המחקר נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81960226,81760223); הקרן למדעי הטבע של מחוז יונאן (202001AS070045,202301AY070001-011)

פרוטוקול הניסוי אושר על ידי ועדת האתיקה והשימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית של קונמינג (kmmu20220945). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בחולדות Sprague-Dawley (SD) משני המינים, 300-350 גרם.
1. השראת מודל SAH
<ol><li>מרדימים את החולדות באמצעות 2% איזופלורן ו-100% חמצן. לשמור על הרדמה על ידי אספקת הרדמה רציפה עם איזופלורן (1%-3%). אבטחו את ראש החולדה באמצעות מנגנון סטריאוטקסי (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>צור את מודל SAH לפי השלבים הבאים.<ol><li>הכנס מחט מיקרו-הזרקה לבור המים העל-סלרי. לאחר מכן, הזריקו דם אוטולוגי מעורק הזנב של החולדה (ללא נוגדי קרישה) לבור המים העל-סלרי באמצעות משאבת מזרק (ראו טבלת חומרים).</li>
		<li>להשתיל מחט microinjection לתוך החדר המוחי לרוחב ימין באמצעות הקואורדינטות שהוזכרו: bregma, −0.8 מ"מ; לרוחב, 1.4 מ"מ; עומק, 4 מ"מ9. עבור קבוצות SAH, להזריק 0.2 מ"ל של דם עורק זנב חולדה. עבור קבוצות דמה, יש לתת את אותו נפח של מי מלח איזוטוניים (איור 1A).</li>
	</ol></li>
</ol>2. הכנת פרוסת המוח וייצוב
<ol><li>מרדימים עמוקות את החולדות באמצעות שאיפת איזופלורן 2%. לאחר עריפת הראש, חלצו את כל המוחות וטבלו אותם בנוזל מוחי מלאכותי קר כקרח (ACSF). הערה: השתמש בפתרונות ACSF טריים שהוכנו עם ההרכב הבא: 134 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 29 mM NaHCO3, 1.1 mM NaH 2 PO 4, 1.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2ו- 10.11 mM D-Glucose (ראה טבלת חומרים). שמור על pH בין 7.3 ל 7.4.</li>
	<li>השתמשו בוויברטום (ראו טבלת חומרים) כדי להכין פרוסות מוח חריפות בעובי של 200 מיקרומטר מחולדות SD ב-ACSF קר כקרח שמאוורר עם 5% CO 2 ו-95% O 2 (איור 2).</li>
	<li>הניחו את פרוסות המוח החריפות בעובי 200 מיקרומטר בתא אחסון על רשת ניילון שקועה ב-ACSF. אזנו את תמיסת ACSF עם 95% O 2 ו-5% CO2, תוך שמירה על טווח טמפרטורות של 35-37°C. אפשרו לפרוסות המוח להתייצב במשך שעתיים, מה שנתן להן זמן להסתגל (איור 3).</li>
</ol>3. תיוג פריציטים בפרוסות מוח חריפות עם TO-PRO-3
הערה: פריציטים מפרוסות מוח חריפות סומנו באופן פלואורסצנטי באמצעות נותב TO-PRO-310.
<ol><li>הוסיפו את הצבע הפלואורסצנטי TO-PRO-3 ל-ACSF והגיעו לריכוז סופי של 1 מיקרומטר. דגרו על פרוסות המוח החריפות בטמפרטורת החדר בסביבה חשוכה עם ACSF המכיל TO-PRO-3 למשך 20 דקות. הערה: זכור ללבוש כפפות לטקס בעת הטיפול ב-TO-PRO-3 להגנה.</li>
	<li>מעבירים את מסננת רשת הניילון, הנושאת את פרוסות המוח, מתא ההעמסה לתא שטיפת צלחות בעל 6 בארות (ראו טבלת חומרים). אפשרו לפרוסות המוח להישאר בתא השטיפה במשך 10 דקות (איור 4D). הערה: שלב שטיפה זה מסיים את תהליך הצביעה, מפחית את תיוג הרקע ומונע כתמים לא ספציפיים.</li>
	<li>שטפו את התכשירים במשך 15 דקות בסך הכל באמצעות תמיסת ACSF המאוזנת לתערובת של 5% CO 2 ו-95% O2. שלב השטיפה הזה עוצר את ספיגת הצבע וממזער את תיוג הרקע (איור 4C).</li>
</ol>4. צביעת פריציטים לא חיוניים של microcirculation מוחי בפרוסות מוח חריפה
<ol><li>דגרו פרוסות מוח טעונות מראש ב-TO-PRO-3 בטמפרטורה של 37°C עם איזולקטין B4 מצומד ל-Alexa Fluor 488 (FITC-ISOB4; 5 מיקרוגרם/מ"ל, ראו טבלת חומרים) למשך 30 דקות בסביבה חשוכה. לאחר הדגירה, שטפו את פרוסות המוח במשך 15 דקות ב-ACSF (איור 4E).</li>
	<li>לדגור על פרוסות המוח בגז ACSF עם 5% CO 2 ו 95% O2 כרגיל. הוסף פרופידיום יודיד (PI) בריכוז של 37 מיקרומטר לשתי התמיסות ב 37 ° C. זה יתייג פריציטים במוח שאינם חיוניים. דגרו על התכשירים בתמיסת ACSF זו במשך 60 דקות בחושך (איור 4F).</li>
	<li>לאחר מכן, שטפו את התכשירים במשך 15 דקות עם תמיסות ACSF כדי לעצור את ספיגת הצבע ולמזער את תיוג הרקע.</li>
</ol>5. הדמיה של פריציטים חיוניים ולא חיוניים במוח בפרוסות מוח חריפות
<ol><li>מעבירים בעדינות פרוסות מוח לכלים קונפוקליים בתחתית זכוכית (ראו טבלת חומרים) בעזרת פיפטות פלסטיק של פסטר. מלאו את הכלים בתמיסת ACSF ששוותה בעבר עם 5% CO 2 ו-95% O2. השתמשו ברשת ברזל כדי לאבטח פרוסות מוח של חולדות במקומן.</li>
	<li>מעבירים את הכלים הקונפוקליים בתחתית הזכוכית לשלב של מיקרוסקופ קונפוקלי. מקמו את פרוסת המוח החריפה בתחתית הצלחתונתלו 9 אותה בתמיסת ACSF המאוזנת לתערובת של 95% O2 ו-5%CO2 במהלך דימות מיקרוסקופ קונפוקלי (איור 5A ואיור 5Ab).</li>
	<li>דמיינו את תאי הקיר של כלי הדם בקליפת המוח באמצעות מטרה של פי 40. לכוד אוספי תמונות באמצעות תוכנה תואמת (ראה רשימת חומרים). השתמש במסננים מתאימים עבור IB4 (עירור/פליטה 460 ננומטר/520 ננומטר), PI (עירור/פליטה 545 ננומטר/595 ננומטר) ו-TO-PRO-3 (עירור/פליטה 606 ננומטר/666 ננומטר) (איור 5D). הערה: צלם תמונות עם הפרטים הבאים: 40× DIC N1 עדשה אובייקטיבית, 3 × 12 סיביות: 512 × 512 פיקסלים (0.22 × 0.22 מ"מ), כיול: 0.42 מיקרומטר/פיקסלים.</li>
	<li>לזהות microvasculature מוחי ו pericytes מבוסס על הרשת שלהם ואת המורפולוגיה. אתר אזור ספציפי המכיל רשת כלי דם מוחיים על כל פרוסת מוח וצלם תמונות.</li>
	<li>שימו לב בזהירות למיקום ההדמיה כדי להבטיח עקביות בלכידות הבאות (איור 5B,C). לעיבוד וניתוח נוספים, השתמש בתוכנה לניתוח תמונות (ImageJ) ובתוכנה לעריכת תמונות (ראה טבלת חומרים).</li>
</ol>

הדמיה של התכווצות פריציטים במוח לאחר דימום subarachnoid

<ol>
	<li>Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+microvascular+pericytes+in+health+and+disease.">Brain microvascular pericytes in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).</li><li>Dore-Duffy, P., Cleary, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+properties+of+pericytes.">Morphology and properties of pericytes.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 686, 49-68 (2011).</li><li>Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+control+of+CNS+capillary+diameter+by+pericytes.">Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes.</a> Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).</li><li>Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+a+pericyte.">What is a pericyte.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 451-455 (2016).</li><li>Yemisci, M., Gursoy-Ozdemir, Y., Vural, A., Can, A., Topalkara, K., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericyte+contraction+induced+by+oxidative-nitrative+stress+impairs+capillary+reflow+despite+successful+opening+of+an+occluded+cerebral+artery.">Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery.</a> Nature Medicine. 15 (9), 1031-1037 (2009).</li><li>Korte, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenaline+released+from+locus+coeruleus+axons+contracts+cerebral+capillary+pericytes+via+&#945;2+adrenergic+receptors.">Noradrenaline released from locus coeruleus axons contracts cerebral capillary pericytes via &#945;2 adrenergic receptors.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2023).</li><li>Hirunpattarasilp, C., Barkaway, A., Davis, H., Pfeiffer, T., Sethi, H., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperoxia+evokes+pericyte-mediated+capillary+constriction.">Hyperoxia evokes pericyte-mediated capillary constriction.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 42 (11), 2032-2047 (2022).</li><li>Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+study+pericyte+contractility+and+responses+to+ischaemia+in+vitro+using+electrical+impedance.">Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+TRPM4+Activity+in+cerebral+artery+myocytes+contributes+to+cerebral+blood+flow+reduction+after+subarachnoid+hemorrhage+in+rats.">Increased TRPM4 Activity in cerebral artery myocytes contributes to cerebral blood flow reduction after subarachnoid hemorrhage in rats.</a> Neurotherapeutics: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 16 (3), 901-911 (2019).</li><li>Mai-Morente, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericyte+mapping+in+cerebral+slices+with+the+far-red+fluorophore+TO-PRO-3.">Pericyte mapping in cerebral slices with the far-red fluorophore TO-PRO-3.</a> Bio-protocol. 11 (22), e4222 (2021).</li><li>Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+fluorescent+dye+identifies+pericytes+at+the+neurovascular+unit.">A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit.</a> Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationale+for+the+real-time+and+dynamic+cell+death+assays+using+propidium+iodide.">Rationale for the real-time and dynamic cell death assays using propidium iodide.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (4), 399-405 (2010).</li><li>Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TO-PRO-3+iodide:+A+novel+HeNe+laser-excitable+DNA+stain+as+an+alternative+for+propidium+iodide+in+multiparameter+flow+cytometry.">TO-PRO-3 iodide: A novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry.</a> Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).</li><li>Lacar, B., Herman, P., Platel, J. C., Kubera, C., Hyder, F., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+progenitor+cells+regulate+capillary+blood+flow+in+the+postnatal+subventricular+zone.">Neural progenitor cells regulate capillary blood flow in the postnatal subventricular zone.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (46), 16435-16448 (2012).</li><li>Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+fluorescent+dye+identifies+pericytes+at+the+neurovascular+unit.">A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit.</a> Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).</li><li>Hezel, M., Ebrahimi, F., Koch, M., Dehghani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propidium+iodide+staining:+a+new+application+in+fluorescence+microscopy+for+analysis+of+cytoarchitecture+in+adult+and+developing+rodent+brain.">Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain.</a> Micron (Oxford, England). 43 (10), 1031-1038 (2012).</li><li>Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perivascular+astroglial+sheath+provides+a+complete+covering+of+the+brain+microvessels:+An+electron+microscopic+3D+reconstruction.">The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: An electron microscopic 3D reconstruction.</a> Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

פותחו טכניקות הדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה להדמיית פריציטים חיוניים במוח, פריציטים לא חיוניים במוח והמיקרו-כלי דם בפרוסות מוח. בפרוסות מוח חריפות של חולדות, התהליך כרוך בתיוג ראשוני של פריציטים עם TO-PRO-311, ואחריו תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים עם IB412; לאחר מכן, זיהו...

פריציטים במוח, המובחנים על ידי הבליטות הדקות שלהם וגופי התא הבולטים, מקיפים את microcirculation 1,2. בעוד שהגברת זרימת הדם במוח מונעת בעיקר על ידי התרחבות נימית, עורקים קטנים יותר מציגים קצב התרחבות איטי יותר3. התכווצות פריציטים משפיעה על קוטר הנימים ועל המורפולוגיה של הפריציטים, ומשפיעה על דינמיקת כלי הדם4. התכווצות של פריציטים במוח מובילה להתכווצות נימית, ובתרחישים פתולוגיים, התכווצות יתר עלולה לעכב את זרימת אריתרוציטים5. גורמים שונים, כולל נוראפינפרין המשתחרר מהלוקוס קורולוס, יכולים לגרום להתכווצות פריציטים במוח בתוך נימים6. עם תפקיד מווסת בזרימת הדם במוח, פריציטים מציגים סינתזת 20-HETE, ומשמשים כחיישן חמצן במהלך היפראוקסיה7. התכווצות המופעלת על ידי מתח חמצוני-חנקני של פריציטים במוח משפיעה לרעה על נימים5. למרות מחקרי in vivo ו-ex vivo על התכווצות פריציטים במוח8, קיים ידע מוגבל בנוגע לדימות של פריציטים מוחיים בני קיימא ובלתי ברי קיימא בתוך פרוסות מוח.
באופן מכריע, דימות לאחר קיבוע רקמות של פריציטים במוח פוגע בחיוניותם ובהערכת ההתכווצות שלאחר מכן. יתר על כן, בתרחישים כגון הפרעות נוירולוגיות (למשל, דימום תת-עכבישי - SAH), תיוג מהונדס של פריציטים במוח אינו מצליח להבדיל בין פריציטים ברי קיימא ושאינם בני קיימא, כפי שאושר במחקר המוות הראשוני שלנו של פריציטים במוח הנגרם על ידי SAH9. 
כדי להתגבר על אתגרים אלה, השתמשנו ב-TO-PRO-3 כדי לתייג פריציטים חיים, בעוד שהמתים הוכתמו בפרופידיום יודיד (PI). השתמשנו בטכנולוגיות דימות קונפוקלי ברזולוציה גבוהה כדי להמחיש פריציטים חיים ולא בני קיימא במוח בפרוסות מוח, תוך שמירה על פעילות הפרוסות במהלך ההדמיה. מאמר זה נועד להציג שיטה הניתנת לשחזור לדימות פריציטים ברי קיימא ושאינם בני קיימא במוח בפרוסות מוח, המשמשת ככלי רב ערך לחקירת ההשפעה של פריציטים במוח על מיקרו-סירקולציה מוחית לאחר SAH.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>ABC biochemistry</td>
			<td>ABC703006</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Adobe Illustrator CS6 16.0.0</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>MIAOJIE</td>
			<td>225 mm x 273 mm</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-Elements 4.10.00</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N-SIM/C2si</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas tank (5% CO2, 95% O2)</td>
			<td>PENGYIDA</td>
			<td>40L</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Confocal Dishes</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FCFC020-10pcs</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td>EVOBOND</td>
			<td>KH-502</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice machine</td>
			<td>XUEKE</td>
			<td>IMS-20</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Image J</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhalation anesthesia system</td>
			<td>SCIENCE</td>
			<td>QAF700</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin B 4-FITC</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L2895&#8211;2MG</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7447&#8211;40&#8211;7</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647&#8211;14&#8211;5</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10049&#8211;21&#8211;5</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>NEST Biotechnology</td>
			<td>318314</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Scientific Industries Inc</td>
			<td>Model 203</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium (Iodide)</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>HY-D0815/CS-7538</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic apparatus</td>
			<td>SCIENCE</td>
			<td>QA</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard PUMP</td>
			<td>PUMP 11 ELITE Nanomite</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic water bath</td>
			<td>OLABO</td>
			<td>HH-2</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging vital and non-vital brain pericytes in brain slices following subarachnoid hemorrhage

פריציטים הם תאי קיר חיוניים הממוקמים בתוך מיקרוסירקולציה מוחית, חיוניים בוויסות פעיל של זרימת הדם במוח באמצעות התאמות התכווצות. באופן קונבנציונלי, ההתכווצות שלהם נמדדת על ידי התבוננות בתזוזות מורפולוגיות ושינויים בקוטר הנימים הסמוכים בנסיבות ספציפיות. עם זאת, קיבוע לאחר רקמות, הערכת חיוניות והתכווצות פריציטים כתוצאה מכך של פריציטים במוח המודמיים נפגעים. באופן דומה, תיוג גנטי של פריציטים במוח אינו מבחין בין פריציטים בני קיימא ושאינם בני קיימא, במיוחד במצבים נוירולוגיים כמו דימום תת-עכבישי (SAH), שם החקירה הראשונית שלנו מאמתת את מותו של פריציטים במוח. פרוטוקול אמין פותח כדי להתגבר על אילוצים אלה, המאפשר תיוג פלואורסצנטי בו זמנית של פריציטים במוח תפקודיים ולא פונקציונליים באזורי מוח. שיטת תיוג זו מאפשרת הדמיה של מיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה, ובו זמנית מסמנת את פרוסת המוח microvasculature. פרוטוקול חדשני זה מציע אמצעי להערכת התכווצות הפריציטים במוח, השפעתה על קוטר הנימים ומבנה הפריציטים. חקירת התכווצות פריציטים במוח בהקשר SAH מניבה הבנה מעמיקה של השפעותיה על מיקרו-סירקולציה מוחית.

Brain pericytes, distinguished by their slender protuberances and protruding cell bodies, encircle the microcirculation1,2. While cerebral blood flow augmentation is predominantly driven by capillary dilation, smaller arteries exhibit slower rates of dilation3. Pericyte contractility exerts influence over capillary diameter and pericyte morphology, impacting vascular dynamics4. Contraction of brain pericytes leads to capillary constriction, and in pathological scenarios, excessive contraction may impede erythrocyte flow5. Various factors, including norepinephrine released from the locus coeruleus, can induce brain pericyte contraction within capillaries6. With a regulatory role in cerebral blood flow, pericytes exhibit 20-HETE synthesis, serving as an oxygen sensor during hyperoxia7. Oxidative-nitrative stress-triggered contraction of brain pericytes detrimentally affects capillaries5. Despite both in vivo and ex vivo investigations into brain pericyte contraction8, limited knowledge persists regarding the imaging of viable and non-viable brain pericytes within brain slices.
Crucially, post-tissue fixation imaging of brain pericytes compromises their vitality and subsequent contractility assessment. Moreover, in scenarios such as neurological disorders (e.g., subarachnoid hemorrhage - SAH), transgenic labeling of brain pericytes fails to differentiate between viable and non-viable pericytes, as confirmed by our preliminary SAH-induced brain pericyte death study9. 
To surmount these challenges, we employed TO-PRO-3 to label live pericytes, while deceased ones were stained with propidium iodide (PI). We used high-resolution confocal imaging technologies to visualize viable and non-viable brain pericytes in brain slices while preserving slice activity during imaging. This article aims to present a reproducible method for imaging viable and non-viable brain pericytes in brain slices, serving as a valuable tool to probe the impact of brain pericytes on cerebral microcirculation post SAH.

מחבר זרקור: הדמיה Pericytes לאחר דימום subarachnoid במכרסמים 

הדמיה של פריציטים חיוניים ולא חיוניים במוח בפרוסות מוח לאחר דימום תת-עכבישי

Our study showed a significant increase in pericytes deaths. So starting at a sick horse after SAH, it demonstrated a positive correlation between the number of low vital parasites and the time elapsed after SAH. Imaging vital and the non-vital brain parasites in brain slices following SAH and the parasite isolation techniques, have advanced the research in my field.Currently, it's quite difficult to fully distinguish between dead parasites and dead endothelial cells. Our study find contraction-dependent apoptosis in parasites after SAH. We have developed a very reliable protocol, which enables the fluorescent labeling, both functional and a non-functional brain parasite in brain sections, and the same time.

בתנאים פיזיולוגיים רגילים, פריציטים במוח בדרך כלל אינם עוברים מוות תאי. איור 6 ממחיש את התופעה הזו, כאשר צהוב מציין נוכחות של פריציטים חיוניים במוח; פריציטים במוח אינם מראים כתמים עם PI, מה שמצביע על יכולת הקיום שלהם. כדי להמשיך ולחקור אם פריציטים נשארים מחוברים לכלי הדם הזעי...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Pericytes Post-Subarachnoid Hemorrhaging in Rodents at JoVE.com

החקירה הראשונית מאשרת כי דימום תת-עכבישי (SAH) גורם למוות של פריציטים במוח. הערכת התכווצות פריציטים לאחר SAH דורשת הבחנה בין פריציטים חיים ולא קיימא במוח. לפיכך, פותח הליך לסימון פריציטים במוח בני קיימא ושאינם בני קיימא בו זמנית בקטעי מוח, מה שמקל על תצפית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה.

Pericytes are crucial mural cells situated within cerebral microcirculation, pivotal in actively modulating cerebral blood flow via contractility ...

המחקר שלנו הראה עלייה משמעותית בתמותת פריציטים. לכן, החל מסוס חולה לאחר SAH, הוא הראה מתאם חיובי בין מספר הטפילים החיוניים הנמוך לבין הזמן שחלף לאחר SAH. הדמיה חיונית וטפילי מוח לא חיוניים בפרוסות מוח בעקבות SAH וטכניקות בידוד הטפילים, קידמו את המחקר בתחום שלי.כיום, די קשה להבחין באופן מלא בין טפילים מתים לבין תאי אנדותל מתים. המחקר שלנו מצא אפופטוזיס תלוי התכווצות בטפילים לאחר SAH. פיתחנו פרוטוקול אמין מאוד, שמאפשר תיוג פלואורסצנטי, גם טפיל מוח תפקודי וגם טפיל מוח לא מתפקד במקטעי מוח, ובאותו הזמן.

imaging-vital-non-vital-brain-pericytes-brain-slices-following

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Vital and Non-vital Brain Pericytes in Brain Slices following Subarachnoid Hemorrhage

703 Views.  The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University. המחקר שלנו הראה עלייה משמעותית בתמותת פריציטים. לכן, החל מסוס חולה לאחר SAH, הוא הראה מתאם חיובי בין מספר הטפילים החיוניים הנמוך לבין הזמן שחלף לאחר SAH. הדמיה חיונית וטפילי מוח לא חיוניים בפרוסות מוח בעקבות SAH וטכניקות בידוד הטפילים, קידמו את המחקר בתחום שלי.כיום, די קשה לה?...

Video: מחבר זרקור: הדמיה Pericytes לאחר דימום subarachnoid במכרסמים 

Pericytes are crucial mural cells situated within cerebral microcirculation, pivotal in actively modulating cerebral blood flow via contractility adjustments. Conventionally, their contractility is gauged by observing morphological shifts and nearby capillary diameter changes under specific circumstances. Yet, post-tissue fixation, evaluating vitality and ensuing pericyte contractility of imaged brain pericytes becomes compromised. Similarly, genetically labeling brain pericytes falls short in distinguishing between viable and non-viable pericytes, particularly in neurologic conditions like subarachnoid hemorrhage (SAH), where our preliminary investigation validates brain pericyte demise. A reliable protocol has been devised to surmount these constraints, enabling simultaneous fluorescent tagging of both functional and non-functional brain pericytes in brain sections. This labeling method allows high-resolution confocal microscope visualization, concurrently marking the brain slice microvasculature. This innovative protocol offers a means to appraise brain pericyte contractility, its impact on capillary diameter, and pericyte structure. Investigating brain pericyte contractility within the SAH context yields insightful comprehension of its effects on cerebral microcirculation.

The preliminary inquiry confirms that subarachnoid hemorrhage (SAH) causes brain pericyte demise. Evaluating pericyte contractility post-SAH requires differentiation between viable and non-viable brain pericytes. Hence, a procedure has been developed to label viable and non-viable brain pericytes concurrently in brain sections, facilitating observation using a high-resolution confocal microscope.

Induction of the Murine Subarachnoid Hemorrhage Model and Brain Slice Preparation for Fluorescent Imaging

To create the subarachnoid hemorrhage, or SAH model, insert a microinjection needle into an anesthetized rat's suprasellar cistern. With a syringe pump, inject autologous blood acquired from the rat's tail artery into the suprasellar cistern. Now implant another needle into the right lateral cerebral ventricle at the given coordinates.For the SAH models, inject 0.2 milliliters of rat tail artery blood. For the SHAM groups, inject the same volume of isotonic saline. After decapitation, extract the rat's entire brain and submerge them in ice cold artificial cerebral spinal fluid or ACSF.With a vibratome, prepare acute brain slices of 200 micrometers and ice cold equilibrated ACSF. Place the brain slices on a nylon mesh, immersed in equilibrated ACSF in a storage chamber at 35 to 37 degrees Celsius.

השראת מודל הדימום התת-עכבישי של מורין והכנת פרוסת המוח להדמיית פלורסנט

Labeling and Staining Rat Brain Pericytes for Fluorescent Imaging

To label the pericytes, add the fluorescent dye TO-PRO-3 to the artificial cerebral spinal fluid or ACSF. Now incubate the freshly sliced rat brain in the dye-laden ACSF for 20 minutes in a dark environment at room temperature. Next, transfer the nylon mesh strainer with the brain slices to a six-well plate rinsing chamber.Let the brain slices rest in the chamber for 10 minutes. To label the non-vital pericytes, incubate the TO-PRO-3 tagged brain slices in conjugated isolectin B4 at 37 degrees Celsius for 30 minutes in the dark. After incubation, rinse the brain slices in artificial cerebral spinal fluid for 15 minutes.Next, place the brain slices in ACSF gassed with 5%carbon dioxide and 95%oxygen. To this, add propidium iodide at a concentration of 37 micromolar at 37 degrees Celsius. To halt the dye uptake and minimize the background labeling, rinse the preparations for 15 minutes in ACSF.Under normal physiological conditions, brain pericytes do not experience cell death. Viable pericytes that were not stained with propidium iodide were detected. The SAH models should vital pericytes within microvasculature.Non-vital pericytes were also detected. Propidium iodide-labeled non-vital pericytes remained attached to the entire microvasculature.

תיוג והכתמה של פריציטים במוח של חולדות לצורך הדמיה פלואורסצנטית

Confocal Imaging of Vital and Non-Vital Pericytes in Rat Acute Brain Slices

To begin, use a plastic Pasteur pipette to gently transfer the fluorescently stained brain slices to glass bottom confocal dishes. Fill these dishes with equilibrated ACSF. With an iron mesh, secure the rat brain slices in place.Next, place the glass bottom confocal dishes onto the stage of a confocal microscope. Position the acute brain slice at the bottom of the dish and perfuse with equilibrating ACSF during imaging. Using the 40X objective, view the wall cells of the cerebral cortical microvasculature.Next, use compatible software to capture image stacks. Identify cerebral microvasculature and pericytes based on their network and morphology, then locate a specific region containing a cerebral microvasculature network on each brain slice and capture images. Under normal physiological conditions, brain pericytes do not experience cell death.Viable pericytes that were not stained with propidium iodide were detected. The SAH models showed vital pericytes within microvasculature. Non-vital pericytes were also detected.Propidium iodide labeled non-vital pericytes"remained detached to the entire microvasculature.