تم دعم الدراسة بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81960226,81760223); مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة يوننان (202001AS070045،202301AY070001-011)

تمت الموافقة على البروتوكول التجريبي من قبل لجنة أخلاقيات واستخدام بجامعة كونمينغ الطبية (kmmu20220945). تم استخدام فئران Sprague-Dawley (SD) من كلا الجنسين ، 300-350 جم ، في هذه الدراسة.
1. تحفيز نموذج SAH
<ol><li>تخدير الفئران باستخدام 2٪ إيزوفلوران و 100٪ أكسجين. الحفاظ على التخدير عن طريق توفير التخدير المستمر بالاستنشاق مع الأيزوفلوران (1٪ -3٪). تأمين رأس الجرذ باستخدام جهاز تجسيمي (انظر جدول المواد).</li>
	<li>قم بإنشاء نموذج SAH باتباع الخطوات أدناه.<ol><li>أدخل إبرة الحقن المجهري في الصهريج فوق السيلار. بعد ذلك ، قم بحقن الدم الذاتي من شريان ذيل الفئران (بدون مضادات التخثر) في الخزان فوق السيلار باستخدام مضخة حقنة (انظر جدول المواد).</li>
		<li>زرع إبرة حقن مجهري في البطين الدماغي الجانبي الأيمن باستخدام الإحداثيات المذكورة: bregma ، −0.8 مم ؛ جانبي ، 1.4 مم ؛ العمق ، 4 مم9. بالنسبة لمجموعات SAH ، قم بحقن 0.2 مل من دم شريان ذيل الفئران. بالنسبة للمجموعات الوهمية ، يتم تطبيق نفس الحجم من محلول ملحي متساوي التوتر (الشكل 1 أ).</li>
	</ol></li>
</ol>2. إعداد شريحة الدماغ وتحقيق الاستقرار
<ol><li>تخدير الفئران بعمق باستخدام استنشاق إيزوفلوران 2٪. بعد قطع الرأس ، استخرج الأدمغة بأكملها واغمرها في السائل النخاعي الاصطناعي المثلج (ACSF). ملاحظة: استخدم محاليل ACSF المحضرة حديثا بالتركيب التالي: 134 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 2.8 مللي مول KCl ، 29 مللي متر NaHCO3 ، 1.1 مللي متر NaH 2 PO 4 ، 1.5 mM MgSO4 ، 2.5 mM CaCl2 ، و 10.11 mM D-Glucose (انظر جدول المواد). الحفاظ على درجة الحموضة بين 7.3 و 7.4.</li>
	<li>استخدم اهتزازا (انظر جدول المواد) لتحضير شرائح الدماغ الحادة بسمك 200 ميكرومتر من فئران SD في ACSF المثلج البارد الذي يتم تهويته بنسبة 5٪ CO 2 و 95٪ O 2 (الشكل 2).</li>
	<li>ضع شرائح الدماغ الحادة التي يبلغ سمكها 200 ميكرومتر في غرفة تخزين على شبكة نايلون مغمورة في ACSF. قم بموازنة محلول ACSF مع 95٪ O 2 و 5٪ CO2 ، مع الحفاظ على نطاق درجة حرارة 35-37 درجة مئوية. اسمح لشرائح الدماغ بالاستقرار لمدة 2 ساعة ، مما يمنحها الوقت للتكيف (الشكل 3).</li>
</ol>3. وضع العلامات على pericytes في شرائح الدماغ الحادة باستخدام TO-PRO-3
ملاحظة: تم تصنيف الخلايا المحيطة من شرائح الدماغ الحادة بشكل فلوري باستخدام التتبع TO-PRO-310.
<ol><li>أضف صبغة الفلورسنت TO-PRO-3 إلى ACSF ، وتحقيق تركيز نهائي قدره 1 ميكرومتر. احتضان شرائح الدماغ الحادة في درجة حرارة الغرفة في بيئة مظلمة باستخدام ACSF المحتوي على TO-PRO-3 لمدة 20 دقيقة. ملاحظة: تذكر ارتداء قفازات اللاتكس أثناء التعامل مع TO-PRO-3 للحماية.</li>
	<li>انقل مصفاة شبكة النايلون ، التي تحمل شرائح الدماغ ، من غرفة التحميل إلى غرفة شطف الألواح المكونة من 6 آبار (انظر جدول المواد). اترك شرائح الدماغ تبقى في غرفة الشطف لمدة 10 دقائق (الشكل 4 د). ملاحظة: تنهي خطوة الشطف هذه عملية التلوين ، وتقلل من وضع العلامات على الخلفية ، وتمنع تلطيخ غير محدد.</li>
	<li>اشطف المستحضرات لمدة 15 دقيقة باستخدام محلول ACSF المتوازن مع خليط من 5٪ CO 2 و 95٪ O2. توقف خطوة الشطف هذه امتصاص الصبغة وتقلل من وضع العلامات على الخلفية (الشكل 4C).</li>
</ol>4. تلطيخ الخلايا غير الحيوية من دوران الأوعية الدقيقة الدماغية في شرائح الدماغ الحادة
<ol><li>احتضان شرائح الدماغ محملة مسبقا ب TO-PRO-3 عند 37 درجة مئوية مع إيزولكتين B4 مترافق مع Alexa Fluor 488 (FITC-ISOB4 ؛ 5 ميكروغرام / مل ، انظر جدول المواد) لمدة 30 دقيقة في بيئة مظلمة. بعد الحضانة ، شطف شرائح الدماغ لمدة 15 دقيقة في ACSF (الشكل 4E).</li>
	<li>احتضان شرائح الدماغ في ACSF بالغاز مع 5٪ CO 2 و 95٪ O2 كالمعتاد. أضف يوديد البروبيديوم (PI) بتركيز 37 ميكرومتر إلى كلا المحلولين عند 37 درجة مئوية. سيؤدي ذلك إلى تسمية خلايا الدماغ غير الحيوية. احتضن المستحضرات في محلول ACSF لمدة 60 دقيقة في الظلام (الشكل 4F).</li>
	<li>بعد ذلك ، اشطف المستحضرات لمدة 15 دقيقة باستخدام محاليل ACSF لوقف امتصاص الصبغة وتقليل وضع العلامات على الخلفية.</li>
</ol>5. تصوير خلايا الدماغ الحيوية وغير الحيوية في شرائح الدماغ الحادة
<ol><li>انقل شرائح الدماغ برفق إلى أطباق متحدة البؤر ذات قاع زجاجي (انظر جدول المواد) باستخدام ماصات باستور البلاستيكية. املأ الأطباق بمحلول ACSF تمت موازنته مسبقا مع 5٪ CO 2 و 95٪ O2. استخدم شبكة حديدية لتثبيت شرائح دماغ الفئران في مكانها.</li>
	<li>نقل الأطباق البؤرية ذات القاع الزجاجي إلى مرحلة المجهر متحد البؤر. ضع شريحة الدماغ الحادة في قاع الطبق وقم بإعطائها9 بمحلول ACSF متوازن بمزيج من 95٪ O 2 و 5٪ CO2 أثناء التصوير المجهري متحد البؤر (الشكل 5A والشكل 5Ab).</li>
	<li>تصور خلايا جدار الأوعية الدموية الدماغية القشرية باستخدام هدف 40x. التقط حزم الصور باستخدام برامج متوافقة (انظر جدول المواد). استخدم المرشحات المناسبة ل IB4 (الإثارة / الانبعاث 460 نانومتر / 520 نانومتر) ، PI (الإثارة / الانبعاث 545 نانومتر / 595 نانومتر) ، و TO-PRO-3 (الإثارة / الانبعاث 606 نانومتر / 666 نانومتر) (الشكل 5D). ملاحظة: التقط صورا بالتفاصيل التالية: عدسة DIC N1 موضوعية 40× ، 3 × 12 بت: 512 × 512 بكسل (0.22 × 0.22 مم) ، المعايرة: 0.42 ميكرومتر / بكسل.</li>
	<li>تحديد الأوعية الدموية الدماغية الدقيقة والخلايا المحيطة بناء على شبكتها ومورفولوجيتها. حدد موقع منطقة معينة تحتوي على شبكة الأوعية الدموية الدماغية الدقيقة على كل شريحة دماغية والتقط الصور.</li>
	<li>لاحظ بعناية موقع التصوير لضمان الاتساق في اللقطات اللاحقة (الشكل 5B ، C). لمزيد من المعالجة والتحليل ، استخدم برنامج تحليل الصور (ImageJ) وبرنامج تحرير الصور (انظر جدول المواد).</li>
</ol>

تصور انقباض الدماغ pericyte بعد نزيف تحت العنكبوتية

<ol>
	<li>Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+microvascular+pericytes+in+health+and+disease.">Brain microvascular pericytes in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).</li><li>Dore-Duffy, P., Cleary, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+properties+of+pericytes.">Morphology and properties of pericytes.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 686, 49-68 (2011).</li><li>Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+control+of+CNS+capillary+diameter+by+pericytes.">Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes.</a> Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).</li><li>Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+a+pericyte.">What is a pericyte.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 451-455 (2016).</li><li>Yemisci, M., Gursoy-Ozdemir, Y., Vural, A., Can, A., Topalkara, K., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericyte+contraction+induced+by+oxidative-nitrative+stress+impairs+capillary+reflow+despite+successful+opening+of+an+occluded+cerebral+artery.">Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery.</a> Nature Medicine. 15 (9), 1031-1037 (2009).</li><li>Korte, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenaline+released+from+locus+coeruleus+axons+contracts+cerebral+capillary+pericytes+via+&#945;2+adrenergic+receptors.">Noradrenaline released from locus coeruleus axons contracts cerebral capillary pericytes via &#945;2 adrenergic receptors.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2023).</li><li>Hirunpattarasilp, C., Barkaway, A., Davis, H., Pfeiffer, T., Sethi, H., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperoxia+evokes+pericyte-mediated+capillary+constriction.">Hyperoxia evokes pericyte-mediated capillary constriction.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 42 (11), 2032-2047 (2022).</li><li>Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+study+pericyte+contractility+and+responses+to+ischaemia+in+vitro+using+electrical+impedance.">Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+TRPM4+Activity+in+cerebral+artery+myocytes+contributes+to+cerebral+blood+flow+reduction+after+subarachnoid+hemorrhage+in+rats.">Increased TRPM4 Activity in cerebral artery myocytes contributes to cerebral blood flow reduction after subarachnoid hemorrhage in rats.</a> Neurotherapeutics: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 16 (3), 901-911 (2019).</li><li>Mai-Morente, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericyte+mapping+in+cerebral+slices+with+the+far-red+fluorophore+TO-PRO-3.">Pericyte mapping in cerebral slices with the far-red fluorophore TO-PRO-3.</a> Bio-protocol. 11 (22), e4222 (2021).</li><li>Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+fluorescent+dye+identifies+pericytes+at+the+neurovascular+unit.">A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit.</a> Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationale+for+the+real-time+and+dynamic+cell+death+assays+using+propidium+iodide.">Rationale for the real-time and dynamic cell death assays using propidium iodide.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (4), 399-405 (2010).</li><li>Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TO-PRO-3+iodide:+A+novel+HeNe+laser-excitable+DNA+stain+as+an+alternative+for+propidium+iodide+in+multiparameter+flow+cytometry.">TO-PRO-3 iodide: A novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry.</a> Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).</li><li>Lacar, B., Herman, P., Platel, J. C., Kubera, C., Hyder, F., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+progenitor+cells+regulate+capillary+blood+flow+in+the+postnatal+subventricular+zone.">Neural progenitor cells regulate capillary blood flow in the postnatal subventricular zone.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (46), 16435-16448 (2012).</li><li>Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+fluorescent+dye+identifies+pericytes+at+the+neurovascular+unit.">A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit.</a> Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).</li><li>Hezel, M., Ebrahimi, F., Koch, M., Dehghani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propidium+iodide+staining:+a+new+application+in+fluorescence+microscopy+for+analysis+of+cytoarchitecture+in+adult+and+developing+rodent+brain.">Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain.</a> Micron (Oxford, England). 43 (10), 1031-1038 (2012).</li><li>Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perivascular+astroglial+sheath+provides+a+complete+covering+of+the+brain+microvessels:+An+electron+microscopic+3D+reconstruction.">The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: An electron microscopic 3D reconstruction.</a> Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).</li></ol>

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.

تم تطوير تقنيات تصوير متحدة البؤر عالية الدقة لتصور خلايا الدماغ الحيوية ، وخلايا الدماغ غير الحيوية ، والأوعية الدموية الدقيقة في شرائح الدماغ. في شرائح دماغ الفئران الحادة ، تستلزم العملية وضع العلامات الأولية على الخلايا المحيطة ب TO-PRO-311 ، تليها الخلايا البطانية الوعائية ...

تحيط الخلايا المحيطة بالدماغ ، التي تتميز بنتوءاتها النحيلة وأجسام الخلايا البارزة ، دوران الأوعية الدقيقة 1,2. في حين أن زيادة تدفق الدم الدماغي مدفوعة في الغالب بتمدد الشعيرات الدموية ، فإن الشرايين الأصغر تظهر معدلات تمدد أبطأ3. يمارس انقباض Pericyte تأثيرا على قطر الشعيرات الدموية ومورفولوجيا pericyte ، مما يؤثر على ديناميكيات الأوعية الدموية4. يؤدي تقلص الخلايا المحيطة بالدماغ إلى انقباض الشعيرات الدموية ، وفي السيناريوهات المرضية ، قد يعيق الانكماش المفرط تدفق كرات الدم الحمراء5. يمكن لعوامل مختلفة ، بما في ذلك النورإبينفرين المنطلق من الموضع الأزرق ، أن تحفز تقلص الخلايا المحيطة بالدماغ داخل الشعيرات الدموية6. مع دور تنظيمي في تدفق الدم الدماغي ، تظهر pericytes تخليق 20-HETE ، وتعمل كمستشعر للأكسجين أثناء فرط التأكسج7. يؤثر الانقباض التأكسدي النترجي الناجم عن الإجهاد في خلايا الدماغ بشكل ضار على الشعيرات الدموية5. على الرغم من التحقيقات داخل الجسم الحي وخارج الجسم الحي في تقلص الخلايا المحيطة بالدماغ 8 ، لا تزال المعرفة محدودة فيما يتعلقبتصوير خلايا الدماغ القابلة للحياة وغير القابلة للحياة داخل شرائح الدماغ.
بشكل حاسم ، فإن التصوير بعد تثبيت الأنسجة للخلايا المحيطة بالدماغ يضر بحيويتها وتقييم الانقباض اللاحق. علاوة على ذلك ، في سيناريوهات مثل الاضطرابات العصبية (على سبيل المثال ، نزيف تحت العنكبوتية - SAH) ، يفشل وضع العلامات المعدلة وراثيا للخلايا المحيطة بالدماغ في التمييز بين الخلايا المحيطة القابلة للحياة وغير القابلة للحياة ، كما أكدت دراستنا الأولية لموت الخلايا المحيطة بالدماغ التي يسببهاSAH 9. 
للتغلب على هذه التحديات ، استخدمنا TO-PRO-3 لتسمية الخلايا المحيطة الحية ، بينما تم تلطيخ المتوفين بيوديد البروبيديوم (PI). استخدمنا تقنيات التصوير متحد البؤر عالية الدقة لتصور خلايا الدماغ القابلة للحياة وغير القابلة للحياة في شرائح الدماغ مع الحفاظ على نشاط الشريحة أثناء التصوير. تهدف هذه المقالة إلى تقديم طريقة قابلة للتكرار لتصوير خلايا الدماغ القابلة للحياة وغير القابلة للحياة في شرائح الدماغ ، والتي تعمل كأداة قيمة للتحقيق في تأثير pericytes الدماغ على دوران الأوعية الدقيقة الدماغية بعد SAH.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>ABC biochemistry</td>
			<td>ABC703006</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Adobe Illustrator CS6 16.0.0</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>MIAOJIE</td>
			<td>225 mm x 273 mm</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-Elements 4.10.00</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N-SIM/C2si</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas tank (5% CO2, 95% O2)</td>
			<td>PENGYIDA</td>
			<td>40L</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Confocal Dishes</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FCFC020-10pcs</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td>EVOBOND</td>
			<td>KH-502</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice machine</td>
			<td>XUEKE</td>
			<td>IMS-20</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Image J</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhalation anesthesia system</td>
			<td>SCIENCE</td>
			<td>QAF700</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin B 4-FITC</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L2895&#8211;2MG</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7447&#8211;40&#8211;7</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647&#8211;14&#8211;5</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10049&#8211;21&#8211;5</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>NEST Biotechnology</td>
			<td>318314</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Scientific Industries Inc</td>
			<td>Model 203</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium (Iodide)</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>HY-D0815/CS-7538</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic apparatus</td>
			<td>SCIENCE</td>
			<td>QA</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard PUMP</td>
			<td>PUMP 11 ELITE Nanomite</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic water bath</td>
			<td>OLABO</td>
			<td>HH-2</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging vital and non-vital brain pericytes in brain slices following subarachnoid hemorrhage

الخلايا المحيطة هي خلايا جدارية حاسمة تقع داخل دوران الأوعية الدقيقة الدماغية ، وهي محورية في تعديل تدفق الدم الدماغي بنشاط عن طريق تعديلات الانقباض. تقليديا ، يتم قياس انقباضها من خلال مراقبة التحولات المورفولوجية وتغيرات قطر الشعيرات الدموية القريبة في ظل ظروف محددة. ومع ذلك ، فإن تثبيت ما بعد الأنسجة ، وتقييم الحيوية وما يترتب على ذلك من انقباض pericyte للخلايا المحيطة بالدماغ المصورة يصبح معرضا للخطر. وبالمثل ، فإن وضع العلامات الوراثية على الخلايا المحيطة بالدماغ يقصر في التمييز بين الخلايا المحيطة القابلة للحياة وغير القابلة للحياة ، لا سيما في الحالات العصبية مثل النزف تحت العنكبوتية (SAH) ، حيث يتحقق تحقيقنا الأولي من صحة زوال الخلايا المحيطة بالدماغ. تم وضع بروتوكول موثوق للتغلب على هذه القيود ، مما يتيح وضع علامات الفلورسنت في وقت واحد لكل من pericytes الدماغ الوظيفية وغير الوظيفية في أقسام الدماغ. تسمح طريقة وضع العلامات هذه بتصور مجهر متحد البؤر عالي الدقة ، مع وضع علامة متزامنة على الأوعية الدموية الدقيقة لشريحة الدماغ. يوفر هذا البروتوكول المبتكر وسيلة لتقييم انقباض pericyte في الدماغ ، وتأثيره على قطر الشعيرات الدموية ، وهيكل pericyte. إن التحقيق في انقباض الخلايا المحيطة بالدماغ في سياق SAH يعطي فهما ثاقبا لآثاره على دوران الأوعية الدقيقة الدماغية.

Brain pericytes, distinguished by their slender protuberances and protruding cell bodies, encircle the microcirculation1,2. While cerebral blood flow augmentation is predominantly driven by capillary dilation, smaller arteries exhibit slower rates of dilation3. Pericyte contractility exerts influence over capillary diameter and pericyte morphology, impacting vascular dynamics4. Contraction of brain pericytes leads to capillary constriction, and in pathological scenarios, excessive contraction may impede erythrocyte flow5. Various factors, including norepinephrine released from the locus coeruleus, can induce brain pericyte contraction within capillaries6. With a regulatory role in cerebral blood flow, pericytes exhibit 20-HETE synthesis, serving as an oxygen sensor during hyperoxia7. Oxidative-nitrative stress-triggered contraction of brain pericytes detrimentally affects capillaries5. Despite both in vivo and ex vivo investigations into brain pericyte contraction8, limited knowledge persists regarding the imaging of viable and non-viable brain pericytes within brain slices.
Crucially, post-tissue fixation imaging of brain pericytes compromises their vitality and subsequent contractility assessment. Moreover, in scenarios such as neurological disorders (e.g., subarachnoid hemorrhage - SAH), transgenic labeling of brain pericytes fails to differentiate between viable and non-viable pericytes, as confirmed by our preliminary SAH-induced brain pericyte death study9. 
To surmount these challenges, we employed TO-PRO-3 to label live pericytes, while deceased ones were stained with propidium iodide (PI). We used high-resolution confocal imaging technologies to visualize viable and non-viable brain pericytes in brain slices while preserving slice activity during imaging. This article aims to present a reproducible method for imaging viable and non-viable brain pericytes in brain slices, serving as a valuable tool to probe the impact of brain pericytes on cerebral microcirculation post SAH.

تسليط الضوء على المؤلف: تصوير pericytes بعد نزيف تحت العنكبوتية في القوارض 

تصوير خلايا الدماغ الحيوية وغير الحيوية في شرائح الدماغ بعد النزف تحت العنكبوتية

Our study showed a significant increase in pericytes deaths. So starting at a sick horse after SAH, it demonstrated a positive correlation between the number of low vital parasites and the time elapsed after SAH. Imaging vital and the non-vital brain parasites in brain slices following SAH and the parasite isolation techniques, have advanced the research in my field.Currently, it's quite difficult to fully distinguish between dead parasites and dead endothelial cells. Our study find contraction-dependent apoptosis in parasites after SAH. We have developed a very reliable protocol, which enables the fluorescent labeling, both functional and a non-functional brain parasite in brain sections, and the same time.

في ظل الظروف الفسيولوجية الطبيعية ، لا تخضع خلايا الدماغ عموما لموت الخلايا. يوضح الشكل 6 هذه الظاهرة ، حيث يشير اللون الأصفر إلى وجود خلايا محيطية حيوية في الدماغ. لا تظهر الخلايا المحيطة بالدماغ أي تلطيخ مع PI ، مما يشير إلى صلاحيتها. لمزيد من التحقيق فيما إذا كانت الخلايا ?...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Pericytes Post-Subarachnoid Hemorrhaging in Rodents at JoVE.com

يؤكد التحقيق الأولي أن النزف تحت العنكبوتية (SAH) يسبب زوال الخلايا المحيطة بالدماغ. يتطلب تقييم انقباض الخلايا المحيطة بعد SAH التمييز بين خلايا الدماغ القابلة للحياة وغير القابلة للحياة. ومن ثم ، تم تطوير إجراء لتسمية pericytes الدماغ قابلة للحياة وغير قابلة للحياة في وقت واحد في أقسام الدماغ ، مما يسهل الملاحظة باستخدام مجهر متحد البؤر عالي الدقة.

Pericytes are crucial mural cells situated within cerebral microcirculation, pivotal in actively modulating cerebral blood flow via contractility ...

أظهرت دراستنا زيادة كبيرة في وفيات pericytes. لذلك بدءا من حصان مريض بعد SAH ، أظهر وجود علاقة إيجابية بين عدد الطفيليات الحيوية المنخفضة والوقت المنقضي بعد SAH. التصوير الحيوي وطفيليات الدماغ غير الحيوية في شرائح الدماغ بعد SAH وتقنيات عزل الطفيليات ، قد طور البحث في مجال عملي.في الوقت الحالي ، من الصعب جدا التمييز بشكل كامل بين الطفيليات الميتة والخلايا البطانية الميتة. وجدت دراستنا موت الخلايا المبرمج المعتمد على الانكماش في الطفيليات بعد SAH. لقد طورنا بروتوكولا موثوقا به للغاية ، والذي يتيح وضع العلامات الفلورية ، سواء الوظيفية أو غير الوظيفية في الدماغ الطفيلية في أقسام الدماغ ، وفي نفس الوقت.

imaging-vital-non-vital-brain-pericytes-brain-slices-following

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Vital and Non-vital Brain Pericytes in Brain Slices following Subarachnoid Hemorrhage

703 Views.  The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University. أظهرت دراستنا زيادة كبيرة في وفيات pericytes. لذلك بدءا من حصان مريض بعد SAH ، أظهر وجود علاقة إيجابية بين عدد الطفيليات الحيوية المنخفضة والوقت المنقضي بعد SAH. التصوير الحيوي وطفيليات الدماغ غير الحيوية في شرائح الدماغ بعد SAH وتقنيات عزل الطفيليات ، قد طور البحث في مجال عملي.?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تصوير pericytes بعد نزيف تحت العنكبوتية في القوارض 

Pericytes are crucial mural cells situated within cerebral microcirculation, pivotal in actively modulating cerebral blood flow via contractility adjustments. Conventionally, their contractility is gauged by observing morphological shifts and nearby capillary diameter changes under specific circumstances. Yet, post-tissue fixation, evaluating vitality and ensuing pericyte contractility of imaged brain pericytes becomes compromised. Similarly, genetically labeling brain pericytes falls short in distinguishing between viable and non-viable pericytes, particularly in neurologic conditions like subarachnoid hemorrhage (SAH), where our preliminary investigation validates brain pericyte demise. A reliable protocol has been devised to surmount these constraints, enabling simultaneous fluorescent tagging of both functional and non-functional brain pericytes in brain sections. This labeling method allows high-resolution confocal microscope visualization, concurrently marking the brain slice microvasculature. This innovative protocol offers a means to appraise brain pericyte contractility, its impact on capillary diameter, and pericyte structure. Investigating brain pericyte contractility within the SAH context yields insightful comprehension of its effects on cerebral microcirculation.

The preliminary inquiry confirms that subarachnoid hemorrhage (SAH) causes brain pericyte demise. Evaluating pericyte contractility post-SAH requires differentiation between viable and non-viable brain pericytes. Hence, a procedure has been developed to label viable and non-viable brain pericytes concurrently in brain sections, facilitating observation using a high-resolution confocal microscope.

Induction of the Murine Subarachnoid Hemorrhage Model and Brain Slice Preparation for Fluorescent Imaging

To create the subarachnoid hemorrhage, or SAH model, insert a microinjection needle into an anesthetized rat's suprasellar cistern. With a syringe pump, inject autologous blood acquired from the rat's tail artery into the suprasellar cistern. Now implant another needle into the right lateral cerebral ventricle at the given coordinates.For the SAH models, inject 0.2 milliliters of rat tail artery blood. For the SHAM groups, inject the same volume of isotonic saline. After decapitation, extract the rat's entire brain and submerge them in ice cold artificial cerebral spinal fluid or ACSF.With a vibratome, prepare acute brain slices of 200 micrometers and ice cold equilibrated ACSF. Place the brain slices on a nylon mesh, immersed in equilibrated ACSF in a storage chamber at 35 to 37 degrees Celsius.

تحريض نموذج النزف تحت العنكبوتية للفأر وإعداد شريحة الدماغ للتصوير الفلوري

Labeling and Staining Rat Brain Pericytes for Fluorescent Imaging

To label the pericytes, add the fluorescent dye TO-PRO-3 to the artificial cerebral spinal fluid or ACSF. Now incubate the freshly sliced rat brain in the dye-laden ACSF for 20 minutes in a dark environment at room temperature. Next, transfer the nylon mesh strainer with the brain slices to a six-well plate rinsing chamber.Let the brain slices rest in the chamber for 10 minutes. To label the non-vital pericytes, incubate the TO-PRO-3 tagged brain slices in conjugated isolectin B4 at 37 degrees Celsius for 30 minutes in the dark. After incubation, rinse the brain slices in artificial cerebral spinal fluid for 15 minutes.Next, place the brain slices in ACSF gassed with 5%carbon dioxide and 95%oxygen. To this, add propidium iodide at a concentration of 37 micromolar at 37 degrees Celsius. To halt the dye uptake and minimize the background labeling, rinse the preparations for 15 minutes in ACSF.Under normal physiological conditions, brain pericytes do not experience cell death. Viable pericytes that were not stained with propidium iodide were detected. The SAH models should vital pericytes within microvasculature.Non-vital pericytes were also detected. Propidium iodide-labeled non-vital pericytes remained attached to the entire microvasculature.

وضع العلامات وتلطيخ خلايا دماغ الفئران للتصوير الفلوري

Confocal Imaging of Vital and Non-Vital Pericytes in Rat Acute Brain Slices

To begin, use a plastic Pasteur pipette to gently transfer the fluorescently stained brain slices to glass bottom confocal dishes. Fill these dishes with equilibrated ACSF. With an iron mesh, secure the rat brain slices in place.Next, place the glass bottom confocal dishes onto the stage of a confocal microscope. Position the acute brain slice at the bottom of the dish and perfuse with equilibrating ACSF during imaging. Using the 40X objective, view the wall cells of the cerebral cortical microvasculature.Next, use compatible software to capture image stacks. Identify cerebral microvasculature and pericytes based on their network and morphology, then locate a specific region containing a cerebral microvasculature network on each brain slice and capture images. Under normal physiological conditions, brain pericytes do not experience cell death.Viable pericytes that were not stained with propidium iodide were detected. The SAH models showed vital pericytes within microvasculature. Non-vital pericytes were also detected.Propidium iodide labeled non-vital pericytes"remained detached to the entire microvasculature.