המחברים מודים במיוחד לאוניברסיטת סנטה קטרינה על התמיכה הכספית, למעבדה לפרמקולוגיה לבעלי החיים ולחלל, ולמעבדה לביוכימיה של המופרזיטים ווקטורים על דגימת הדם השמורה בהקפאה הנגועה ב - T. evansi ששימשה בניסויים אלה.

כל הניסויים בוצעו באמצעות נקבות עכברים שוויצריות בוגרות בנות 10 שבועות (35-55 גרם). בעלי החיים שוכנו בכלובי פוליסולפון (3-5 בעלי חיים בכל כלוב) בחדר עם טמפרטורה מבוקרת (21 ± 1 מעלות צלזיוס), מחזור אור של 12 שעות / 12 שעות חושך, וצ'או מעבדה סטנדרטי ומים אד ליביטום. עשרה בעלי חיים הוקצו לכל קבוצה בכל ניסוי כדי להדגים את ההשפעות העקביות של טיפולים תרופתיים. תכנון הניסוי הוגש ואושר על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת סנטה קטרינה סטייט (CEUA) (מספר פרוטוקול: 6019201123). כל הניסויים בבעלי חיים עמדו בהנחיות ARRIVE (מחקר בבעלי חיים: דיווח על ניסויים in vivo ) ובוצעו בהתאם למדריך המועצה הלאומית למחקר לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
1. הכנת טריפנוזומה אוונסי וחיסון
אזהרה: יש ללבוש מעיל מעבדה חד-פעמי, כפפות, מסכה והגנה על העיניים בעת טיפול בדגימות דם נגועות, ריאגנטים ותרכובות כימיות אחרות.
<ol><li>הפעל את ציוד אמבט המים והתאם אותו בטמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>קח צינור מיקרוצנטריפוגה המכיל את דגימת הדם המשומרת מתוך אולטרה מקפיא (-80 ° C). מניחים אותו באמבט המים עד שהדם מפשיר. הערה: יש להשתמש באותו מבודד כדי להדביק את כל העכברים בכל קבוצה של ניסויים שונים כדי לשמור על מספר שווה של מעברי דם.</li>
	<li>השתמש במי מלח חוצצי פוספט (PBS, 0.1 M) המכיל 60% D-(+)-גלוקוז (pH 7.4) כדי לבצע דילול סדרתי (10:1 v v) עד 1 × 104 טריפנוזומים לכל 0.1 מ"ל מושגים. לקבוע את מספר תאי הטפיל על ידי ספירת תאים ידנית באמצעות תא נויבאואר על מיקרוסקופ עם עדשה אובייקטיבית 100x2.</li>
	<li>יש לחסן 0.1 מ"ל של תמיסת הדם המדוללת (קבוצה נגועה), או את אותו נפח ברכב 0.9% מלוחים (קבוצת ביקורת), תוך צפקית, באמצעות מחט 26 גרם 1/2 אינץ' המוצמדת למזרק אינסולין.</li>
</ol>2. הקמה ותפעול של מנגנון פון פריי אלקטרוני
הערה: היזהר לגבי האופן שבו הנתונים המתקבלים נרשמים. לחלק מציוד EvF יש תוכניות ספציפיות להעברת הנתונים המתקבלים מהמנגנון למכשירים אלקטרוניים אחרים, כגון מחשבים, טאבלטים או סמארטפונים.
<ol><li>הפעל את מנגנון EvF. ודא שהציוד טעון היטב לפני תחילת הניסוי, התבונן ברמת הסוללה המוצגת על מסך הציוד וטען אותה במידת הצורך.</li>
	<li>חבר את מנגנון EvF למכשיר האלקטרוני שנבחר באמצעות Wi-Fi כדי להעביר ולשמור את הנתונים המתקבלים.</li>
	<li>הכנס קצה פוליפרופילן של 10 μL לתוך חרוט מכשיר EvF והגדר את הקריאה לאפס (0.00 גרם) על ידי לחיצה על הלחצן עם סמל כפה.</li>
	<li>שימו לב כי לאחר בדיקת הרקמה המוערכת; הלחץ המרבי המופעל מוצג בתצוגת מנגנון EvF. לאחר מכן, העבר אותו למכשיר האלקטרוני שנבחר על ידי לחיצה על הלחצן עם סמל אנטנה להקלטה בטוחה.</li>
	<li>אפס את הקריאה לאפס והתכונן לבצע מדידה חדשה פשוט על ידי לחיצה נוספת על הכפתור עם סמל הכפה.</li>
</ol>3. שיקולים כלליים להערכות סף מכניות
<ol><li>בצע את כל הניסויים בחדר שקט עם טמפרטורה מבוקרת של 21 ° C ומחזור אור / 12 שעות חושך, והקפד לכבד את המחזור הביולוגי של העכבר על ידי ביצוע כל ההערכות באותו זמן של היום2.</li>
	<li>בקש מאותו אדם לבצע הן הערכות סף מכניות בסיסיות והן הערכות סף מכניות ניסיוניות כדי להפחית את ההטיה ולהבטיח עקביות מדידה; ודא שהניסויים מסונוורים.</li>
	<li>הניחו כל עכבר בעדינות בתוך תא נפרד עשוי פולימתיל מתקרילט (PMMA) עם חלק עליון מחורר הממוקם על מעמד רשתבגודל 5 מ"מ מ"ר 2,8.</li>
	<li>אפשרו לעכברים להתאקלם במשך 30 דקות בתאי PMMA לפני הערכת ערכי הסף המכניים הבסיסיים והניסיוניים2.</li>
	<li>מקמו את מעמד רצפת הרשת בגובה נוח (על משטח יציב) כך שבעלי החיים יהיו נגישים מכל הצדדים. ודאו שהבטן וכל ארבע כפות הרגליים של העכברים נגישים בקלות דרך פתחי רצפת הרשת.</li>
	<li>כסו את המשטח היציב המשמש להקצאת התאים בחומר סופג לספיגה או איסוף של מיקטוריציה ועשיית צרכים. ודא כי זרועותיו של החוקר יכולות לנוע בחופשיות מתחת לתאים בעת הפעלת מנגנון EvF.</li>
</ol>4. הערכת סף מכנית בסיסית ותגובת עכבר לגירויים
<ol><li>למדידות בטן, חלקו את הבטן לשלושה חלקים וירטואליים (אזורי גולגולת, בינוניים וקאודליים). בחר את אזור הגולגולת (המכיל אנטומית את הכבד) כרקמת המטרה הסטנדרטית להערכת סף מכני של אלודיניה ויסצרלית. עבור מדידות כפות, בחר את הכף האחורית הימנית עבור סטנדרטיזציה.</li>
	<li>בצע מדידה בסיסית מכל עכבר 48 שעות לפני ההדבקה. כדי לעשות זאת, הניחו את העכברים בתאים המכילים, הכינו את מנגנון ה-EvF והשתמשו בשתי הידיים כדי להרים את הגשושית לאט כדי לגרות את רקמת המטרה.</li>
	<li>בהדרגה להגדיל את הלחץ על הרקמה עד העכבר מבטא התנהגות nociceptive . להערכת כף אחורית ימנית, חפשו נסיגת כפות, ליקוק כפות או קפיצת ארבע כפות 2,8,9. להערכת הקרביים, חפשו נסיגה חדה של הבטן, ליקוק או גירוד מיידי של אתר הבדיקה, או קפיצה של ארבע כפות 2,11.</li>
	<li>שמור את הערך המתקבל על ידי העברת הנתונים למכשיר האלקטרוני שנבחר המכיל את תוכנית EvF הספציפית או כתיבתו בספר כיתה. אפס את התצוגה לאפס וחזור על התהליך ארבע פעמים כדי לקבל חמש מדידות8. הערה: שקול רק שלוש מדידות דומות כדי להעריך את הערך הממוצע2</li>
	<li>מדדו את הסף המכני של העכבר הקיים בתא הסמוך עד שכל עכבר נבדק חמש פעמים ומתקבל ערך ממוצע עבור כל חיה.</li>
	<li>חזור על מדידות קו הבסיס 24 שעות מאוחר יותר ולא כולל עכברים עם ערכים ממוצעים מתחת ל- 3.00 גרם או עם הבדלים בין מדידות בסיסיות גבוהות מ- 2.00 גרם 2,8. הערה: בכל ניסוי יש לבחור רקמת מטרה אחת בלבד עבור כל עכבר כדי שהחיות לא יתרגלו להיבדק, מכיוון שמספר ההערכות יהיה גבוה משמעותית בתקופה קצרה.</li>
</ol>5. הערכת סף מכנית ניסיונית של כף ימין אחורית ואלודיניה קרבית
<ol><li>הערך את הכף האחורית הימנית או את הסף המכני של אלודיניה ויסצרלית 1 שעות לאחר ההדבקה להערכה ביום 0.</li>
	<li>חזור על ההליך כל 24 שעות במשך 5 ימים לאחר ההדבקה. הערה: אם יש טיפול שיש לתת, בחר נקודת זמן מתאימה בתוך תכנון הניסוי.</li>
	<li>החזירו את העכברים לכלובים המקוריים שלהם כדי למנוע מבעלי החיים להילחם זה בזה, עם גישה לצ'או מעבדה סטנדרטי ומים לאחר השלמת המדידות.</li>
	<li>לבצע בדיקת תקינות כדי לבדוק את ההתפלגות הנורמלית של הנתונים וניתוח סטטיסטי מתאים נוסף של הנתונים שנאספו.</li>
</ol>6. הערכת סולם עווית עכבר
<ol><li>ודא שכל עכבר נראה בקלות כשהוא בתוך התא המכיל ובדוק כל עכבר לפני הניסוי כדי לוודא שאין נגעים בגפיים, בבטן או בפנים ואין שינויים בפרווה.</li>
	<li>התבונן באזור המסלול של העכבר. סווג עיניים פקוחות כהיעדר כאב (ציון 0) בעוד שכאב ברור עשוי להיות מיוצג כאשר העכבר עוצם את עיניו (ציון 2).</li>
	<li>התבוננו באפו של העכבר. לסווג אף נורמלי כמו היעדר כאב בעוד נוכחות של בליטה על גשר האף מייצג כאב ברור.</li>
	<li>התבוננו בלחיי העכבר. לסווג לחיים נורמליות כמו היעדר כאב בעוד נוכחות של בליטה על שתי הלחיים מייצג כאב ברור.</li>
	<li>שימו לב למיקום אוזני העכבר. לסווג אוזניים מעוגלות כהיעדר כאב בעוד אוזניים מסתובבות החוצה או אחורה, הרחק מהפנים, בצורה מחודדת, מייצגות כאב ברור. הרווח בין האוזניים גדל עם ציון הכאב.</li>
	<li>התבוננו בשפם של העכבר. סווגו שפמים עם העקומה הטבעית שלהם כלפי מטה כהיעדר כאב, בעוד שפם שנמשך לאחור כנגד הלחי או נמשך קדימה מייצג כאב ברור.</li>
	<li>מכיוון שהתנהגויות מולדות, כגון טיפוח עצמי, עלולות להפריע להבעת הפנים, אל תתייחס אליהן כאל התנהגויות הקשורות לכאב8. המתן עד שהעכבר יפסיק אופן פעולה זה לפני כל הערכה של יחידת פעולה.</li>
	<li>לבצע בדיקת תקינות כדי לבדוק את ההתפלגות הנורמלית של הנתונים וניתוח סטטיסטי מתאים נוסף של הנתונים שנאספו. הערה: בסוף כל הניסויים, עכברים עברו המתת חסד אנושית באמצעות קטמין (90 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (7.5 מ"ג/ק"ג), שהוזרקו תוך צפקית. לאחר שהגיעו לתוכנית מאושרת להרדמה עמוקה, הם הוגשו לפריקת צוואר הרחם.</li>
</ol>

הערכת כאב ואלודיניה בבעלי חיים נגועים ב- T. evansi

<ol>
	<li>Desquesnes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+evansi+and+surra:+a+review+and+perspectives+on+origin,+history,+distribution,+taxonomy,+morphology,+hosts,+and+pathogenic+effects.">Trypanosoma evansi and surra: a review and perspectives on origin, history, distribution, taxonomy, morphology, hosts, and pathogenic effects.</a> BioMed Research International. 2013, 194176 (2013).</li><li>Cipriani, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Trypanosoma+evansi+infection+induces+pain+along+with+oxidative+stress,+prevented+by+COX-2+inhibition.">Experimental Trypanosoma evansi infection induces pain along with oxidative stress, prevented by COX-2 inhibition.</a> Experimental Parasitology. 247, 108477 (2023).</li><li>Paim, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+in+rats+experimentally+infected+with+Trypanosoma+evansi.">Cytokines in rats experimentally infected with Trypanosoma evansi.</a> Experimental Parasitology. 128 (4), 365-370 (2011).</li><li>Gillingwater, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+investigations+of+selected+diamidine+compounds+against+Trypanosoma+evansi+using+a+mouse+model.">In vivo investigations of selected diamidine compounds against Trypanosoma evansi using a mouse model.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (12), 5074-5079 (2009).</li><li>Dkhil, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+Trypanosoma+evansi-infected+mice+with+Eucalyptus+camaldulensis+led+to+a+change+in+brain+response+and+spleen+immunomodulation.">Treatment of Trypanosoma evansi-infected mice with Eucalyptus camaldulensis led to a change in brain response and spleen immunomodulation.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 833520 (2022).</li><li>Dkhil, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+liver+response+to+Allium+sativum+treatment+during+infection+induced-trypanosomiasis.">Murine liver response to Allium sativum treatment during infection induced-trypanosomiasis.</a> Saudi Journal of Biological Sciences. 28 (6), 3270-3274 (2021).</li><li>Martins de Moraes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+by+Trypanosoma+evansi+in+horses+from+Brazil.">Infection by Trypanosoma evansi in horses from Brazil.</a> Revista Portuguesa de Ci&#234;ncias Veterin&#225;rias. 102 (561-562), 159-163 (2007).</li><li>Martinov, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+changes+in+tactile+sensitivity+in+the+hind+paw+of+mice+using+an+electronic+von+Frey+apparatus.">Measuring changes in tactile sensitivity in the hind paw of mice using an electronic von Frey apparatus.</a> Journal of Visualized Experiments. 82, e51212 (2013).</li><li>Rodr&#237;guez-Angulo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+TNF+in+sickness+behavior+and+allodynia+during+the+acute+phase+of+Chagas'+disease.">Role of TNF in sickness behavior and allodynia during the acute phase of Chagas' disease.</a> Experimental Parasitology. 134 (4), 422-429 (2013).</li><li>Langford, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+of+facial+expressions+of+pain+in+the+laboratory+mouse.">Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse.</a> Nature Methods. 7, 447-449 (2010).</li><li>Eijkelkamp, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+visceral+sensitivity+to+capsaicin+after+DSS-induced+colitis+in+mice:+spinal+cord+c-Fos+expression+and+behavior.">Increased visceral sensitivity to capsaicin after DSS-induced colitis in mice: spinal cord c-Fos expression and behavior.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 293 (4), 749-757 (2007).</li><li>Mekata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+regulatory+dendritic+cell-related+cytokines+in+cattle+experimentally+infected+with+Trypanosoma+evansi.">Expression of regulatory dendritic cell-related cytokines in cattle experimentally infected with Trypanosoma evansi.</a> Journal of Veterinary Medical Science. 77 (8), 1017-1019 (2015).</li><li>Mukaka, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistics+corner:+a+guide+to+appropriate+use+of+correlation+coefficient+in+medical+research.">Statistics corner: a guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research.</a> Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).</li><li>Schober, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+coefficients:+appropriate+use+and+interpretation.">Correlation coefficients: appropriate use and interpretation.</a> Anesthesia and Analgesia. 126 (5), 1763-1768 (2018).</li><li>Kamidi, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+virulence+of+camel+Trypanosoma+evansi+isolates+in+mice.">Differential virulence of camel Trypanosoma evansi isolates in mice.</a> Parasitology. 145 (9), 1235-1242 (2018).</li><li>Mekata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+cloning,+and+pathologic+analysis+of+Trypanosoma+evansi+field+isolates.">Isolation, cloning, and pathologic analysis of Trypanosoma evansi field isolates.</a> Parasitology Research. 112, 1513-1521 (2013).</li><li>Silva, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+evansi+pathogenicity+strain+in+rats+inoculated+with+parasite+in+fresh+and+cryopreserved+blood.">Trypanosoma evansi pathogenicity strain in rats inoculated with parasite in fresh and cryopreserved blood.</a> Ci&#234;ncia Rural. 39 (6), 1842-1846 (2009).</li><li>Silva, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholinesterase+activity+and+lipid+peroxidation+in+the+brain+and+spinal+cord+of+rats+infected+with+Trypanosoma+evansi.">Acetylcholinesterase activity and lipid peroxidation in the brain and spinal cord of rats infected with Trypanosoma evansi.</a> Veterinary Parasitology. 175, 237-244 (2011).</li><li>Di&#243;genes, A. K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+validity+of+electronic+von+Frey+as+an+assessment+tool+for+burn+associated+pain.">Concurrent validity of electronic von Frey as an assessment tool for burn associated pain.</a> Burns. 46 (6), 1328-1336 (2020).</li><li>Kalueff, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiology+of+rodent+self-grooming+and+its+value+for+translational+neuroscience.">Neurobiology of rodent self-grooming and its value for translational neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17, 45-59 (2016).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

שלב קריטי בניסויים בבעלי חיים נגועים הוא שליטה ברמות הטפילות. זנים שונים של T. evansi עשויים להתנהג בדרכים שונות בעכברים, מה שמוביל מזיהומים חריפים לכרוניים 2,4,5,6. יתר על כן, שינויים במינון הזיהום עשויים להפחית או להארי...

Trypanosoma evansi הוא סוכן אטיולוגי של המחלה המכונה "surra" או "mal-das-cadeiras" בדרום אמריקה 1,2. זה בדרך כלל משפיע על סוסים ובקר, אבל גם בעלי חיים פראיים, להיות מועבר על ידי עטלפים hematophagous, tabanids, ו stomoxes עקיצות זבוב 1,3. סורה היא מחלה מרכזית בחיות בית, אשר יכולה להיות קטלנית בהיעדר הטיפול הנכון, הצגת סימנים קליניים לא ספציפיים כגון אנמיה, אובדן תיאבון ומשקל, חולשת שרירים והפלה, אשר עשויים להשתנות בהתאם המארח ואת האזור הגיאוגרפי 2,4,5,6.
הביטוי של אלודיניה וכאב בבעלי חיים נגועים במהלך המחלה הוא עדיין נושא חדש 2,7. הדחף להבין את הפתוגנזה שמאחורי סימנים אלה הוא צעד חשוב לשיפור ולשכלול הטיפול המשמש כיום על ידי הוספת תרופות משככות כאבים יעילות לפרוטוקול הטריפנוצידלי הקלאסי 5,6. בתרחיש זה, האפשרות לשכפל את המחלה באמצעות מודל מורין מהווה יתרון, שכן עכברים יכולים להישמר בקלות תחת סביבה מבוקרת במעבדה ולכן להניב תוצאות עקביות יותר מאשר ניסויי שדה באמצעות בעלי חיים.
סף מכני מתקבל בדרך כלל באמצעות מכשיר פון פריי אלקטרוני (EvF) להערכת אלודיניה במספר עצום של ניסויים 2,8,9. מכשיר זה משמש להערכת רגישות הרקמה לגירוי מכני: ברגע שהמנגנון נוגע בכפה של החיה, דרך קצה של 20-200 מיקרוליטר המחובר למכשיר, נרשם הכוח שבו החיה מושכת את הכפה.
מכרסמים משמשים בדרך כלל כבעלי חיים סטנדרטיים בניסויים אלה, ורוב התוצאות מוסקות למינים אחרים, מכיוון שרוב המחלות הנחקרות מגיעות ממינים אחרים שבהם יהיה קשה לערוך מחקר מבוקר. יתר על כן, אלודיניה וכאב קשורים זה לזה באופן הדוק. השימוש בסולם פנים ספציפי להערכת כאב בעכברים נגועים ממלא תפקיד חשוב כאדג'ובנט מאשר כדי לאשר את נוכחות הכאב במהלך זיהום T. evansi 2,10.
בפרוטוקול זה, אנו מדגימים מודל חדשני להערכת אלודיניה וכאב בעכברים שנדבקו בניסוי ב- T. evansi, המראה מתאם גבוה בין משתנים, ובכך הוכח כמודל חזק. יתר על כן, זה דורש מספר קטן של חוקרים לבצע את כל ההליך, להקטין את הסיכוי להתערבות אנושית במהלך הניסוי. היא גם מאפשרת לחוקר לשכפל את מחלת המטרה במהלך מהלך אקוטי ולהוסיף מספר תרופות טיפוליות שונות בתכנון הניסוי, ובכך לקבל תוצאות עקביות בתקופה קצרה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>26 G 1/2&#34; needle coupled to insulin syringe</td>
			<td>TKL</td>
			<td>80288090100</td>
			<td>Used to infund solutions on laboratory animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accessories for von Frey analgesimeter</td>
			<td>INSIGHT</td>
			<td>EFF 303</td>
			<td>Containment box with support for digital analgesimeter assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G7021</td>
			<td>A monosaccharide which is the main source of energy in the form of ATP for living organisms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital analgesimeter</td>
			<td>INSIGHT</td>
			<td>von Frey Wi-Fi</td>
			<td>The von Frey Wi-Fi is a portable device used to assess tissue sensitivity to mechanical stimuli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson type 10 &#181;L polypropylene tip</td>
			<td>CRALPLAST</td>
			<td>18261</td>
			<td>Polypropylene to be used on eletronic von Frey apparatus, recommended for hind paw allodynia assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory water bath</td>
			<td>BEING INSTRUMENT</td>
			<td>BW-22P</td>
			<td>Used to heat liquid and semi-solid substances contained in appropriate recipients to specific temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>806552</td>
			<td>A balanced salt solution buffer used for a variety of cell culture applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss mice (Mus musculus) from both gender</td>
			<td>UFSC</td>
			<td>Swiss Webster</td>
			<td>Laboratory animals used for controlled experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypanosoma evansi cryiopreserved sample</td>
			<td>UDESC</td>
			<td>-</td>
			<td>Sample used to infect all mice, ceded by the Hemoparasites and Vectors Biochemistry Laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal type 10 &#181;L polypropylene tip</td>
			<td>CRALPLAST</td>
			<td>18171</td>
			<td>Polypropylene to be used on eletronic von Frey apparatus, recommended for visceral allodynia assessment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electronic von frey associated with the mouse grimace scale to assess allodynia and pain in trypanosoma evansi-infected mice

פתוגנזה של מחלות זיהומיות היא עדיין תחום מורכב למחקר. מהלך של מספר סימנים קליניים, כגון אלודיניה וכאב, ניתן לראות בחיות בית. עם זאת, הידע על המסלולים שלהם והטיפול הנכון דורשים ניסויים מבוקרים, רבים מהם באמצעות חיות מעבדה. מדידת שינויים בספים המכניים של הכף האחורית והקרביים היא טכניקה שימושית לצפייה בשינויים בתפיסת הכאב אצל מכרסמים. תגובת נסיגה יכולה להימדד תחילה בבדיקות בסיסיות, מה שיוצר שליטה טובה יותר בקבוצות הניסוי. ניתן לבצע בדיקות עוקבות לאחר גרימת זיהום והוספת תרופות לפרוטוקול. השימוש במכשיר פון פריי אלקטרוני הקשור לשימוש בסולם פנים כדי לצפות בשינויים דמויי כאב מאפשר הערכה פשוטה, מדויקת ועקבית להערכת אלודיניה וכאב בעכברים. לפיכך, ניסויים המשתמשים במתודולוגיה הנוכחית עבור זיהום Trypanosoma evansi מייצגים שיטה שימושית להערכת allodynia וכאב בבעלי חיים נגועים במעבדה, אשר ניתן ליישם על הטיפול הקונבנציונאלי עבור בעלי חיים.

Trypanosoma evansi is the etiological agent of the disease called &#34;surra&#34; or &#34;mal-das-cadeiras&#34; in South America1,2. It commonly affects equines and cattle, but also wild fauna, being transmitted by hematophagous bats, tabanids, and stomoxes fly bites1,3. Surra is a major disease in domestic animals, which can be fatal in the absence of the correct treatment, exhibiting nonspecific clinical signs such as anemia, loss of appetite and weight, muscle weakness, and abortion, which may vary according to the host and geographic region2,4,5,6.
The expression of allodynia and pain in infected animals during the course of the disease is still a new topic2,7. The urge to understand the pathogenesis behind these signs is an important step to improve and refine the currently used treatment by adding effective analgesic drugs to the classic trypanocidal protocol5,6. In this scenario, the possibility of replicating the disease using a murine model represents an advantage, as mice can be easily kept under controlled environments in the laboratory and therefore, yield results that are more consistent than field experiments using livestock.
A mechanical threshold is commonly obtained using an electronic von Frey (EvF) apparatus for the evaluation of allodynia in a vast number of experiments2,8,9. This device is used to assess tissue sensitivity to mechanical stimulation: once the apparatus touches the paw of the animal, through a 20-200 &#181;L tip attached to the device, the force with which the animal withdraws the paw is recorded.
Rodents are usually used as standard animals in these experiments, and most results are extrapolated to other species, as most researched diseases come from other species in which it would be difficult to conduct a controlled study. Furthermore, allodynia and pain are intimately related. The use of a specific facial scale to evaluate pain in infected mice plays an important role as a confirming adjuvant to affirm the presence of pain during the course of T. evansi infection2,10.
In this protocol, we demonstrate a novel model to evaluate allodynia and pain in mice experimentally infected with T. evansi, showing a high correlation between variables, thus proving to be a strong model. Furthermore, it requires a small number of researchers to carry out the entire procedure, decreasing the chance of human interference during the experiment. It also enables the investigator to replicate the target disease during an acute course and add several different treatment drugs in the experimental design, thereby obtaining consistent results in a short period.

מחבר זרקור: הערכת כאב וקידום רווחת בעלי חיים בחיות מעבדה נגועות Trypanosoma evansi

פון פריי האלקטרוני קשור לסולם גרימס עכבר להערכת אלודיניה וכאב בעכברים נגועים בטריפנוסומה אוונסי

The question we intend to answer with this study is to evaluate nociception in laboratory animals experimentally-infected with Trypanosoma evansi, as observed in previous studies by our group. In relation to Trypanosoma evansi, the most recent developments are regarding prevalence studies in various locations around the globe, followed by the search for specific biomarkers for differential diagnosis. Some experimental challenges are mainly related to animal welfare.All the care related to the three Rs must be reviewed and encouraged. We believe that an article with video instruction, as we show in this study, is a good incentive to discuss reduction in experimental models. Our experiments enable the necessity of analgesics during Trypanosoma evansi infection, since this infection was able to diminish the nociception threshold in our model.We can now ask ourselves how the inflammation, allodynia and pain caused by Trypanosoma evansi infection affects the disease's progression. We also need to understand how it molecularly impacts the hosts'clinical sites and behavior, as well as the parasites'behavior inside infected organism.

ירידה בסף המכני עקב זיהום T. evansi כפי שהוערך על ידי מכשיר פון פריי אלקטרוני הן בכפה האחורית הימנית והן ברקמות הקרביות הניסוי נערך במשך 5 ימים, על פי נתונים קודמים הקשורים למדגם T. evansi הזמין 2. עכברים נגועים החלו להראות הבדל משמעותי בסף המכני בכפה האחורית הימני?...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להערכת nociception בעכברים נגועים Trypanosoma evansi, באמצעות מכשיר פון פריי האלקטרוני ככלי, מדידת סף מכני של הכף האחורית ואת הקרביים.

Infectious disease pathogenesis is still a complex field to study. The course of several clinical signs, such as allodynia and pain, may be observed in ...

השאלה שאנו מתכוונים לענות עליה במחקר זה היא להעריך nociception בחיות מעבדה נגועות בניסוי Trypanosoma evansi, כפי שנצפה במחקרים קודמים על ידי הקבוצה שלנו. ביחס לטריפנוזומה אוונסי, ההתפתחויות האחרונות הן לגבי מחקרי שכיחות במקומות שונים ברחבי העולם, ולאחר מכן החיפוש אחר סמנים ביולוגיים ספציפיים לאבחנה מבדלת. חלק מהאתגרים הניסיוניים קשורים בעיקר לרווחת בעלי חיים.יש לבחון ולעודד את כל הטיפול הקשור לשלושת ה-R. אנו מאמינים כי מאמר עם הוראת וידאו, כפי שאנו מראים במחקר זה, הוא תמריץ טוב לדון בהפחתה במודלים ניסיוניים. הניסויים שלנו מאפשרים את הצורך במשככי כאבים במהלך זיהום Trypanosoma evansi, שכן זיהום זה הצליח להפחית את סף nociception במודל שלנו.כעת אנו יכולים לשאול את עצמנו כיצד הדלקת, האלודיניה והכאב הנגרמים על ידי זיהום טריפנוזומה אוונסי משפיעים על התקדמות המחלה. עלינו גם להבין כיצד הוא משפיע מולקולרית על האתרים הקליניים וההתנהגות של המארחים, כמו גם על התנהגות הטפילים בתוך האורגניזם הנגוע.

electronic-von-frey-associated-with-mouse-grimace-scale-to-assess

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Electronic von Frey associated with the Mouse Grimace Scale to Assess Allodynia and Pain in Trypanosoma evansi-Infected Mice

464 Views.  Santa Catarina State University. השאלה שאנו מתכוונים לענות עליה במחקר זה היא להעריך nociception בחיות מעבדה נגועות בניסוי Trypanosoma evansi, כפי שנצפה במחקרים קודמים על ידי הקבוצה שלנו. ביחס לטריפנוזומה אוונסי, ההתפתחויות האחרונות הן לגבי מחקרי שכיחות במקומות שונים ברחבי העולם, ולאחר מכן החיפוש אחר סמנים ביולוגיים ספ...

Video: מחבר זרקור: הערכת כאב וקידום רווחת בעלי חיים בחיות מעבדה נגועות Trypanosoma evansi

Infectious disease pathogenesis is still a complex field to study. The course of several clinical signs, such as allodynia and pain, may be observed in domestic animals. However, the knowledge of their pathways and correct treatment need controlled experiments, many of them using laboratory animals. Measuring changes in mechanical thresholds of the hind paw and viscera is a useful technique to observe changes in pain perception in rodents. Withdrawal response can be measured first in baseline tests, which creates better control of experimental groups. Subsequent tests can be performed after inducing infection and adding drugs to the protocol. The use of an electronic von Frey apparatus associated with the use of a facial scale to observe pain-like changes allows a simple, precise, and consistent assessment to evaluate allodynia and pain in mice. Thus, experiments using the present methodology for Trypanosoma evansi infection represent a useful method to evaluate allodynia and pain in laboratory-infected animals, which can be applied to the conventional treatment for livestock animals.

Here, we present a protocol to evaluate nociception in mice infected with Trypanosoma evansi, using the electronic von Frey apparatus as a tool, measuring mechanical thresholds of the hind paw and viscera.

Preparation and Inoculation of Trypanosoma evansi in Mouse to Evaluate Allodynia and Pain

To begin, turn on the water bath equipment and set it at 37 degrees Celsius, remove a micro centrifuge tube containing the preserved blood sample from the ultra freezer and place it in the water bath until the blood thaws. Perform serial dilution using PBS with 60%glucose to dilute the trypanosomes. Count the number of parasite cells using a neubauer chamber under a microscope with a 100 times objective lens.

הכנה וחיסון של Trypanosoma evansi בעכבר כדי להעריך allodynia וכאב

Electronic Von Frey (EvF) Apparatus Set up for the Evaluation of Allodynia and Pain in Trypanosoma evansi Infected Animals

Set up a quiet room with a controlled temperature of 21 degrees Celsius in a 12-hour light and 12-hour dark cycle. Gently place each mouse into a chamber made of PMMA placed on a five square millimeter mesh floor stand. Allow the mice to acclimate for 30 minutes before assessing baseline and experimental mechanical thresholds.Then adjust the mesh floor stand to a comfortable height so that the mice can be assessed from all sides, and their abdomen and all four paws are easily reachable through the mesh floor openings. Cover the surface beneath the chambers with absorbent material to manage micturition and defecation. Ensure that there is ample arm space below the chambers while using the EVF apparatus.After setting up the EVF apparatus for mechanical threshold assessments, conduct abdomen measurements by dividing the mouse abdomen into three virtual sections. To obtain baseline measurements, 48 hours before infection, place the mice in the chambers, and half an hour after setting up the EVF apparatus, stimulate the designated tissue by gradually elevating the probe with both hands. Now, apply gradual pressure to the tissue until the mouse displays nociceptive behavior.To evaluate the right hind paw, watch for actions such as retraction, paw licking, or four-paw jumping. For visceral assessment, observe sudden abdominal retraction, immediate licking or scratching of the probed area, or four-paw jumping. Then save the recorded value into the designated electronic device with the EVF program or document it in a notebook.Reset the display to zero. Probe each mouse in the adjacent chamber five times, calculate their individual average values and reassess the baseline measurements after 24 hours.

מכשיר פון פריי אלקטרוני (EvF) שהוקם להערכת אלודיניה וכאב בבעלי חיים נגועים בטריפניוזומה אוונסי

Mechanical Threshold Assessment of Mice Infected with Trypanosoma evansi

Inject the experimental mice intraperitoneally with 0.1 Milliliters of diluted blood solution infected with Trypanosoma evansi. For the control group, inject 0.1 milliliters of PBS vehicle intraperitoneally into the mice. One hour later, set up the EVF apparatus for mechanical threshold assessments.For the day zero assessment, after one hour of infection, and 30 minutes of acclimatization of the mice, evaluate the mechanical threshold for the right hind paw or visceral allodynia. After taking the measurements, return the mice to their original cages to avoid conflicts among them and provide standard lab chow and water ad libitum.