+rodents+using+micro-computed+tomography.">Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Micro-CT specimen scanner, Centre for high-throughput phenogenomics. , (2023).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard test method for flexural properties of unreinforced and reinforced plastics and electrical insulating materials by four-point bending. , (2020).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard test methods for flexural properties of unreinforced and reinforced plastics and electrical insulating materials. , (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruker+microCT+NRecon:+An+overview.">Bruker microCT NRecon: An overview.</a> , (2023).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

خلال عملية المسح والاختبار ، هناك لحظات يكون فيها استكشاف الأخطاء وإصلاحها والتحسين مناسبين. يحدث أولها عند مسح العظام باستخدام μCT. في حين أن العديد من الأنظمة تأتي مع حامل يمكن فيه حمل كائن واحد ومسحه ضوئيا ، يمكن تصنيع حاملات مخصصة لمسح عظام متعددة في نفس الوقت. يمكن أن يكون مسح عظام متعد...

الاختبار الميكانيكي للعظام هو الطريقة الأساسية لاستخراج المعلومات الوظيفية المتعلقة بقابلية العظام للكسر. في الدراسات قبل السريرية ، يمكن استخدام العديد من طرق الاختبار ولكن الأكثر شيوعا هو ثني العظام الطويلة. هذه الاختبارات سهلة التنفيذ ويمكن استخدامها على عظام تتراوح أحجامها من الإنسان إلى الفأر. نظرا لأن الفئران هي واحدة من أكثر التي تمت دراستها شيوعا في الأبحاث قبل السريرية ، سيركز هذا البروتوكول على اختبارات الانحناء التي يتم إجراؤها على عظم الفخذ والساق للفئران.
قبل إجراء اختبارات الانحناء ، يجب حصاد العظام وتخزينها بشكل صحيح. كانت طرق التخزين الأكثر شيوعا تقليديا هي تجميد العظام في الشاش المنقوع بالمحلول الملحي ، أو التجميد في محلول ملحي وحده ، أو تجفيف العظام في الإيثانول 1. تبين أن العظام المخزنة في الإيثانول قد زادت من الصلابة ومعامل المرونة وانخفضت معلمات التشوه مقابل تلك المخزنة المجمدة1. حتى إعادة ترطيب العظام قبل الاختبار لا يعيد هذه الخصائص إلى المستويات الطبيعية 1. يمكن أن يتسبب التخزين المغمور في محلول ملحي في تلف العظام حيث يتم ممارسة الضغط مع تمدد المحلول الملحي. بالإضافة إلى ذلك ، ستكون هناك حاجة إلى ذوبان كامل للمحلول لإزالة العظام لمسح التصوير المقطعي الدقيق (μCT). وبالتالي ، أصبح تجميد العظام التي تم حصادها حديثا في شاش منقوع بالمحلول الملحي طريقة التخزين القياسية ويوصى به في جميع أنحاء هذا البروتوكول.
نظرا لأن حجم وشكل العظم يؤثران على قوته السائبة والعديد من نماذج الأمراض تغير بشكل كبير حجم العظام ومورفولوجيتها ، يتم استخدام المبادئ الهندسية لتطبيع آثار الحجم لإنتاج خصائص تقدر سلوك الأنسجة2. يتطلب هذا النهج هندسة مقطعية لموقع الفشل ، والتي يتم الحصول عليها بشكل شائع باستخدام μCT لإنشاء مسح للعظام قبل الاختبار. يستخدم μCT على نطاق واسع بسبب توفره ودقة الصورة العالية. علاوة على ذلك ، لا يتم تضمين مساهمات الأنسجة الرخوة ، ولا يتطلب المسح تثبيتا كيميائيا أو تعديلات أخرى على العظام 3,4. في جميع أشكال التصوير المقطعي المحوسب ، يركز مصدر الأشعة السينية على جسم ما بينما يقيس الكاشف الموجود على الجانب الآخر من الجسم طاقة الأشعة السينية الناتجة. ينتج عن ذلك ظل أشعة سينية للعينة يمكن تحويله إلى صورة 3,5. يتم تدوير الكائن الذي يتم مسحه ضوئيا (أو يتم تدوير مصدر الأشعة السينية والكاشف حول العينة) ، مما يولد صورا يمكن إعادة بنائها في مجموعة بيانات ثلاثية الأبعاد تمثل الكائن5.
يتم التحكم في دقة المسح الضوئي ، أو مدى قرب كائنين من بعضهما البعض ولا يزال يتم حلهما بشكل فردي ، عن طريق تغيير حجم voxel الاسمي أو حجم البكسل في الصورة الناتجة. من المقبول عموما أن الكائنات يجب أن تكون على الأقل ضعف حجم فوكسل واحد ليتم تحديدها3 ، ولكن النسبة الأعلى ستسمح بتحسين الدقة. علاوة على ذلك ، تكون الفوكسل الأكبر حجما أكثر عرضة لتأثيرات الحجم الجزئي: عندما يحتوي فوكسل واحد على أنسجة ذات كثافات متفاوتة ، يتم تعيين متوسط هذه الكثافات ، بدلا من الكثافة المحددة لنسيج واحد ، مما قد يؤدي إلى الإفراط أو التقليل من تقدير مناطق الأنسجة والكثافة المعدنية3. بينما يمكن التخفيف من هذه المشكلات عن طريق اختيار أحجام فوكسل أصغر ، فإن استخدام دقة أعلى لا يضمن التخلص من تأثيرات الحجم الجزئي وقد يتطلب أوقات مسح أطول3. عند مسح العظام خارج الجسم الحي ، يوصى عموما بحجم فوكسل من 6-10 ميكرومتر لتقييم البنية التربيقية لعظام الفأر بدقة. يمكن استخدام حجم فوكسل أكبر من 10-17 ميكرومتر للعظام القشرية ، على الرغم من أنه يجب استخدام أصغر حجم فوكسل معقول. يستخدم هذا البروتوكول حجم فوكسل 10 ميكرومتر ، وهو صغير بما يكفي للتمييز بين الخصائص التربيقية الرئيسية وتقليل تأثيرات الحجم الجزئي دون وقت مسح مكثف.
يجب أيضا اختيار إعدادات طاقة الأشعة السينية وفلتر الطاقة بعناية ، حيث أن الكثافة المعدنية العالية وسمك أنسجة العظام يخفف ويغير بشكل كبير طيف طاقة الأشعة السينية المرسلة. من المفترض عموما أنه نظرا لأن طيف الأشعة السينية المنبعث يعادل الطيف الذي يخرج من الجسم6 ، فإن استخدام الأشعة السينية منخفضة الطاقة على الأجسام الكثيفة مثل العظام يمكن أن يؤدي إلى قطعة أثرية تعرف باسم تصلب الحزمة7. يوصى بجهد أعلى من 50-70 كيلو فولت عند مسح عينات العظام لتقليل حدوث هذه القطع الأثرية5. بالإضافة إلى ذلك ، يؤدي إدخال مرشح طاقة من الألومنيوم أو النحاس إلى إنشاء شعاع طاقة أكثر تركيزا ، مما يقلل من القطع الأثرية 4,7. سيتم استخدام مرشح ألومنيوم 0.5 مم في جميع أنحاء هذا البروتوكول.
وأخيرا، تتحكم خطوة دوران المسح الضوئي وطول الدوران (على سبيل المثال، 180°-360°) معا في عدد الصور الملتقطة، والتي تحدد مقدار الضوضاء في المسح النهائي4. يمكن أن يؤدي حساب متوسط الإطارات المتعددة في كل خطوة إلى تقليل الضوضاء ولكنه قد يزيد من وقت المسحالضوئي 4. يستخدم هذا البروتوكول خطوة دوران تبلغ 0.7 درجة ومتوسط إطار يبلغ 2.
ملاحظة أخيرة حول المسح: يجب مسح أشباح معايرة هيدروكسيباتيت باستخدام نفس إعدادات المسح مثل العظام التجريبية لتمكين تحويل معاملات التوهين إلى كثافة معدنية في جم / سم35. يستخدم هذا البروتوكول أشباح 0.25 جم / سم 3 و 0.75 جم / سم3 من هيدروكسيباتيت ، على الرغم من توفر أشباح مختلفة. لاحظ أن بعض أنظمة المسح الضوئي تستخدم الأشباح الداخلية كجزء من معايرة النظام اليومية.
بمجرد اكتمال المسح ، يتم إعادة بناء الإسقاطات الزاوية في صور مقطعية للكائن ، عادة باستخدام البرنامج المصاحب للشركة المصنعة. أيا كان النظام المستخدم ، من المهم التأكد من التقاط العظم بالكامل في إعادة البناء وأن يتم تعيين العتبة بشكل مناسب للسماح بالتعرف على العظام مقابل غير العظام. بعد إعادة الإعمار ، من الأهمية بمكان تدوير جميع عمليات المسح في ثلاثة أبعاد بحيث يتم توجيه العظام بشكل متسق ومحاذاة بشكل صحيح مع المحور العرضي ، مرة أخرى باستخدام برنامج الشركة المصنعة.
بعد الدوران ، يمكن اختيار مناطق الاهتمام (ROI) للتحليل بناء على ما إذا كانت الخصائص القشرية أو الخصائص التربيقية أو هندسة الكسر للتطبيع الميكانيكي مطلوبة. بالنسبة للأخير ، يجب اختيار عائد الاستثمار بعد الاختبار عن طريق قياس المسافة من موقع الكسر إلى أحد طرفي العظم واستخدام حجم الفوكسل لتحديد موقع الشريحة المقابل في ملف الفحص. يجب ألا يقل طول المنطقة المحددة عن 100 ميكرومتر ، مع نقطة الكسر في المركز التقريبي لعائد الاستثمار ، لتوفير تقدير مناسب4.
مع تحديد عائد الاستثمار ، هناك حاجة إلى خاصيتين للتطبيع الميكانيكي (لحساب إجهاد الانحناء والإجهاد): أقصى مسافة من محور الانحناء المحايد إلى السطح حيث يبدأ الفشل (يفترض أنه السطح المحمل بالتوتر ، والذي يحدده إعداد الاختبار) ، ولحظة منطقة القصور الذاتي حول المحور المحايد ، (تعتمد أيضا على إعداد الاختبار). يوصي هذا البروتوكول باستخدام رمز مخصص لتحديد هذه القيم. للوصول إلى الكود ، اتصل بالمؤلف المقابل مباشرة أو قم بزيارة موقع المختبر على https://bbml.et.iupui.edu/ لمزيد من المعلومات.
بمجرد اكتمال مسح μCT ، يمكن أن يبدأ الاختبار الميكانيكي. يمكن إجراء اختبارات الانحناء في تكوينات من أربع نقاط أو ثلاث نقاط. يفضل إجراء اختبارات الانحناء رباعي النقاط لأنها تقضي على إجهاد القص في العظم بين نقاط التحميل ، مما يسمح بحدوث انحناء نقي في هذه المنطقة3. سوف ينكسر العظم بعد ذلك بسبب التوتر ، مما يؤدي إلى فشل أكثر تمثيلا لخصائص الانحناء الحقيقية للعظم3. ومع ذلك ، يجب تحميل العظم بطريقة توفر نفس الحمل في كلتا نقطتي التحميل (يمكن تسهيل ذلك باستخدام رأس تحميل محوري). في اختبارات الانحناء ثلاثية النقاط ، هناك تغيير كبير في إجهاد القص حيث تلتقي نقطة الحمل بالعظم ، مما يتسبب في كسر العظم عند هذه النقطة بسبب القص وليس التوتر3. توصي معايير ASTM بأن المواد التي تخضع للانحناء يجب أن يكون لها نسبة طول إلى عرض تبلغ 16: 1 ، مما يعني أن طول امتداد الدعم يجب أن يكون أكبر 16 مرة من عرض العظم لتقليل تأثيرات القص 8,9. غالبا ما يكون من المستحيل تحقيق ذلك عند اختبار عظام القوارض الصغيرة ، لذلك يتم ببساطة جعل فترة التحميل كبيرة قدر الإمكان ولكن مع تغيير صغير في شكل المقطع العرضي قدر الإمكان. علاوة على ذلك ، عند إجراء الانحناء من أربع نقاط ، يجب أن تكون النسبة بين أطوال الامتداد السفلي والعلوي ~ 3: 18 ، والتي يمكن تحقيقها عادة في الساق ، ولكنها صعبة في عظم الفخذ الأقصر. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الجدران القشرية الرقيقة لعظم الفخذ تجعلها عرضة للتشوه من النوع الحلقي الذي يغير شكل المقطع العرضي للعظام أثناء الاختبار (يمكن إبراز ذلك في الاختبارات المكونة من أربع نقاط حيث يلزم وجود قوة أكبر للحث على نفس لحظة الانحناء مقارنة بالانحناء ثلاثي النقاط). لذلك ، سيتم استخدام الانحناء ثلاثي النقاط لعظم الفخذ للفأر بينما سيتم استخدام الانحناء رباعي النقاط للساق في جميع أنحاء هذا البروتوكول.
أخيرا ، من المهم تشغيل الدراسة بشكل صحيح للتحليل الإحصائي. التوصية العامة للاختبار الميكانيكي هي أن يكون حجم العينة من 10-12 عظمة لكل مجموعة تجريبية لتكون قادرة على اكتشاف الاختلافات ، حيث أن بعض الخواص الميكانيكية ، وخاصة معلمات ما بعد العائد ، يمكن أن تكون متغيرة للغاية. في بعض الحالات ، قد يعني هذا البدء بحجم عينة حيوانية أكبر نظرا للاستنزاف الذي يمكن أن يحدث أثناء الدراسة. يجب إكمال تحليل حجم العينة باستخدام البيانات الموجودة قبل محاولة الدراسة.
هناك العديد من القيود والافتراضات ، لكن اختبارات الانحناء يمكن أن توفر نتائج دقيقة تماما ، خاصة عندما تكون الاختلافات النسبية بين المجموعات ذات أهمية. هذه الخصائص ، جنبا إلى جنب مع تحليل العمارة التربيقية والتشكل القشري ، يمكن أن توفر رؤية أفضل لحالات المرض وأنظمة العلاج. إذا تم الاهتمام بجوانب التجربة التي هي تحت سيطرتنا (على سبيل المثال ، الحصاد والتخزين والمسح والاختبار) ، يمكننا أن نشعر بالثقة في أنه تم إنشاء نتائج دقيقة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CTAn</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>NA</td>
			<td>CT Scan Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DataViewer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>NA</td>
			<td>CT Scan Rotation Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>NA</td>
			<td>Coding platform used for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRecon</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>NA</td>
			<td>CT Scan Reconstruction software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software&#160;&#160;</td>
			<td>Micro Photonics Inc</td>
			<td>SKY-016814</td>
			<td>Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

practical considerations for the design, execution, and interpretation of studies involving whole-bone bending tests of rodent bones

هشاشة الهيكل العظمي التي تؤدي إلى الكسر هي أزمة صحية عامة أمريكية تؤدي إلى 1.5 مليون كسور كل عام و 18 مليار دولار في تكاليف الرعاية المباشرة. القدرة على فهم الآليات الكامنة وراء أمراض العظام والاستجابة للعلاج ليست مرغوبة فحسب ، بل حاسمة. يعمل الاختبار الميكانيكي للعظام كتقنية قيمة لفهم وقياس قابلية العظام للكسر. في حين أن هذه الطريقة تبدو سهلة التنفيذ ، فقد يتم التوصل إلى استنتاجات غير مناسبة وغير دقيقة إذا تجاهل المستخدم الافتراضات الحاكمة والخطوات الرئيسية. وقد لوحظ هذا عبر التخصصات مع استمرار نشر الدراسات مع إساءة استخدام الأساليب والتفسير غير الصحيح للنتائج. سيكون هذا البروتوكول بمثابة تمهيد للمبادئ المرتبطة بالاختبار الميكانيكي جنبا إلى جنب مع تطبيق هذه التقنيات - من اعتبارات حجم العينة من خلال حصاد الأنسجة وتخزينها ، إلى تحليل البيانات وتفسيرها. مع وجود هذا في متناول اليد ، يمكن الحصول على معلومات قيمة بشأن قابلية العظام للكسر ، مما يعزز الفهم لكل من البحث الأكاديمي والحلول السريرية.

Mechanical testing of bone is the primary method to extract functional information related to a bone&#39;s susceptibility to fracture. In preclinical studies, several testing modalities can be used but by far the most common is the bending of long bones. These tests are easy to perform and can be used on bones ranging in size from human to mouse. As mice are one of the most commonly studied animals in preclinical research, this protocol will focus on bending tests performed on the femora and tibiae of mice.
Prior to performing bending tests, bones must be properly harvested and stored. The most common storage methods have traditionally been freezing bones in saline-soaked gauze, freezing in saline alone, or dehydrating bones in ethanol 1. Bones stored in ethanol have been shown to have increased stiffness and elastic modulus and decreased deformation parameters versus those stored frozen1. Even rehydrating the bones prior to testing does not recover these properties back to normal levels 1. Storing submerged in saline could cause damage to the bone since pressure is exerted as the saline expands. In addition, a complete thaw of the solution would be required to remove the bones for microcomputed tomography (&#181;CT) scanning. Consequently, freezing freshly harvested bones in saline-soaked gauze has become the standard storage method and is recommended throughout this protocol.
Because the size and shape of a bone affect its bulk strength and many disease models significantly alter bone size and morphology, engineering principles are used to normalize away the effects of size to produce properties that estimate the behavior of the tissue2. This approach requires cross-sectional geometry of the failure location, which is most commonly acquired using &#181;CT to create scans of the bones prior to testing. &#181;CT is widely used due to its availability and high image resolution. Moreover, contributions of soft tissue are not included, and scanning does not require chemical fixation or other modifications to the bone3,4. In all forms of CT, an X-ray source is focused on an object while a detector on the other side of the object measures the resulting X-ray energy. This produces an X-ray shadow of the sample that can be converted into an image3,5. The object being scanned is rotated (or the X-ray source and detector are rotated around the sample), generating images that can be reconstructed into a three-dimensional data set representing the object5.
Scan resolution, or how close together two objects can be and still be resolved individually, is controlled by changing the nominal voxel size or the size of a pixel in the resulting image. It is generally accepted that objects must be at least two times the size of a single voxel to be identified3, but a higher ratio will allow for improved precision. Further, larger voxels are more prone to partial volume effects: when a single voxel contains tissues of varying densities, it is assigned the average of these densities, rather than the specific density of a single tissue, which may lead to an over- or under-estimation of tissue areas and mineral density3. While these issues can be mitigated by choosing smaller voxel sizes, using a higher resolution does not ensure the elimination of partial volume effects and may require longer scan times3. When scanning bones ex vivo, a voxel size of 6-10 &#181;m is generally recommended to accurately assess the trabecular architecture of mouse bones. A larger voxel size of 10-17 &#181;m can be used for cortical bone, although the smallest reasonable voxel size should be used. This protocol uses a 10 &#181;m voxel size, which is small enough to differentiate key trabecular properties and minimize partial volume effects without extensive scan time.
X-ray energy and energy filter settings must also be selected carefully, as the high mineral density and thickness of bone tissue greatly attenuates and alters the transmitted X-ray energy spectrum. It is generally assumed that because the emitted X-ray spectrum is equivalent to the spectrum that exits the object6, using low-energy X-rays on dense objects such as bone can lead to an artifact known as beam hardening7. A higher voltage of 50-70 kVp is recommended when scanning bone samples to reduce the incidence of these artifacts5. In addition, inserting an aluminum or copper energy filter creates a more concentrated energy beam, further minimizing artifacts4,7. A 0.5 mm aluminum filter will be used throughout this protocol.
Finally, the scan rotation step and rotation length (e.g., 180&#176;-360&#176;), together control the number of images captured, which determines the amount of noise in the final scan4. Averaging multiple frames in each step can reduce noise but may increase scan time4. This protocol uses a rotation step of 0.7 degrees and a frame averaging of 2.
One final note about scanning: hydroxyapatite calibration phantoms should be scanned using the same scan settings as the experimental bones to enable the conversion of attenuation coefficients to mineral density in g/cm35. This protocol uses phantoms of 0.25 g/cm3 and 0.75 g/cm3 of hydroxyapatite, although different phantoms are available. Note that some scanning systems use internal phantoms as part of daily system calibration.
Once scanning is complete, the angular projections are reconstructed into cross-sectional images of the object, typically using the manufacturer&#39;s accompanying software. Whatever system is used, it is important to ensure that the whole bone is captured in the reconstruction and that thresholding is set appropriately to allow for the recognition of bone versus non-bone. After reconstruction, it is critical to rotate all scans in three dimensions so that bones are oriented consistently and properly aligned with the transverse axis, again using the manufacturer&#39;s software.
Following rotation, regions of interest (ROI) for analysis may be selected based on whether cortical properties, trabecular properties, or fracture geometry for mechanical normalization are desired. For the latter, ROIs should be selected after testing by measuring the distance from the fracture site to one end of the bone and using voxel size to determine the corresponding slice location in the scan file. The selected region should be at least 100 &#181;m in length, with the fracture point at the approximate center of the ROI, to provide adequate estimation4.
With ROIs selected, two properties are needed for mechanical normalization (to calculate bending stress and strain): the maximum distance from the neutral bending axis to the surface where failure is initiated (assumed to be the surface loaded in tension, determined by the testing setup), and the area moment of inertia around the neutral axis, (also dependent on testing setup). This protocol recommends the use of a custom code to determine these values. For access to the code, contact the corresponding author directly or visit the lab website at&#160;https://bbml.et.iupui.edu/ for more information.
Once &#181;CT scanning has been completed, mechanical testing can begin. Bending tests can be performed in either four-point or three-point configurations. Four-point bending tests are preferred as they eliminate shear stress in the bone between loading points, allowing for pure bending to occur in this region3. The bone will then fracture due to tension, creating a failure that is more representative of the true bending properties of the bone3. However, the bone must be loaded in such a way as to deliver the same load at both loading points (this can be facilitated with a pivoting loading head). In three-point bending tests, there is a large change in shear stress where the load point meets the bone, which causes the bone to break at this point due to shear, not tension3. ASTM standards recommend materials undergoing bending should have a length-to-width ratio of 16:1, meaning the length of the support span should be 16 times larger than the width of the bone to minimize impacts of shear8,9. This is often impossible to achieve when testing small rodent bones, so the loading span is simply made as large as possible but with as small of a change in cross-sectional shape as possible. Moreover, when performing four-point bending, the ratio between the lengths of the lower and upper span should be ~3:18, which can usually be achieved in the tibia, but it is difficult in the shorter femur. In addition, the thinner cortical walls of femurs make them susceptible to ring-type deformation which changes the shape of the bone cross-section during the test (this can be accentuated in four-point tests as a greater force is required to induce the same bending moment compared to three-point bending). Therefore, three-point bending will be utilized for mouse femora while four-point bending will be used for tibiae throughout this protocol.
Finally, it is important to properly power the study for statistical analysis. A general recommendation for mechanical testing is to have a sample size of 10-12 bones per experimental group to be able to detect differences, as some mechanical properties, especially postyield parameters, can be highly variable. In some cases, this may mean starting with a higher animal sample size given attrition that could occur during the study. Sample size analysis using existing data should be completed prior to attempting a study.
There are numerous limitations and assumptions, but bending tests can provide quite accurate results, especially when relative differences between groups are of interest. These properties, together with the analysis of trabecular architecture and cortical morphology, can provide better insight into disease states and treatment regimens. If care is taken with those aspects of the experiment that are in our control (e.g., harvesting, storing, scanning, and testing), we can feel confident that accurate results have been generated.

تسليط الضوء على المؤلف: تعزيز الدقة والتكاثر في اختبارات ثني العظام الكاملة 

اعتبارات عملية لتصميم وتنفيذ وتفسير الدراسات التي تتضمن اختبارات ثني العظام بالكامل لعظام القوارض

The current experimental challenges of bending tests include:Consistent placing of the bones in the same orientation, documenting the break progress of the bone during the test, and interpretation of complex results. Our protocol provides a guide not only for the testing procedure and data analysis for whole-bone bending tests, but also for sample preparation and storage. And this is the first instance where the entire protocol has been presented.Whole-bone mechanical testing is a quick and simple method to obtain measures of bone fracture susceptibility when compared to other testing methods.

عند الانتهاء من التصوير المقطعي المحوسب ، يمكن اكتشاف معظم عمليات المسح غير الكافية في إعادة الإعمار. في كثير من الأحيان ، سيكون لعمليات الفحص السيئة تعويض اختلال مرتفع وهو مؤشر واضح على وجود خطأ أثناء الفحص. ومع ذلك ، قد تحدث أخطاء في خطوات أخرى وقد تؤدي أيضا إلى بيانات غير دقيقة. غالبا ما ...

Watch this Scientific Journal Video about Enhancing Accuracy and Reproducibility in Whole Bone Bending Tests at JoVE.com

يعد الاختبار الميكانيكي لعظام القوارض طريقة قيمة لاستخراج المعلومات المتعلقة بقابلية العظام للكسر. وبسبب الافتقار إلى الفهم العملي الصحيح، قد يتم المبالغة في تفسير النتائج أو عدم صحتها. سيكون هذا البروتوكول بمثابة دليل لضمان إجراء الاختبارات الميكانيكية بدقة لتوفير بيانات صالحة ووظيفية.

Skeletal fragility leading to fracture is an American public health crisis resulting in 1.5 million fractures each year and $18 billion in direct care ...

تشمل التحديات التجريبية الحالية لاختبارات الانحناء: وضع العظام بشكل متسق في نفس الاتجاه ، وتوثيق تقدم كسر العظام أثناء الاختبار ، وتفسير النتائج المعقدة. يوفر بروتوكولنا دليلا ليس فقط لإجراء الاختبار وتحليل البيانات لاختبارات ثني العظام بالكامل ، ولكن أيضا لإعداد العينات وتخزينها. وهذه هي الحالة الأولى التي يتم فيها تقديم البروتوكول بأكمله.الاختبار الميكانيكي للعظام الكاملة هو طريقة سريعة وبسيطة للحصول على مقاييس لقابلية كسر العظام عند مقارنتها بطرق الاختبار الأخرى.

practical-considerations-for-design-execution-interpretation-studies

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Practical Considerations for the Design, Execution, and Interpretation of Studies Involving Whole-Bone Bending Tests of Rodent Bones

585 Views.  Indiana University-Purdue University Indianapolis. تشمل التحديات التجريبية الحالية لاختبارات الانحناء: وضع العظام بشكل متسق في نفس الاتجاه ، وتوثيق تقدم كسر العظام أثناء الاختبار ، وتفسير النتائج المعقدة. يوفر بروتوكولنا دليلا ليس فقط لإجراء الاختبار وتحليل البيانات لاختبارات ثني العظام بالكامل ، ولكن أيضا لإعداد العينا...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تعزيز الدقة والتكاثر في اختبارات ثني العظام الكاملة 

Skeletal fragility leading to fracture is an American public health crisis resulting in 1.5 million fractures each year and $18 billion in direct care costs. The ability to understand the mechanisms underlying bone disease and the response to treatment is not only desired, but critical. Mechanical testing of bone serves as a valuable technique for understanding and quantifying a bone&#39;s susceptibility to fracture. While this method appears simple to perform, inappropriate and inaccurate conclusions may be reached if governing assumptions and key steps are disregarded by the user. This has been observed across disciplines as studies continue to be published with misuse of methods and incorrect interpretation of results. This protocol will serve as a primer for the principles associated with mechanical testing along with the application of these techniques-from considerations of sample size through tissue harvesting and storage, to data analysis and interpretation. With this in hand, valuable information regarding a bone&#39;s susceptibility to fracture may be obtained, furthering understanding for both academic research and clinical solutions.

Mechanical testing of rodent bones is a valuable method for extracting information regarding a bone's susceptibility to fracture. Lacking proper practical understanding, the results may be overinterpreted or lack validity. This protocol will serve as a guide to ensure mechanical tests are performed accurately to provide valid and functional data.

Mechanical Testing Procedure to Check Bone&#39;s Susceptibility to Fracture

Mechanical Testing Procedure to Check Bone&#039;s Susceptibility to Fracture  

After harvesting the femur and tibia from the euthanized mouse, obtain a six to 10 micrometer resolution micro CT scan reconstructed for each sample to calculate for exercise geometry. Thaw all the bones for testing, and ensure to test all bones from the same experiment in one session. Now locate a load cell with sensitivity and capacity suitable for the specimen.Considering the failure range of the specimen, select a load cell with 50%more capacity while maximizing sensitivity. Locate the loading and support span fixtures. Install the load cell and fixtures by screwing the load cell onto the upper support of the tester, attaching the upper loading fixture to the load cell and mounting the lower fixture to the bottom support of the tester.Then select a support span length, which will remain constant for all samples. Use the shortest bone in the sample set to determine the support span distance, and properly orient the bone between the fixtures. To perform a three-point bending test of the femur.place the anterior surface of the bone against the support span, ensuring the position is within the diaphysis of the sample. Exclude the third trochanter on the proximal end and the transition point where the bone widens into the metaphysis and condyles on the distal end. Ensure the loading span is centered within the support span and contains a uniform region of the bone.Then measure and record the support span distance. Once the support span has been set and recorded, bring the lower fixture close to the upper fixture with enough room between the two for a bone to be placed. Place the bone back into saline or rehydrated with a saline bolus.Ensure all fixture parts are tight and free of movement. In the mechanical tester software, design a bending test profile with a slow displacement ramp rate to avoid viscoelastic effects to load the bone until it fails. After creating a testing profile, create distinct folders for every study group.Select a properly thawed bone, then measure and record its full length using calipers. Load the bone sample onto the fixture in the proper orientation. Alter the file name to reflect the particulars of the sample being tested and save each test in its corresponding folder.Zero the load and activate the system's mover, ensuring it's not in load or displacement control. Carefully apply a slight preload to the bone to secure its position. Avoid compromising the sample.Aim for a preload of about 0.25 Newtons. Make sure the desired bone orientation is kept consistent before moving forward. Hydrate the sample by generously dousing it with saline.On the software, initiate the bending test by selecting start or run. It's crucial to observe the sample for the duration of the test accurately, noting down any occurrences of issues. Monitor closely as the bone starts to fracture.Tests stop automatically when they reach their set limits. But if there's a failure, stop the test manually to avoid damaging the load cell. Once testing is complete, measure the length from the distal end to the breakpoint using calipers and record it.