המחקר נתמך על ידי מענק PID2020-113202RB-I00 במימון Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN)/Agencia Estatal de Investigación (AEI), Gobierno de España/10.13039/501100011033 ו-"European Regional Development Fund (ERDF). דרך לעשות את אירופה". NCC ו- MAR קיבלו מלגות קדם-דוקטורט (PRE2021-099481 ו- PRE2018-085737, בהתאמה) שמומנו על ידי MCIN/AEI / 10.13039/501100011033 ועל ידי "הקרן החברתית האירופית (ESF) משקיעה בעתיד שלך". אנו מודים לפרנסיסקה רואיז-חאן וללאונרדו מארקס-קיסינוסקי על תמיכתם הטכנית. אנו מכירים בתמיכת מתקן הדמיית MRI של Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS). תוכנית Centres de Recerca de Catalunya (CERCA) של Generalitat de Catalunya תומכת ב- IDIBAPS.

עבודת בעלי חיים נעשתה בעקבות החוקים הקטלאניים והספרדיים (Real Decreto 53/2013) והדירקטיבות האירופיות, באישור הוועדה האתית (Comité Ètic d'Experimentació Animal, CEEA) של אוניברסיטת ברצלונה, וגופי הרגולציה המקומיים של Generalitat de Catalunya. מחקרים מדווחים בהתאם להנחיות ARRIVE . הליך זה מיועד לביצוע בעכברים בוגרים, החל מגיל 8 שבועות, ללא הגבלת גיל. דוגמאות להליך כירורגי שפותח בעכברי C57BL/6 בגילאי 10-12 שבועות מובאות כאן. יש לקחת בחשבון הבדלים אנטומיים בהתאם לזן העכבר.
1. הכנת בעלי חיים
<ol><li>לפני תחילת ההליך הכירורגי, לאסוף ולעקר את כל החומרים והכלים הדרושים. ערכו את שולחן הניתוחים עם כל החומרים הכירורגיים הדרושים (המפורטים בטבלת החומרים).</li>
	<li>מרדימים את בעל החיים באמצעות שאיפת איזופלורן בתערובת של חמצן ותחמוצת החנקן (30%/70%).</li>
	<li>מתן buprenorphine (ראה טבלה של חומרים) תת עורית במינון של 0.05 מ"ג / ק"ג BW כדי לספק שיכוך כאבים ולהקל על כל כאב ואי נוחות. הערה: שיכוך כאבים הוא חובה, אך פרוטוקולים שונים מתקבלים. סימני כאב ואי נוחות חייבים להיות נשלטים גם בימים הראשונים לאחר MCAo (ראה שלב 4). החל פתרונות מתקנים בעת הצורך.</li>
	<li>הכניסו את בעל החיים לקופסת אינדוקציה להרדמה (ראו טבלת חומרים) עם איזופלורן 5% עד שהוא מגיע למצב של הרדמה עמוקה (אובדן רפלקס בניקור כפות ורפלקס עיני).</li>
	<li>מקם את העכבר על שולחן הניתוחים ולהפחית את רמת isoflurane ל 1.5%, מועבר על ידי מסכת פנים. יש למרוח משחה וטרינרית כדי למנוע יובש בעיניים במהלך ההליך.</li>
	<li>שמור על טמפרטורת הגוף ב 37 ± 0.5 ° C נשלט על ידי בדיקה רקטלית המחוברת כרית חימום (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>לגלח את החלק הגחוני של הצוואר ואת הראש (calvaria) עם סכין גילוח חשמלי. יש להסיר בזהירות שאריות פרווה ולחטא את אזורי העור שלוש פעמים בתנועות מעגליות עם חומר חיטוי על בסיס יוד ו-70% אלכוהול. .</li>
</ol>2. הערכת זרימת דם מוחית (CBF) באמצעות מד זרימה דופלר בלייזר (LDF)
<ol><li>עם מספריים, לעשות חתך על העור של הראש, לכיוון התפר sagittal, מן האוזניים לאזור בין העיניים.</li>
	<li>למשוך את העור ולהסיר את periosteum בצד ימין של הגולגולת.</li>
	<li>מצאו את הקואורדינטות (2.5 מ"מ רוחביות מברגמה) וחברו את מחזיק הדופלר (ראו טבלת חומרים) באמצעות ציאנואקרילט. לאחר שהדבק התייבש, חברו את בדיקת דופלר ובדקו את קריאת האות הנכונה.</li>
</ol>3. חסימת עורק מוחי אמצעי חולף (tMCAo)
<ol><li>הפוך את העכבר למצב שכיבה, וקבע אותו לשולחן הניתוחים עם סרט רפואי.</li>
	<li>בצע חתך קו אמצע בצוואר. משוך לרוחב את העור ואת בלוטות הרוק באמצעות retractors (ראה טבלה של חומרים) כדי לחשוף את אזור התרדמה.</li>
	<li>זהו את האנטומיה של כלי הדם של עורק התרדמה המשותף (CCA), האגודה למלחמה בסרטן וה-ECA, כמו גם את העורקים השונים הנגזרים מהם (מקסילרי ולשוני, בלוטת התריס העליונה, העורפית והפטריגופלטין) (איור 1A).</li>
	<li>נתקו את העורקים הראשיים מרקמת החיבור הסמוכה כדי שניתן יהיה לטפל בהם. הערה: היזהר במיוחד לא לפגוע בעצבים, במיוחד בעצב התועה, הפועל במקביל ל- CCA.</li>
	<li>יש לעטוף תפר משי 6-0 (ראו טבלת חומרים) סביב ה-ECA בהתפצלות המקסילרית/לשונית. אבטח היטב קשר כדי להפריע לצמיתות את זרימת הדם.</li>
	<li>מעבירים תפר שני סביב אותו עורק, בין הקשר הראשון לביפורקציה של CCA, ושומרים על קשר זה רופף.</li>
	<li>מניחים חוט שלישי סביב CCA וקושרים קשר מחליק שניתן להתיר בקלות. הערה: זה יכול להתבצע גם עם קליפס כלי דם, אבל החוט מאפשר יותר תנועה וגמישות. בשלב זה ניתן לראות ירידה ראשונה ב- CBF באות LDF.</li>
	<li>הניחו אטב כלי דם (ראו טבלת חומרים) המפריע לזרימת הדם מהאגודה למלחמה בסרטן.</li>
	<li>בצע חתך קטן ב- ECA, קרוב לאזור בו נמצא הקשר ההדוק.</li>
	<li>הכנס את המונופילמנט עד שהציפוי העבה נכנס לחלוטין ללומן העורקי.</li>
	<li>הדקו את הקשר השני כדי להחזיק את המונופילמנט בתוך העורק ומנעו מהלחץ שהדם מפעיל לדחוף אותו החוצה (איור 1B).</li>
	<li>הסר את אטב כלי הדם מהאגודה למלחמה בסרטן.</li>
	<li>חתכו את ה-ECA מתחת לקשר הראשון וסובבו את הגדם כדי לכוון אותו לכיוון ה-ICA (איור 1C).</li>
	<li>מקדמים את המונופילמנט דרך האגודה למלחמה בסרטן עד לנקודה שבה ה-MCA מסתעף. הערה: החסימה משתקפת בירידה פתאומית בזרימת הדם בקריאת LDF. אנו רואים חסימה מוצלחת כאשר הירידה ב- CBF גדולה מ -70% מהערך הבסיסי. אם מערכות מדידה CBF אינן זמינות, ניתן לציין את נקודת החסימה על ידי ההתנגדות להתקדמות, אשר בעכברים בוגרים היא בדרך כלל כ -11 מ"מ מההתפצלות של CCA.<ol><li>אם ההרדמה נמשכת במהלך תקופת החסימה, לפקח על העכבר ולשמור אותו תחת השגחה מתמדת במשך 45 דקות.</li>
		<li>במקרה שהעכבר מתעורר במהלך תקופת החסימה, תפרו את עור הצוואר במספר תפרים. מבלי לנתק את בדיקת LDF, הניחו את העכבר בקופסה מבוקרת טמפרטורה, המאפשרת התאוששות מהרדמה. הערה: זה נפוץ עבור העכבר להפגין התנהגות סיבובית ספונטנית במהלך תקופה זו, המעיד על חסימה מוצלחת.</li>
		<li>לאחר 40 דקות, יש להרדים את העכבר שוב לאחר אותם הליכי הרדמה וחיטוי כפי שמצוין בנקודות 1.4, 1.5 ו-1.7. הניחו אותו בחזרה על שולחן הניתוחים, והוציאו את התפרים מהצוואר.</li>
	</ol></li>
	<li>לאחר 45 דקות של חסימה, שחררו את הקשר המחזיק את המונופילמנט במקומו. משוך לאט ובעדינות על חוט הלהט ובדוק שמתרחשת התחדשות רקמות.</li>
	<li>משוך את חוט הלהט והדק את הקשר כדי למנוע איבוד דם.</li>
	<li>להתיר את קשר CCA. יש לוודא שאין נזק לדופן העורק.</li>
	<li>הסר את המחזירים ומקם מחדש את השרירים, הבלוטות והעור. תפרו את העור (6-0) ומרחו חומר חיטוי.</li>
	<li>נתקו את גשושית דופלר, ונתקו את המחזיק. לתפור ולחטא את העור של הראש.</li>
	<li>במהלך תקופת ההחלמה מהרדמה, השאירו את העכבר בכלוב המסופק עם תנור חימום כדי לשמור על הטמפרטורה. שמור אותו תחת השגחה מתמדת עד שהוא מתאושש לחלוטין מהרדמה. לאחר ההתאוששות, ניתן להחזיר את העכבר לכלוב שלו. הערה: דיור עם העשרה חברתית מומלץ מאוד. עם זאת, לעולם אל תערבבו עכברים המופעלים עם עכברים שאינם מופעלים באותו כלוב ללא כל הפרדה פיזית על מנת למנוע תוקפנות.</li>
</ol>4. טיפול לאחר הניתוח
<ol><li>מעת לעת לפקח על בעלי החיים בהתאם לנהלים ולתקנות שנקבעו על פי התקנות המקומיות. לספק טיפול משכך כאבים בלוח הזמנים המתאים כדי למזער את הכאב לאחר הניתוח. הערה: במחקר הנוכחי, אותו משכך כאבים יושם כמו בתחילת ההתערבות (Buprenorphine 0.05mg / kg BW) ב 6 שעות ו 24 שעות לאחר הניתוח.</li>
	<li>לבצע המתת חסד כאשר פרמטרי הפיקוח מצביעים על כך, בהתאם לפרוטוקולים המאושרים על ידי המוסד.</li>
	<li>מדי יום לפקח על המשקל של בעלי החיים. לספק מזון רך לבעלי החיים בימים הראשונים לאחר הניתוח. בנוסף, לחות אותם על ידי הזרקה תת עורית של מלוחים (200 μL) מיד לאחר הניתוח מעת לעת לאחר מכן אם הוא ציין כי העכבר אינו hydrate בכוחות עצמו. סדרו את המזון והמים בצורה שתהיה נגישה לבעל החיים.</li>
	<li>לאחר השלמת מחקר in vivo , הרדימו את העכברים, הרדימו אותם והוציאו את רקמת המוח לניתוח היסטופתולוגי נוסף (במידת הצורך).</li>
</ol>

מודל של איסכמיה מוחית חולפת על ידי חסימה של עורק מוחי אמצעי

<ol>
	<li>Siddiqi, A. Z., Wadhwa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+acute+stroke:+current+practices+and+future+horizons.">Treatment of acute stroke: current practices and future horizons.</a> Cardiovascular Revascularization Medicine. 49, 56-65 (2023).</li><li>Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+cerebral+ischemia+in+the+rat:+1.+Description+of+technique+and+early+neuropathological+consequences+following+middle+cerebral+artery+occlusion.">Focal cerebral ischemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 1, 53-60 (1981).</li><li>Koizumi, J., Nakazawa, T., Ooneda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+studies+of+ischemic+brain+edema.+A+new+experimental+model+of+cerebral+embolism+in+rats+in+which+recirculation+can+be+introduced+in+the+ischemic+area.">Experimental studies of ischemic brain edema. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area.</a> Japanese Journal of Stroke. 8, 1-8 (1986).</li><li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, R., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats.">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).</li><li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+ischemia:+Models,+methods,+and+outcomes.">Cerebral ischemia: Models, methods, and outcomes.</a> Neuropharmacology. 55, 257-270 (2008).</li><li>Seto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+ischemic+stroke+in+awake+freely+moving+mice+reveals+that+isoflurane+anesthesia+can+mask+the+benefits+of+a+neuroprotection+therapy.">Induction of ischemic stroke in awake freely moving mice reveals that isoflurane anesthesia can mask the benefits of a neuroprotection therapy.</a> Frontiers in Neuroenergetics. 6, 1 (2014).</li><li>D&#237;az-Marugan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poststroke+lung+infection+by+opportunistic+commensal+bacteria+is+not+mediated+by+their+expansion+in+the+gut+microbiota.">Poststroke lung infection by opportunistic commensal bacteria is not mediated by their expansion in the gut microbiota.</a> Stroke. 54 (7), 1875-1887 (2023).</li><li>Xie, L., Kang, H., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+model+of+transient+occlusion+of+the+middle+cerebral+artery+in+awake+mice.">A novel model of transient occlusion of the middle cerebral artery in awake mice.</a> Journal of Natural Sciences. 2 (2), e176 (2016).</li><li>Arbaizar-Rovirosa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aged+lipid-laden+microglia+display+impaired+responses+to+stroke.">Aged lipid-laden microglia display impaired responses to stroke.</a> EMBO Molecular Medicine. 15 (2), e17175 (2023).</li><li>Orsini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+mannose-binding+lectin+confers+long-lasting+protection+with+a+surprisingly+wide+therapeutic+window+in+cerebral+ischemia.">Targeting mannose-binding lectin confers long-lasting protection with a surprisingly wide therapeutic window in cerebral ischemia.</a> Circulation. 126 (12), 1484-1494 (2012).</li><li>Majid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+vulnerability+to+permanent+focal+cerebral+ischemia+among+3+common+mouse+strains.">Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains.</a> Stroke. 31, 2707-2714 (2000).</li><li>Rogers, D. C., Campbell, C. A., Stretton, J. L., Mackay, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+motor+impairment+and+infarct+volume+after+permanent+and+transient+middle+cerebral+artery+occlusion+in+the+rat.">Correlation between motor impairment and infarct volume after permanent and transient middle cerebral artery occlusion in the rat.</a> Stroke. 28, 2060-2065 (1997).</li><li>Hedna, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validity+of+Laser+Doppler+flowmetry+in+predicting+outcome+in+murine+intraluminal+middle+cerebral+artery+occlusion+stroke.">Validity of Laser Doppler flowmetry in predicting outcome in murine intraluminal middle cerebral artery occlusion stroke.</a> Journal of Vascular and Interventional Neurology. 8 (3), 74-82 (2015).</li><li>Yin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+speckle+contrast+imaging+for+blood+flow+monitoring+in+predicting+outcomes+after+cerebral+ischemia-reperfusion+injury+in+mice.">Laser speckle contrast imaging for blood flow monitoring in predicting outcomes after cerebral ischemia-reperfusion injury in mice.</a> BMC Neuroscience. 23, 80 (2022).</li><li>Thakkar, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+relevance+of+elevated+blood+pressure+after+ischemic+stroke+in+the+hypertensive+rats.">Therapeutic relevance of elevated blood pressure after ischemic stroke in the hypertensive rats.</a> Hypertension. 75 (3), 740-747 (2020).</li><li>Yu, X., Feng, Y., Liu, R., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermia+protects+mice+against+ischemic+stroke+by+modulating+macrophage+polarization+through+upregulation+of+interferon+regulatory+factor-4.">Hypothermia protects mice against ischemic stroke by modulating macrophage polarization through upregulation of interferon regulatory factor-4.</a> Journal of Inflammation Research. 14, 1271-1281 (2021).</li><li>Denorme, F., Portier, I., Kosaka, Y., Campbell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+exacerbates+ischemic+stroke+outcome+independent+of+platelet+glucose+uptake.">Hyperglycemia exacerbates ischemic stroke outcome independent of platelet glucose uptake.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 19, 536-546 (2021).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

הליך tMCAo intraluminal הוא המודל הנפוץ ביותר של איסכמיה מוחית מוקדית עם רפרפוזיה במחקר בסיסי. כיום, עכברים הם המודל המועדף על בעלי חיים בשל זמינותם של זנים מהונדסים גנטית. עם זאת, חיוני להכיר בכך שעכברים מהונדסים גנטית והרקע הגנטי שלהם יכולים להשפיע על כלי הדם במוח. נוכחות של זרימת בטחונות ואנסטומ...

שבץ מוחי הוא מחלה הרסנית המשפיעה על כ -15 מיליון אנשים ברחבי העולם מדי שנה, על פי ארגון הבריאות העולמי. כשליש מהחולים נכנעים למצב, ושליש נוסף חווים נכות לצמיתות. שבץ מוחי הוא פתולוגיה מורכבת המערבת סוגי תאים שונים, כגון תאי חיסון עצביים והיקפיים, כלי דם ותגובות מערכתיות1. הרשת המורכבת של תגובות המופעלות על ידי שבץ ברמת המערכות אינה ניתנת כיום לשכפול באמצעות מודלים במבחנה . לפיכך, מודלים ניסיוניים של בעלי חיים חיוניים כדי להתעמק במנגנוני המחלה ולפתח ולבחון טיפולים חדשים. נכון לעכשיו, פרפוזיה מוקדמת של רקמות היא ההתערבות המאושרת היחידה, או באמצעות פקקת עם מפעיל פלסמינוגן מסוג רקמה (tPA) או טרומבקטומיה אנדווסקולרית1.
חסימות של עורק המוח האמצעי (MCA) שכיחות בחולי שבץ. כתוצאה מכך, מודלים של מכרסמים של חסימת MCA חולפת (tMCAo) פותחו בתחילה בחולדות 2,3,4. כיום, עכברים מהונדסים גנטית הם בעלי החיים הנפוצים ביותר במודלים ניסיוניים של שבץ. במחקר זה אנו מתארים מודל זעיר פולשני של tMCAo תוך לומינלי בעכברים. הגישה מתבצעת דרך עורק התרדמה בגובה הצוואר, ללא כריתת גולגולת.
משך תקופת החסימה הוא גורם קריטי הקובע את היקף הנגע האיסכמי. אפילו חסימות קצרות של 10 דקות יכולות לגרום למוות עצבי סלקטיבי ללא אוטם נראה לעין, בעוד שחסימות ארוכות יותר, הנמשכות בדרך כלל 30 עד 60 דקות, גורמות למידה מסוימת של אוטם מוחי. שלא כמו הענפים הפרוקסימליים והדיסטליים של ה-MCA המספקים את קליפת המוח ויש להם בטחונות, העורקים הלנטיקולו-סטריאטליים המספקים דם לסטריאטום חסרים בטחונות5. כתוצאה מכך, יש ירידה גדולה יותר בזרימת הדם בסטריאטום מאשר בקליפת המוח לאחר tMCAo. לפיכך, חסימות של 30 דקות או פחות משפיעות בדרך כלל על הסטריאטום אך לא על קליפת המוח, בעוד שחסימות ארוכות יותר, מ-45 דקות ואילך, יוצרות לעתים קרובות נגע איסכמי בכל טריטוריית MCA, כולל הסטריאטום וקליפת המוח הגבית-צדית.
כדי להבטיח את רווחתם של העכברים, אנו מנהלים משככי כאבים לפני ההליך ומשתמשים בהרדמה במהלך הניתוח. עם זאת, הרדמה יכולה להציג שינויים מלאכותיים בפיזיולוגיה של העכבר ולהשפיע על כמה מדדי תוצאה6. ההתערבות הכירורגית, כאשר היא מבוצעת על ידי צוות מנוסה, נמשכת בדרך כלל כ -15 דקות להשראת MCAo. לאחר מכן, הזמן הכולל תחת הרדמה תלוי בתקופת החסימה. בניסויים בהם יש חשיבות מכרעת למזעור ההרדמה, שלב חלופי בהליך כרוך בהפסקת ההרדמה במהלך תקופת החסימה והגבלתה רק לשלבים הכירורגיים להחדרה והוצאה של חוט הלהט המסתיר את ה-MCA. גישה זו מפחיתה את משך ההרדמה וממזערת את ההשפעות המלאכותיות האפשריות שלה על מודל הניסוי 7,8. לכן, השיטה של גרימת איסכמיה מוקדית חולפת מוצגת על ידי חסימה intraluminal של MCA עם שתי גרסאות: עם העכבר מורדם במהלך כל תקופת חסימה או עם העכבר ער בתקופה זו. בכל מקרה, יש לבצע ניתוח דמה במקביל להתערבות המתבצעת בעכברים האיסכמיים. בנוסף, נתונים על הערכת תוצאות מסופקים כפי שנמדדו על ידי מבחנים התנהגותיים ו- MRI בנקודות זמן שונות לאחר רפרפוזיה. לבסוף, נדונים הגורמים העיקריים שיש לקחת בחשבון בעת יישום הליך הניסוי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6/0 suture&#160;</td>
			<td>Arago</td>
			<td></td>
			<td>Vascular ligatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6/0 suture with curved needle</td>
			<td>Arago</td>
			<td></td>
			<td>Skin sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 mg/mL Saline</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>CN616003 EC</td>
			<td>For hydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaesthesia system</td>
			<td>SurgiVet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt retractors, 1 mm wide</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18200-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorfine</td>
			<td>Buprex</td>
			<td></td>
			<td>For pain relief</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamp applying forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>S&#38;T CAF4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont mini forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>M3S 11200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91106-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td>To stick LDF probe to the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grip Strength Meter</td>
			<td>IITC Life Science Inc.</td>
			<td>#2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>B-Braun</td>
			<td>CN571105.8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDF Perimed</td>
			<td>Perimed</td>
			<td>Periflux System 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDF Probe Holders</td>
			<td>Perimed</td>
			<td>PH 07-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI magnet</td>
			<td>Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>BioSpec 70/30 horizontal animal scanner&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder with Suture Cutter</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon filament</td>
			<td>Doccol</td>
			<td>701912PK5Re</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery cage with heating pad</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sirgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91401-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small vessel cauterizer kit</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope and cold light</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture tying forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18025-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat, rectal probe and mouse pad</td>
			<td>Letica Science Instruments</td>
			<td>LE 13206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors (4mm cutting edge)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15019-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular clamps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00396-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient middle cerebral artery occlusion model of stroke

שבץ עומד כגורם עיקרי למוות או נכות כרונית ברחבי העולם. עם זאת, הטיפולים האופטימליים הקיימים מוגבלים לטיפולי רפרפוזיה בשלב החריף של שבץ איסכמי. כדי לקבל תובנות על הפיזיופתולוגיה של שבץ מוחי ולפתח גישות טיפוליות חדשניות, מודלים של מכרסמים in vivo של שבץ ממלאים תפקיד בסיסי. זמינותם של בעלי חיים מהונדסים גנטית הניעה במיוחד את השימוש בעכברים כמודלים ניסיוניים לשבץ.
בחולי שבץ, חסימה של עורק המוח האמצעי (MCA) היא תופעה שכיחה. כתוצאה מכך, המודל הניסיוני הנפוץ ביותר כולל חסימה תוך לומינלית של MCA, טכניקה זעיר פולשנית שאינה דורשת כריתת גולגולת. הליך זה כולל החדרת מונופילמנט דרך עורק התרדמה החיצוני (ECA) וקידומו דרך עורק התרדמה הפנימי (ICA) עד שהוא מגיע לנקודת ההסתעפות של MCA. לאחר חסימת עורקים של 45 דקות, המונופילמנט מוסר כדי לאפשר רפרפוזיה. לאורך כל התהליך, זרימת הדם במוח מנוטרת כדי לאשר את ההפחתה במהלך חסימה ולאחר מכן התאוששות עם זילוח. תוצאות נוירולוגיות ורקמות מוערכות באמצעות בדיקות התנהגותיות ומחקרי דימות תהודה מגנטית (MRI).

Stroke is a devastating disease that affects approximately 15 million people worldwide annually, according to the WHO. Around one-third of patients succumb to the condition, while another third experience permanent disability. Stroke is a complex pathology involving various cell types, such as neural and peripheral immune cells, vasculature, and systemic responses1. The intricate network of reactions triggered by stroke at the systems level cannot be currently replicated using in vitro models. Thus, experimental animal models are essential to delve into the disease&#39;s mechanisms and to develop and test new therapies. Currently, early tissue reperfusion is the only approved intervention, either through thrombolysis with tissue-type plasminogen activator (tPA) or endovascular thrombectomy1.
Occlusions of the middle cerebral artery (MCA) are frequent in stroke patients. Consequently, rodent models of transient MCA occlusion (tMCAo) were initially developed in rats2,3,4. Nowadays, genetically modified mice are the most commonly used animals in experimental stroke models. In this study, we describe a minimally invasive model of intraluminal tMCAo in mice. The approach is performed via the carotid artery at the neck level, without craniectomy.
The duration of the occlusion period is a critical factor that determines the extent of the ischemic lesion. Even short occlusions of 10 min can cause selective neuronal death without an apparent infarction, while longer occlusions, typically lasting 30 to 60 min, result in some degree of cerebral infarction. Unlike the proximal and distal branches of the MCA that supply the cortex and have collaterals, the lenticulo-striatal arteries providing blood to the striatum lack collaterals5. As a consequence, there is a greater reduction of blood flow in the striatum than in the cortex after tMCAo. Thus, occlusions of 30 min or less generally affect the striatum but not the cortex, whereas longer occlusions, from 45 min onwards, often generate an ischemic lesion in the entire MCA territory, including the striatum and dorsolateral cortex.
To ensure the well-being of the mice, we administer analgesics prior to the procedure and use anesthesia during surgery. Nevertheless, anesthesia can potentially introduce artificial alterations in the physiology of the mouse and affect some outcome measures6. The surgical intervention, when performed by experienced personnel, usually lasts about 15 min for inducing MCAo. Subsequently, the total time under anesthesia depends on the occlusion period. For experiments where minimizing anesthesia is crucial, an alternative step in the procedure involves discontinuing anesthesia during the occlusion period and limiting it only to the surgical steps for inserting and withdrawing the filament occluding the MCA. This approach reduces the duration of anesthesia and minimizes its potential artifactual effects on the experimental model7,8. Therefore, the method of inducing transient focal ischemia is presented by intraluminal occlusion of the MCA with two variants: with the mouse anesthetized during the entire occlusion period or with the mouse awake during this period. In either case, a sham surgery should be performed in parallel with the intervention carried out on the ischemic mice. Additionally, data on outcome assessment is provided as measured by behavioral tests and MRI at various time points after reperfusion. Finally, the main factors to consider when implementing the experimental procedure are discussed.

מחבר זרקור: הערכת נזק איסכמי לשבץ מוחי באמצעות מודל חסימת עורק המוח התיכון 

מודל חולף של חסימת עורק מוחי אמצעי חולף

The middle cerebral artery occlusion model is widely used to simulate ischemic stroke in mice. This model allows to investigate a temporal progression of ischemic damage, evaluate effectiveness of neuroprotective agents, and explore the role of specific genes and pathways in stroke pathology with a final aim of finding new potential treatments. The implementation of neuroimaging techniques such as MRI allows to make better diagnosis, improve the assessment of outcomes, and reduce the number of animals needed in each study.This protocol offers a clear and detailed explanation of the most commonly used technique for inducing transient middle cerebral artery occlusion. Moreover, it implements the technique by introducing the precision modification of anesthesia withdrawal during occlusion time, reducing the detrimental effect of prolonged anesthesia time.

ישנן גישות שונות להערכת התוצאה של הליך tMCAo. שיטות דימות מוחי In vivo (MRI) ובדיקות התנהגותיות משמשות כאן.
עכברים מפתחים נגעים איסכמיים במוח, המשפיעים בעיקר על השטח המסופק על ידי MCA ipsilateral לחסימה, כגון הסטריאטום וקליפת המוח הגבית. קיימות מספר שיטות לקביעת היקף הנגע, כולל צביעת ?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Ischemic Stroke Damage Through Middle Cerebral Artery Occlusion Model at JoVE.com

פרוטוקול זה מתאר את המודל של איסכמיה מוחית מוקדית חולפת בעכברים באמצעות חסימה תוך לומינלית של עורק המוח האמצעי. בנוסף, דוגמאות להערכת תוצאות מוצגות באמצעות הדמיית תהודה מגנטית ומבחני התנהגות.

Stroke stands as a major cause of death or chronic disability globally. Nevertheless, existing optimal treatments are limited to reperfusion therapies ...

מודל חסימת עורק המוח האמצעי נמצא בשימוש נרחב כדי לדמות שבץ איסכמי בעכברים. מודל זה מאפשר לחקור התקדמות זמנית של נזק איסכמי, להעריך את היעילות של סוכני נוירופרוטקציה, ולחקור את תפקידם של גנים ומסלולים ספציפיים בפתולוגיה של שבץ במטרה סופית למצוא טיפולים פוטנציאליים חדשים. יישום טכניקות דימות מוחי כגון MRI מאפשר לבצע אבחון טוב יותר, לשפר את הערכת התוצאות ולהפחית את מספר בעלי החיים הדרושים בכל מחקר.פרוטוקול זה מציע הסבר ברור ומפורט של הטכניקה הנפוצה ביותר לגרימת חסימת עורק מוחי אמצעי חולף. יתר על כן, הוא מיישם את הטכניקה על ידי הצגת שינוי מדויק של נסיגה הרדמה במהלך זמן החסימה, הפחתת ההשפעה המזיקה של זמן הרדמה ממושך.

transient-middle-cerebral-artery-occlusion-model-of-stroke

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Stroke

1.2K Views.  Spanish National Research Council (CSIC). מודל חסימת עורק המוח האמצעי נמצא בשימוש נרחב כדי לדמות שבץ איסכמי בעכברים. מודל זה מאפשר לחקור התקדמות זמנית של נזק איסכמי, להעריך את היעילות של סוכני נוירופרוטקציה, ולחקור את תפקידם של גנים ומסלולים ספציפיים בפתולוגיה של שבץ במטרה סופית למצוא טיפולים פוטנציאליים חדשים. י?...

Video: מחבר זרקור: הערכת נזק איסכמי לשבץ מוחי באמצעות מודל חסימת עורק המוח התיכון 

Stroke stands as a major cause of death or chronic disability globally. Nevertheless, existing optimal treatments are limited to reperfusion therapies during the acute phase of ischemic stroke. To gain insights into stroke physiopathology and develop innovative therapeutic approaches, in vivo rodent models of stroke play a fundamental role. The availability of genetically modified animals has particularly propelled the use of mice as experimental stroke models.
In stroke patients, occlusion of the middle cerebral artery (MCA) is a common occurrence. Consequently, the most prevalent experimental model involves intraluminal occlusion of the MCA, a minimally invasive technique that doesn't require craniectomy. This procedure involves inserting a monofilament through the external carotid artery (ECA) and advancing it through the internal carotid artery (ICA) until it reaches the branching point of the MCA. After a 45 min arterial occlusion, the monofilament is removed to allow reperfusion. Throughout the process, cerebral blood flow is monitored to confirm the reduction during occlusion and subsequent recovery upon reperfusion. Neurological and tissue outcomes are evaluated using behavioral tests and magnetic resonance imaging (MRI) studies.

This protocol describes the model of transient focal cerebral ischemia in mice through intraluminal occlusion of the middle cerebral artery. Additionally, examples of outcome assessment are shown using magnetic resonance imaging and behavioral tests.

Surgical Procedure for Transient Middle Cerebral Artery Occlusion

To begin, position the anesthetized mouse on the operating table. Maintain body temperature using a rectal probe connected to a heating pad. Make an incision on the skin of the head in the direction of the sagittal suture, starting from the ears to the area between the eyes.Retract the skin and remove the periosteum on the right side of the skull. Then find the coordinates, 2.5 millimeters lateral from bregma. Apply cyanoacrylate to the doppler holder and attach it for laser-doppler flowmetry.After the glue has dried, connect the doppler probe. Then, check for the correct signal readout for assessing the cerebral blood flow. To perform artery occlusion, turn the mouse over to the supine position and fix it to the surgical table with medical tape.Then make a midline incision on the neck. Pull the skin laterally, followed by pulling away the salivary glands using retractors. This exposes the carotid territory.Identify the vascular anatomy of the common carotid artery, or CCA, the ICA, and the ECA, as well as the different arteries derived from them. For easier handling, detach CCA, followed by ECA from the connective tissue. Then cauterize the superior thyroid artery and detach ICA from the connective tissue.Check again to make sure the main arteries are fully detached from the connective tissue. Next, wrap 6-0 silk sutures around the ECA at the maxillary lingual bifurcation. Then suture around the CCA.Place a vascular clip interrupting blood circulation from the ICA. Make a small incision in the ECA close to the area where the tight knot is located. Insert the monofilament until the thick coating has completely entered the arterial lumen.Tighten the second knot to hold the monofilament inside the artery and to prevent the pressure exerted by the blood from pushing it out. Cut the ECA below the first knot and rotate the stump to orient it in the direction of the ICA. Advance the monofilament via the ICA until the point where the MCA branches out.The occlusion is reflected in an abrupt blood flow drop in the LDF readout. After 40 minutes, anesthetize the mouse again and place it back on the surgical table. Remove the stitches from the neck.After 45 minutes of occlusion, loosen the knot holding the monofilament in place. Pull slowly and gently on the filament and check that tissue recanalization occurs. Then pull out the filament and tighten the knot to prevent blood loss, clean the blood and untie the CCA knot.Ensure that there is no arterial wall damage. Remove the retractors and reposition the muscles, glands, and skin. Suture the skin using a 6-0 suture and apply disinfectant.Disconnect the Doppler probe and detach the holder. Finally, suture and disinfect the skin of the head. The outcome of the transient middle cerebral artery occlusion procedure was evaluated using in-vivo MRI neuroimaging.Lesion evolution assessed at different time points after reperfusion showed that progression of the lesion volume takes approximately two days to complete. Behavioral tests, such as grip strength test, showed a loss of strength in mice after 24 hours of transient middle cerebral artery occlusion. Also, upon stimulation in the corner test, the mice showed a preference to turn to the right side, which was ipsilateral to the lesion, indicating a successful middle cerebral artery occlusion on the right side.