אנו מעריכים את התמיכה הכספית מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82274207 ו- 82104533), תוכנית המחקר והפיתוח המרכזית של נינגשיה (2023BEG02012), ופרויקט קידום המחקר המלומד Xinglin של אוניברסיטת צ'נגדו של TCM (XKTD2022013).

הערה: תאי אנדותל שמקורם במוח עכבר.3 (bBend.3) חוסנו לתוך תאים של צלחת בת 24 בארות כדי לבנות מודל פשוט במבחנה של BBB בתנאים בינוניים ספציפיים. ה-TEER של תאים נורמליים ותאים היפוקסיים נמדד על-ידי מד TEER (איור 1 ואיור 2).
1. הכנת פתרון
<ol><li>הכינו את מדיום תרבית תאי DMEM המכיל FBS (10%, v/v), 100 U/mL פניצילין וסטרפטומיצין 10 מ"ג/מ"ל (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>הכן תמיסת מלאי CoCl2 של 100 מ"מ על ידי הוספת תמיסת CoCl2 עד 100 מיקרוליטר DMSO של 1.30 מ"ג. הערה: כל התמיסות הנ"ל אוחסנו במצב של 4 מעלות צלזיוס, ותמיסת המלאי דוללה בהתאם לריכוז הרצוי לפני השימוש.</li>
	<li>הכן תמיסת 5% נתרן היפוכלוריט (v/v) על ידי הוספת 2 מ"ל של תמיסת נתרן היפוכלוריט ל 38 מ"ל של מים מזוקקים כפול.</li>
</ol>2. תרבית תאים וכדאיות התא
<ol><li>זרע 1 מ"ל של bend.3 תאים בצלחת תרבית (100 מ"מ) המכיל מדיום DMEM בצפיפות של 1 x 106 תאים / מ"ל ותרבית ב 37 ° C באטמוספירה לחה של 5% CO2. שנה את המדיום כל 2 עד 3 ימים ותת-תרבית את התאים 2 פעמים בשבוע.</li>
	<li>לאחר bend.3 תאים לגדול 80% מפגש, לעכל את התאים עם 0.25% טריפסין במשך 30 שניות.</li>
	<li>בצע השעיה של bend.3 תאים בצפיפות של 7 x 104 תאים/מ"ל באמצעות תווך DMEM דרך מונה תאים. לאחר מכן, זרעו 100 μL של bend.3 השעיית תאים בצלחת של 96 בארות.</li>
	<li>לאחר היצמדות התא, נקו את התאים עם PBS ותרביתו את התאים עם 100 μL של מדיום תרבית או מדיום המכיל תרופות (100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM CoCl2) במשך 24 שעות באותם תנאים. לאחר הסרת המדיום בתוך צלחת הבאר וניקוי עם PBS, להוסיף 100 μL של תמיסת CCK-8. הערה: אין ליצור בועות בבאר, אשר ישפיעו על ערכי הצפיפות האופטית (OD).</li>
	<li>שים צלחות 96 בארות בסביבה של 37 מעלות צלזיוס ודגור במשך שעה אחת. מדוד את הספיגה של לוחות 96 בארות ב 450 ננומטר באמצעות קורא microplates. הערה: כדי למנוע הבדלים בתוך הקבוצה, לוחות הבאר צוננו לטמפרטורת החדר לפני הגילוי.</li>
	<li>חשב את כדאיות התא המושרה על ידי ריכוזים שונים של CoCl2 בהתאם לנוסחה [ODDrug - ODBlank] / [ODControl-OD Blank] x 100%. בחר את ריכוז CoCl2 עם הבדל משמעותי בהפחתת כדאיות התא בהשוואה לקבוצת הביקורת לניסוי הבא.</li>
</ol>3. הרכבת דגם
<ol><li>שטפו את החדר העליון של צלחות 24 הבארות עם PBS. הערה: תאים גדלו והתמזגו בתחתית החדר העליון של צלחת 24 בארות, וצמתים הדוקים בין תאים נוצרו בהדרגה כדי למלא תפקיד מחסום. אם תאי האנדותל ששימשו במחקרים מסוימים אינם מסוגלים ליצור מחסום מלא על קרומי PET באופן עצמאי, נדרש ציפוי הקרומים בתמיסת קולגן IV לפני חיסון התא.</li>
	<li>ערבבו את תאי bend.3 עם מדיום DMEM ליצירת תרחיף בצפיפות של 5 x 105 תאים/מ"ל באמצעות מערבל מערבולת. לאחר מכן, זרע 200 μL של bend.3 השעיית תאים על קרום PET בחדר העליון של צלחת 24 בארות (0.33 ס"מ2, 0.4 מיקרומטר גודל נקבוביות הממברנה). הערה: מחקר הפיילוט של פרוטוקול זה לא מצא הבדל בתוצאות בעת שימוש ב-5 עד 10 מעברים של תאי bend.3 לניסויים. כדי להבטיח את ההסתברות למידול מוצלח, עיין במרווח מספר התא של פרוטוקול זה.</li>
	<li>הוסף 1200 μL של תווך שלם לתא התחתון של הצלחת כדי להבטיח שהלחץ האוסמוטי של החדרים העליונים והתחתונים נוטה להתייצב. ישנם הבדלים בנפח המדיום שנוסף בהתאם לסוג; ודא כי רמת הנוזל של החדרים העליונים והתחתונים הוא סמוק.</li>
	<li>שנה את התווך של החדר העליון והחדר התחתון בשעה קבועה בכל יום ועקוב אחר ערך ההתנגדות בו זמנית.<ol><li>בעת שינוי המדיום, שלמות שכבת התא תיפגע על ידי מגע מלאכותי או תנועה מוגזמת. כדי למנוע את המצב הנ"ל, לאט להסיר את המדיום הישן מצד אחד עם פיפטה לחץ שלילי ולאט לאט להוסיף מדיום חדש לאורך הקיר במהלך חילופי נוזלים.</li>
	</ol></li>
</ol>4. מדידת TEER
<ol><li>לפני תחילת העבודה, הניחו את הנגד, תמיסת 5% נתרן היפוכלוריט, 75% אתנול ותמיסת מים מזוקקים כפולה בשולחן נקי במיוחד. הפעל את הקרנת UV למשך 30 דקות כדי לחסל שאריות חיידקים ופתוגנים.</li>
	<li>מניחים את האלקטרודות בתמיסת 5% נתרן היפוכלוריט עם ניעור איטי במשך 3 שניות עד 5 שניות, ולאחר מכן טובלים באתנול 75% למשך 15 דקות. לבסוף, יש להעביר ל-PBS או לתמיסת מים מזוקקים פעמיים עד לשימוש.</li>
	<li>הפעל את המתג בגב מד נגדי התא, לחץ על בחר צלחת בהתאם לפרמטרים בטבלה 1 ובחר צלחת 24 בארות.</li>
	<li>בהתאם לצרכי הפעולה, בחר את רצף הזיהוי המתאים. בחרנו הליך A1 במחקר זה.</li>
	<li>הכנס נגד kΩ לתקע הימני כדי לכייל את המכשיר. אם תוצאת הכיול היא 1000 ± 5 Ω, שקול את דיוק המכשיר כתקין.<ol><li>אם תוצאת הכיול אינה 1000 Ω, לחץ על יחידות מצב בממשק הראשי כדי לבחור OHMS, ולאחר מכן לחץ על כיול במסך הראשי כדי לכייל מחדש את המכשיר.</li>
	</ol></li>
	<li>משוך את נגד kΩ בצד ימין והחלף את אלקטרודת המדידה בחוט חיבור.</li>
	<li>מקם את האלקטרודה בלוח 24 הקידוחים מבלי לזרוע תאים אנכית ולחץ על טיפול ריק במסך הראשי של המכשיר. ערך הרקע של עמידות הצלחת ללא תאי זרע הוא כ 134.4 Ω.</li>
	<li>הכנס את שתי האלקטרודות לחדרים העליונים והתחתונים של צלחת הזרע עם תאים כך ששכבת התא תהיה ביניהם, ולאחר מכן רשום את ערך ההתנגדות על ידי דריכה עדינה על הדוושה.<ol><li>ודא שהאלקטרודה אינה נוגעת בתאים בתא העליון ובתחתית התא התחתון. לזמן ההשריה של האלקטרודה בתמיסה אין השפעה על ערך ההתנגדות, ויש רק לוודא שהאלקטרודה נמצאת במיקום הנכון.</li>
	</ol></li>
	<li>קבל ערכי TEER (Ωcm2) על ידי הכפלת ערכי התנגדות חשמלית (ohms) עם השטח התחתון (cm2) של החדר העליון, כמו במשוואה: TEER (Ωcm2) = התנגדות (Ω) xS insert (ס"מ2)</li>
	<li>צייר תרשים קו של TEER-Time (בימים). כאשר ערך ההתנגדות אינו עולה עוד יותר עם הזמן (נמדד על פני ימים), שקול את התא נוצר מחסום. NOTW: מודל BBB חד-שכבתי של תאי bEnd.3 ייבנה בהצלחה על ידי תרבית תאי bEND.3 עם הפרמטרים במחקר זה במשך כ-6 ימים. ה-TEER של מודל חד-שכבתי של תא bEnd.3 נע בין 16.49 ±-2.12 Ωcm2 ל-27.59 ±-1.50 Ωcm2 תוך 6 ימים (n = 8, ממוצע ± SD).</li>
</ol>5. הרס מחסומים וניתוח סטטיסטי
<ol><li>על פי עקומת הזמן TEER, בחר את הבארות עם פונקציית מחסום וחלק אותן לקבוצת הבקרה ולקבוצת CoCl2 (n = 4).</li>
	<li>הוסף את מדיום התרבית ואת מדיום התרבית המכיל 300 מיקרומטר CoCl2 (200 μL) לקבוצת הביקורת ולתא העליון של קבוצת CoCl2 , בהתאמה.</li>
	<li>זהה את ערכי ההתנגדות של קבוצות הבקרה ו- CoCl2 ב- 12 שעות ו- 24 שעות הדגירה ב- 37 ° C באמצעות ההליך המתואר בשלב 4.</li>
	<li>השתמש בתוכנה מסחרית כדי למפות את המגמה של ערכי TEER של מחסום התאים בתרבית עם או בלי 300 מיקרומטר CoCl2.</li>
	<li>השתמש בתוכנת ניתוח סטטיסטי כדי לנתח את ההבדל בערכי ההתנגדות בין תאים שטופלו ב- CoCl2 לבין תאים נורמליים (n=4, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).</li>
</ol>

מדידת התנגדות טרנסאנדותל להערכת שלמות מחסום התא

<ol>
	<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLEC14A+deficiency+exacerbates+neuronal+loss+by+increasing+blood-brain+barrier+permeability+and+inflammation.">CLEC14A deficiency exacerbates neuronal loss by increasing blood-brain barrier permeability and inflammation.</a> J Neuroinflammation. 17 (1), 48 (2020).</li><li>Bagchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vitro+blood-brain+barrier+models+for+drug+screening+and+permeation+studies:+an+overview.">In-vitro blood-brain barrier models for drug screening and permeation studies: an overview.</a> Drug Des Devel Ther. 13, 3591-3605 (2019).</li><li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier.">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harb perspect Biol. 7 (1), 020412 (2015).</li><li>Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier+in+health+and+disease:+Important+unanswered+questions.">The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions.</a> J Exp Med. 217 (4), 20190062 (2020).</li><li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+delivery.">Blood-brain barrier delivery.</a> Drug Discov Today. 12 (1-2), 54-56 (2007).</li><li>Eigenmann, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+four+immortalized+human+brain+capillary+endothelial+cell+lines,+hCMEC/D3,+hBMEC,+TY10,+and+BB19,+and+optimization+of+culture+conditions,+for+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+permeability+studies.">Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies.</a> Fluids Barriers CNS. 10 (1), 33 (2013).</li><li>Gajd&#225;cs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+concept+of+an+ideal+antibiotic:+Implications+for+drug+design.">The concept of an ideal antibiotic: Implications for drug design.</a> Molecule. 24 (5), 892 (2019).</li><li>Stanimirovic, D. B., Bani-Yaghoub, M., Perkins, M., Haqqani, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+models:+in+vitro+to+in+vivo+translation+in+preclinical+development+of+CNS-targeting+biotherapeutics.">Blood-brain barrier models: in vitro to in vivo translation in preclinical development of CNS-targeting biotherapeutics.</a> Expert Opin Drug Discov. 10 (2), 141-155 (2015).</li><li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier:+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use.">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).</li><li>&#214;zyurt, M. G., Bayir, E., Do&#286;an, &. #. 3. 5. 0. ;., &#214;zt&#220;rk, &. #. 3. 5. 0. ;., &#350;endem&#304;r, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coculture+model+of+blood-brain+barrier+on+electrospun+nanofibers.">Coculture model of blood-brain barrier on electrospun nanofibers.</a> Turk J Biol. 44 (4), 121-132 (2020).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+validation+of+the+simplified+in+vitro+3D+Co-culture+based+BBB+model.">Functional validation of the simplified in vitro 3D Co-culture based BBB model.</a> Biochem Biophys Res Commun. 625, 128-133 (2022).</li><li>Aazmi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularizing+the+brain+in+vitro.">Vascularizing the brain in vitro.</a> iScience. 25 (4), 104110 (2022).</li><li>Burkhart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+brain+capillary+endothelial+cells+in+primary+culture+with+defined+blood-brain+barrier+properties.">Transfection of brain capillary endothelial cells in primary culture with defined blood-brain barrier properties.</a> Fluids Barriers CNS. 12, 19 (2015).</li><li>Campisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+self-organized+microvascular+model+of+the+human+blood-brain+barrier+with+endothelial+cells,+pericytes+and+astrocytes.">3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes.</a> Biomaterials. 180, 117-129 (2018).</li><li>Peng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammatory+in+vitro+cell+culture+models+and+the+potential+applications+for+neurological+disorders.">Neuroinflammatory in vitro cell culture models and the potential applications for neurological disorders.</a> Front Pharmacol. 12, 671734 (2021).</li><li>Secker, P. F., Schlichenmaier, N., Beilmann, M., Deschl, U., Dietrich, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+transepithelial+transport+measurements+to+detect+nephrotoxicity+in+vitro+using+the+RPTEC/TERT1+cell+line.">Functional transepithelial transport measurements to detect nephrotoxicity in vitro using the RPTEC/TERT1 cell line.</a> Arch Toxicol. 93 (7), 1965-1978 (2019).</li><li>Nazari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+TEER+measurements+of+biological+barriers+in+microphysiological+systems.">Advances in TEER measurements of biological barriers in microphysiological systems.</a> Biosens Bioelectron. 234, 115355 (2023).</li><li>Nicolas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+transepithelial+electrical+resistance+(TEER)+measurements+on+perfused+membrane-free+epithelia.">High throughput transepithelial electrical resistance (TEER) measurements on perfused membrane-free epithelia.</a> Lab Chip. 21 (9), 1676-1685 (2021).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+alleviates+hypoxia-induced+blood-brain+barrier+injury+via+regulation+of+CLDN5+(claudin+5).">Autophagy alleviates hypoxia-induced blood-brain barrier injury via regulation of CLDN5 (claudin 5).</a> Autophagy. 17 (10), 3048-3067 (2021).</li><li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA/ROCK-2+pathway+inhibition+and+tight+junction+protein+upregulation+by+catalpol+suppresses+lipopolysaccaride-induced+disruption+of+blood-brain+barrier+permeability.">RhoA/ROCK-2 pathway inhibition and tight junction protein upregulation by catalpol suppresses lipopolysaccaride-induced disruption of blood-brain barrier permeability.</a> Molecules. 23 (9), (2018).</li><li>Sulhan, S., Lyon, K. A., Shapiro, L. A., Huang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+and+blood-brain+barrier+disruption+following+traumatic+brain+injury:+Pathophysiology+and+potential+therapeutic+targets.">Neuroinflammation and blood-brain barrier disruption following traumatic brain injury: Pathophysiology and potential therapeutic targets.</a> J Neurosci Res. 98 (1), 19-28 (2020).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notoginsenoside+R1+intervenes+degradation+and+redistribution+of+tight+junctions+to+ameliorate+blood-brain+barrier+permeability+by+Caveolin-1/MMP2/9+pathway+after+acute+ischemic+stroke.">Notoginsenoside R1 intervenes degradation and redistribution of tight junctions to ameliorate blood-brain barrier permeability by Caveolin-1/MMP2/9 pathway after acute ischemic stroke.</a> Phytomedicine. 90, 153660 (2021).</li><li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salidroside+intensifies+mitochondrial+function+of+CoCl2-damaged+HT22+cells+by+stimulating+PI3K-AKT-MAPK+signaling+pathway.">Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway.</a> Phytomedicine. 109, 154568 (2023).</li><li>Mu&#241;oz-S&#225;nchez, J., Ch&#225;nez-C&#225;rdenas, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cobalt+chloride+as+a+chemical+hypoxia+model.">The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model.</a> J Appl Toxicol. 39 (4), 556-570 (2019).</li><li>Jiang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salidroside+attenuates+high+altitude+hypobaric+hypoxia-induced+brain+injury+in+mice+via+inhibiting+NF-&#954;B/NLRP3+pathway.">Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-&#954;B/NLRP3 pathway.</a> Eur J Pharmacol. 925, 175015 (2022).</li><li>Xie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodiola+crenulate+alleviates+hypobaric+hypoxia-induced+brain+injury+via+adjusting+NF-&#954;B/NLRP3-mediated+inflammation.">Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-&#954;B/NLRP3-mediated inflammation.</a> Phytomedicine. 103, 154240 (2022).</li><li>Thiebaut de Schotten, M., Forkel, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergent+properties+of+the+connected+brain.">The emergent properties of the connected brain.</a> Science. 378 (6619), 505-510 (2022).</li><li>Tu, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimated+burden+of+stroke+in+China+in+2020.">Estimated burden of stroke in China in 2020.</a> JAMA Netw Open. 6 (3), 231455 (2023).</li><li>Alzheimers Dement. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+facts+and+figures.">Alzheimer's disease facts and figures.</a> Alzheimers Dement. 17 (3), 327-406 (2021).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+promote+tPA-induced+brain+hemorrhage+via+cGAS+in+mice+with+stroke.">Neutrophil extracellular traps promote tPA-induced brain hemorrhage via cGAS in mice with stroke.</a> Blood. 138 (1), 91-103 (2021).</li><li>Liu, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cdk5+deficit+leads+to+the+development+of+spontaneous+epilepsy+through+CXCL1/CXCR2-mediated+reactive+astrogliosis.">Endothelial Cdk5 deficit leads to the development of spontaneous epilepsy through CXCL1/CXCR2-mediated reactive astrogliosis.</a> J Exp Med. 217 (1), 20180992 (2020).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Sporadic+Alzheimer's+Disease+in+Human+Brain+Organoids+under+Serum+Exposure.">Modeling Sporadic Alzheimer's Disease in Human Brain Organoids under Serum Exposure.</a> Adv Sci (Weinh). 8 (18), 2101462 (2021).</li><li>Qi, D., Lin, H., Hu, B., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+(BBB)+based+on+hCMEC/D3+cells.">A review on in vitro model of the blood-brain barrier (BBB) based on hCMEC/D3 cells.</a> J Control Release. 358, 78-97 (2023).</li><li>Artus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt/planar+cell+polarity+signaling+pathway+contributes+to+the+integrity+of+tight+junctions+in+brain+endothelial+cells.">The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).</li><li>Sivandzade, F., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vitro+blood-brain+barrier+modeling:+A+review+of+modern+and+fast-advancing+technologies.">In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1667-1681 (2018).</li><li>Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocultures+of+primary+porcine+brain+capillary+endothelial+cells:+Still+a+functional+in+vitro+model+for+the+blood-brain-barrier.">Monocultures of primary porcine brain capillary endothelial cells: Still a functional in vitro model for the blood-brain-barrier.</a> J Control Release. 285, 172-177 (2018).</li><li>Srinivasan, B., Kolli, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transepithelial/transendothelial+electrical+resistance+(TEER)+to+measure+the+integrity+of+blood-brain+barrier.">Transepithelial/transendothelial electrical resistance (TEER) to measure the integrity of blood-brain barrier.</a> Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).</li><li>Liang, Y., Yoon, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+sensors+for+blood-brain+barrier+(BBB)+on+a+chip.">In situ sensors for blood-brain barrier (BBB) on a chip.</a> Sens Actuators Rep. 3, 100031 (2021).</li><li>Ozg&#252;r, B., Helms, H. C. C., Tornabene, E., Brodin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+increases+expression+of+selected+blood-brain+barrier+transporters+GLUT-1,+P-gp,+SLC7A5+and+TFRC,+while+maintaining+barrier+integrity,+in+brain+capillary+endothelial+monolayers.">Hypoxia increases expression of selected blood-brain barrier transporters GLUT-1, P-gp, SLC7A5 and TFRC, while maintaining barrier integrity, in brain capillary endothelial monolayers.</a> Fluids Barriers CNS. 19 (1), (2022).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

אחד מאיברי הגוף המפותחים ביותר, המוח שולט במגוון רחב של תהליכים פיזיולוגיים מורכבים, כולל זיכרון, קוגניציה, שמיעה, ריח ותנועה27. המוח הוא אחד האיברים המסובכים והמטופלים ביותר בגוף האדם בעת ובעונה אחת. הופעתן של הפרעות רבות במערכת העצבים המרכזית מראה נטייה גוברת משנה לשנה בשל ג?...

BBB הוא ממשק ביולוגי ייחודי בין מחזור הדם לרקמת העצב, המורכב מתאי אנדותל וסקולריים, פריציטים, אסטרוציטים, נוירונים ומבנים תאיים אחרים1. זרימת היונים, הכימיקלים והתאים בין הדם למוח מווסתת בקפדנות על ידי מחסום זה. הומאוסטזיס זה מגן על רקמות העצבים מפני רעלים ופתוגנים תוך שהוא מאפשר פעולה מתאימה של עצבי המוח 2,3. שמירה על שלמות BBB יכולה למנוע ביעילות התפתחות והתקדמות של הפרעות המשפיעות על מערכת העצבים המרכזית, כגון תפקוד עצבי, בצקת ודלקת עצבית4. עם זאת, התכונות הפיזיולוגיות הייחודיות של BBB מונעות מיותר מ-98% מהתרופות במולקולות קטנות ומ-100% מהתרופות המקרומולקולאריות להיכנס למערכת העצבים המרכזית5. לכן, הגברת החדירה של תרופות דרך BBB במהלך פיתוח תרופות למערכת העצבים המרכזית חיונית להשגת יעילות טיפולית 6,7. אף על פי שסימולציה ממוחשבת של מצעים העלתה באופן משמעותי את ההסתברות של מועמדים לתרופות לחצות את מחסום הדם-מוח, עדיין נדרשים מודלים אמינים ובמחיר סביר של BBB in vitro/in vivo כדי לענות על צרכי המחקר המדעי8.
טכניקה מהירה ומשתלמת לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה היא מודל 9 במבחנה. כדי לשפוך אור על התהליכים הבסיסיים של השפעות התרופות על תפקוד BBB וחלקם בהתפתחות והתקדמות המחלה, נוצרה סדרה של מודלים פשוטים של BBB במבחנה. כיום, המודלים הנפוצים של BBB במבחנה הם מודלים חד-שכבתיים, תרבית משותפת, דינמיים ומיקרופלואידים 10,11,12, שנבנו על ידי תאי אנדותל וסקולריים ואסטרוציטים, פריציטים או מיקרוגליה 13,14. למרות שתרביות תאים תלת-ממדיות תואמות יותר את המבנה הפיזיולוגי של BBB15, היישום שלהן כאמצעי לסינון תרופות עבור BBB עדיין מוגבל על ידי העיצוב המורכב שלהן ויכולת השחזור שלהן. לעומת זאת, המודל החד-שכבתי במבחנה הוא המודל הנפוץ ביותר לחקר BBB והוא ישים לקביעת הביטוי של מובילי ממברנות וחלבוני צומת הדוקים בתאים מסוימים.
מדידת התנגדות חשמלית טרנסממברנה (TEER) היא טכניקה להערכה וניטור של שכבת התאים על פני ההתנגדות והערכת שלמות התא וחדירות המחסום. על ידי החדרה בו זמנית של שתי אלקטרודות למדיום הגידול או לתמיסת החיץ משני צדי החד-שכבה, ניתן למדוד את זרם החילופין או העכבה החשמלית דרך השכבה הקומפקטית16,17 של התא. על מנת לקבוע אם מודל BBB במבחנה נוצר כראוי, המדידה של TEER תשמש בדרך כלל כתקן זהב18. מצד שני, ניתן לחזות במדויק את מגמת הפעולה התרופתית על חדירות BBB על ידי מדידת השינוי בהתנגדות החשמלית של שכבת התא לאחר מעורבות סמים19. לדוגמה, פנג ועמיתיו גילו כי קטלפול (המונומר הפעיל העיקרי של rehmanniae) יכול להפוך ביעילות את הוויסות כלפי מטה המושרה על ידי ליפופוליסכריד של חלבוני צומת הדוקים ב- BBB ולהעלות את ערך TEER של שכבת תאי אנדותל במוח העכבר20.
התגובה הנוירו-דלקתית היא בדרך כלל הגורם העיקרי לחוסר איזון בהומאוסטזיס BBB21. טיפול היפוקסי לגרימת פגיעה נוירו-דלקתית הוא השיטה העיקרית להרוס את מחסום הדם-מוח, בעיקר כולל שיטות פיזיות ושיטות ריאגנטים כימיים. הראשון משתמש בעיקר באינקובטור של שלושה גזים כדי לשנות את תכולת החמצן בסביבת גידול התאים כדי לדמות תנאים היפוקסיים22, ואילו האחרון מושג על ידי החדרה מלאכותית של ריאגנטים deoxy כגון CoCl2 למדיום תרבית התא23. התאים יישארו במצב לא מחומצן אם Fe2+ יוחלף ב- Co2+ ב- heme. אם Fe2+ מוחלף ב- Co2+ בקבוצה הקטליטית, פעילות הידרוקסילאז פרולין והידרוקסילאז אספרטט יעוכבו, וכתוצאה מכך הצטברות של גורם השראת היפוקסיה-1α (HIF-1α)24. תחת היפוקסיה מתמשכת, dephosphorylation של HIF-1α בציטופלסמה מעורר מוות התא ומפעיל גורם גדילה אנדותל כלי הדם, אשר בסופו של דבר מעלה חדירות כלי הדם. במחקרים קודמים 25,26, הוכח היטב כי היפוקסיה יכולה להפחית באופן משמעותי את הביטוי של חלבוני צומת הדוק אנדותל כדי להגדיל את החדירות של BBB. במחקר זה נמדדה עקומת התנגדות הזמן של תאי bend.3 שנזרעו בלוחות של 24 בארות על מנת ליצור מודל BBB פשוט. באמצעות מודל זה, אפיינו את השינויים ב-TEER התא לאחר התערבות CoCl2 על מנת לבנות מודל תאי שניתן להשתמש בו כדי לסנן תרופות להגנה מפני BBB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well transwell plate</td>
			<td>Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 &#181;m)</td>
			<td>10522023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 % ethanol</td>
			<td>ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd</td>
			<td>2023052901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd</td>
			<td>220412-078-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bEnd.3 cells</td>
			<td>Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>CL0049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting kit-8 (CCK-8)</td>
			<td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>BG0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (100mm)</td>
			<td>Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td>
			<td>1192022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt Chloride (CoCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>15862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>PYG0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (1x)</td>
			<td>Gibco ThermoFisher Scientific</td>
			<td>8121587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2166090RP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism software</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>9.0.0(121)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (Contains collagen IV)</td>
			<td>MedChemexpress</td>
			<td>HY-K6002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax iD5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 8 software</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>v8.0724(B724)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>17C18B16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS, 1x)</td>
			<td>Gibco ThermoFisher Scientific</td>
			<td>8120485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd</td>
			<td>2022091501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmembrane resistance meter</td>
			<td>World Precision Instruments LLC</td>
			<td>VOM3 (verison 1.6)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% (1x)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>J210045</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

barrier functional integrity recording on bend.3 vascular endothelial cells via transendothelial electrical resistance detection

מחסום הדם-מוח (BBB) הוא מבנה פיזיולוגי דינמי המורכב מתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים, אסטרוציטים ופריציטים. על-ידי תיאום האינטראקציה בין מעבר מוגבל של חומרים מזיקים, ספיגת חומרים מזינים וסילוק מטבוליטים במוח, מחסום הדם-מוח חיוני לשימור הומאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית. בניית מודלים חוץ גופיים של BBB היא כלי רב ערך לחקר הפתופיזיולוגיה של הפרעות נוירולוגיות ויצירת טיפולים תרופתיים. מחקר זה מתאר הליך ליצירת מודל תאי BBB חד-שכבתי במבחנה על ידי זריעת תאי bend.3 לתוך החדר העליון של צלחת בעלת 24 בארות. כדי להעריך את שלמות תפקוד מחסום התא, נעשה שימוש במד מתח תאי אפיתל קונבנציונלי כדי לרשום את ההתנגדות החשמלית הטרנסממברנה של תאים נורמליים ותאים היפוקסיים המושרים על ידי CoCl2 בזמן אמת. אנו צופים כי הניסויים הנ"ל יספקו רעיונות יעילים ליצירת מודלים חוץ גופיים של BBB ותרופות לטיפול בהפרעות של מחלות מערכת העצבים המרכזית.

BBB is a unique biological interface between blood circulation and nerve tissue, which is composed of vascular endothelial cells, pericytes, astrocytes, neurons, and other cellular structures1. The flow of ions, chemicals, and cells between the blood and the brain is strictly regulated by this barrier. This homeostasis safeguards the nervous tissues against toxins and pathogens while also enabling the appropriate operation of the brain&#39;s nerves2,3. Maintaining the integrity of the BBB can effectively prevent the development and progression of disorders affecting the central nervous system, such as neuronal dysfunction, edema, and neuroinflammation4. However, the unique physiological properties of the BBB prevent more than 98% of small molecule medications and 100% of macromolecular pharmaceuticals from entering the central nervous system5. Therefore, increasing the penetration of medications through the BBB during the development of drugs for the central nervous system is essential for achieving therapeutic efficacy6,7. Even though computer simulation screening of substrates has significantly raised the probability of drug candidates crossing the BBB, reliable and affordable in vitro/in vivo BBB models are still needed to meet the needs of scientific research8.
A quick and affordable technique for high-throughput drug screening is the in vitro model9. To shed light on the fundamental processes of medicines&#39; effects on BBB function and their part in the development and progression of disease, a series of simplified in vitro BBB models has been created. At present, the common in vitro BBB models are the monolayer, co-culture, dynamic, and microfluidic models10,11,12, constructed by vascular endothelial cells and astrocytes, pericytes, or microglia13,14. Although 3D cell cultures are morein line with the physiological structure of BBB15, their application as a means of drug screening for BBB is still constrained by their intricate design and subpar reproducibility. In contrast, the monolayer in vitro model is the one most frequently used to research the BBB and is applicable for determining the expression of membrane transporters and tight junction proteins in particular cells.
Transmembrane electrical resistance (TEER) measurement is a technique to evaluate and monitor the layer of cells across the resistance and evaluate the cell integrity and permeability of the barrier. By simultaneously inserting two electrodes into the growth medium or buffer solution on either side of the monolayer, it is possible to measure the alternating current or electrical impedance through the cell&#39;s compact layer16,17. In order to determine whether the in vitro BBB model has been properly created, the measurement of TEER will usually be employed as the gold standard18. On the other hand, the trend of medication action on BBB permeability can be accurately predicted by measuring the change in electrical resistance of the cell layer after drug involvement19. For example, Feng et al. discovered that catalpol (the primary active monomer of rehmanniae) could effectively reverse the lipopolysaccharide-induced down-regulation of tight junction proteins in the BBB and raise the TEER value of the mouse brain endothelial cell layer20.
The neuroinflammatory response is usually the main cause of BBB homeostasis imbalance21. Hypoxic treatment to induce neuroinflammatory injury is the main method to destroy the blood-brain barrier, mainly including physical methods and chemical reagent methods. The former primarily utilizes a three-gas incubator to vary the oxygen content in the cell growth environment to simulate hypoxic conditions22,while the latter is achieved by artificially introducing deoxy reagents such as CoCl2 to the cell culture medium23. The cells will remain in a deoxygenated condition if Fe2+ is substituted for Co2+ in the heme. If Fe2+ is substituted for Co2+ in the catalytic group, proline hydroxylase and aspartate hydroxylase activity will be inhibited, resulting in an accumulation of hypoxia-inducible factor-1&#945; (HIF-1&#945;)24. Under persistent hypoxia, the dephosphorylation of HIF-1&#945; in the cytoplasm triggers cell death and activates vascular endothelial growth factor, which ultimately raises vascular permeability. In previous studies25,26, it has been well demonstrated that hypoxia can significantly reduce the expression of endothelial tight junction proteins to increase the permeability of BBB. In this study, the time-resistance curve of bEnd.3 cells seeded in 24-well plates were measured in order to create a straightforward BBB model. Using this model, we characterized the changes in cell TEER after CoCl2 intervention in order to construct a cell model that can be used to screen drugs for BBB protection.

מחבר זרקור: יישומים של זיהוי TEER להערכת שלמות מחסום התא 

רישום תקינות תפקודית של מחסום ב-bend.3 תאי אנדותל וסקולריים באמצעות זיהוי התנגדות חשמלית טרנסאנדותל

Current studies typically use permeability tests and associated protein expression to verify the accuracy of TEER detection. The BBB model of monolayer cells in virtue is less effective for drug screening, and the use of more cells makes it more difficult to construct the model. The protocol of this study is relatively simple, as the non-invasive procedure allows the cell samples to be used in other experiments after TEER detection.The detection of TEER to assess the permeability of cell models can accelerate the screening of drugs for treatment and prevention of the central nervous system to increase the success rate of new drug development. In the future, we will detect the expression of tight junction protein in upper compartment cells of chest wall to verify that TEER test results can effectively represent the integrity of BBB barrier function.

פרוטוקול זה איפשר רישום של שינויים בערכי ההתנגדות של תאים על פי הפרמטרים שנקבעו במד הנגד transendothelial. הכדאיות של תאי bEnd.3 (מספר התאים החיים) שטופלו בריכוזים שונים של CoCl2 נבדקה על ידי בדיקת CCK-8. נזק גדול יותר לתאים שנוצר על ידי CoCl2 היה מיוצג על ידי כדאיות תאים נמוכה יותר. מצאנו ש-300 מיקר...

Watch this Scientific Journal Video about Applications of TEER Detection to Assess Cell Barrier Integrity at JoVE.com

פרוטוקול זה מתאר מודל אמין ויעיל במבחנה של מחסום הדם במוח. השיטה משתמשת בתאי אנדותל של כלי דם מוחיים בעכבר bend.3 ומודדת התנגדות חשמלית טרנסממברנלית.

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

מחקרים נוכחיים משתמשים בדרך כלל בבדיקות חדירות ובביטוי חלבונים הקשור כדי לאמת את הדיוק של זיהוי TEER. מודל BBB של תאים חד-שכבתיים בסגולה פחות יעיל לבדיקת תרופות, והשימוש ביותר תאים מקשה על בניית המודל. הפרוטוקול של מחקר זה פשוט יחסית, שכן ההליך הלא פולשני מאפשר להשתמש בדגימות התאים בניסויים אחרים לאחר זיהוי TEER.הזיהוי של TEER כדי להעריך את החדירות של מודלים התא יכול להאיץ את ההקרנה של תרופות לטיפול ומניעה של מערכת העצבים המרכזית כדי להגדיל את שיעור ההצלחה של פיתוח תרופות חדשות. בעתיד, אנו נזהה את הביטוי של חלבון צומת הדוק בתאי התא העליון של דופן החזה כדי לוודא שתוצאות בדיקת TEER יכולות לייצג ביעילות את שלמות תפקוד מחסום BBB.

barrier-functional-integrity-recording-on-bend3-vascular-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

2.1K Views.  Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. מחקרים נוכחיים משתמשים בדרך כלל בבדיקות חדירות ובביטוי חלבונים הקשור כדי לאמת את הדיוק של זיהוי TEER. מודל BBB של תאים חד-שכבתיים בסגולה פחות יעיל לבדיקת תרופות, והשימוש ביותר תאים מקשה על בניית המודל. הפרוטוקול של מחקר זה פשוט יחסית, שכן ההליך הלא פולשני מאפשר להשתמש בדגימות ה...

Video: מחבר זרקור: יישומים של זיהוי TEER להערכת שלמות מחסום התא 

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating the interaction between restricted transit of harmful substances, nutrient absorption, and metabolite clearance in the brain, the BBB is essential in preserving central nervous system homeostasis. Building in vitro models of the BBB is a valuable tool for exploring the pathophysiology of neurological disorders and creating pharmacological treatments. This study describes a procedure for creating an in vitro monolayer BBB cell model by seeding bEnd.3 cells into the upper chamber of a 24-well plate. To assess the integrity of cell barrier function, the conventional epithelial cell voltmeter was used to record the transmembrane electrical resistance of normal cells and CoCl2-induced hypoxic cells in real-time. We anticipate that the above experiments will provide effective ideas for the creation of in vitro models of BBB and drugs to treat disorders of central nervous system diseases.

This protocol describes a dependable and efficient in vitro model of the brain blood barrier. The method uses mouse cerebral vascular endothelial cells bEnd.3 and measures transmembrane electrical resistance.

Culture of bEnd.3 Cells and Cell Viability After CoCl2 Treatment

Culture of bEnd.3 Cells and Cell Viability After CoCl2 Treatment  

To begin, prepare DMEM cell culture medium containing FBS, penicillin, and streptomycin. Also, prepare a 100 millimolar cobalt chloride stock solution by adding 1.30 milligrams of cobalt chloride to 100 microliters of DMSO. Next, seed one milliliter of BEND3 cells in a 100-milliliter culture dish containing DMEM medium and culture at 37 degrees Celsius in a humidified atmosphere of 5%carbon dioxide.Change the medium every two to three days and subculture the cells two times a week. After BEND3 cells grow to 80%confluence, digest the cells with 0.25%trypsin for 30 seconds. Count the cells using a cell counter and make a suspension of density seven times 10 to the fourth cells per milliliter.Then, seed 100 microliters of this cell suspension in a 96-well plate for cell adhesion. Then wash the cells with PBS and add 100 microliters of culture medium containing cobalt chloride. Culture the cells for 24 hours.After incubation, remove the medium and wash with PBS. Next, add 100 microliters of CCK-8 solution. Incubate the plates at 37 degrees Celsius for one hour, then measure the absorbance at 450 nanometers using a microplate reader.Calculate the cell viability induced by cobalt chloride according to this formula. Select the concentration with a significant difference in cell viability reduction compared with the control group. The viability of BEND3 cells treated with different concentrations of cobalt chloride was analyzed by CoCl2.The results indicated that 300 micromolar of cobalt chloride showed significant in vitro cytotoxicity.

תרבית של כיפוף.3 תאים ויכולת קיום של תאים לאחר טיפול ב-CoCl2

In Vitro Blood-Brain Barrier Model Assembly for Measurement of TEER

To begin, rinse the upper chamber of 24 well plates with PBS. Mix the BEND3 cells with DMEM medium using a vortex mixer to make a suspension. Then, seed 200 microliters of BEND3 cell suspension on the PET membrane in the upper chamber of a 24 well plate.Add 1, 200 microliters of complete medium to the lower chamber of the plate to stabilize the osmotic pressure of the upper and lower chambers. Change the medium by slowly removing the old medium from one side with a negative-pressure pipette and adding a new medium along the wall during fluid exchange. Before measuring TEER, place the resistor, 5%sodium hypochlorite solution, 75%ethanol, and double distilled water on an ultra clean table.Turn on the UV irradiation for 30 minutes to eliminate residual bacteria and pathogens. Place the electrodes in 5%sodium hypochlorite solution with slow shaking for three to five seconds. Then immerse in 75%ethanol for 15 minutes.Finally, transfer to PBS or double distilled water until use. Next, turn on the switch at the back of the cell resistor meter. Click Select Plate and Select 24 well plate.According to the operation, select the appropriate detection sequence. Insert a kilo ohm resistor into the right plug to calibrate the instrument. If the calibration result is 1000 plus minus 5 ohms, consider the instrument accurate.If not, click on Mode Units on the main interface to select Ohms and then click Calibrate. Then, remove the kilo ohm resistor and replace it with the measuring electrode using a connecting wire. Place the electrode vertically into the 24 well plate containing only medium and click Blank Handling on the instrument.The background value of the plate resistance without seated cells should be about 134.4 ohm. Next, insert the two electrodes into the upper and lower chambers of the seated plate, such that the cell layer is between them. Record the resistance value by gently stepping on the pedal.Make sure that the electrode does not touch the cells in the upper chamber and the bottom of the lower chamber. Obtain TEER values by multiplying electrical resistance values with the bottom area of the upper chamber, as shown in the equation. Draw a line plot of TEER versus time in days.When the resistance value does not increase with time, the cells have formed a barrier. The resistance values plotted versus time for BEND3 cells showed that the cell TEER values began to stabilize on the fifth day.

הרכבת מודל מחסום דם-מוח במבחנה למדידת TEER

Barrier Destruction and Statistical Analysis After TEER Measurement in an In Vitro Blood-Brain Barrier Model

Begin by culturing the BEND3 cells, then divide the wells into the control group and cobalt chloride group. Add 200 microliters of culture medium into the upper chamber of the control group and culture medium containing 300 micromolar cobalt chloride into the cobalt chloride group. Incubate the plates at 37 degrees Celsius and detect the resistance values at 12 and 24 hours of incubation using TEER method.Use commercial software to map the trend of TEER values of the cell barrier. Use statistical analysis software to analyze the difference in resistance values between cobalt chloride treated cells and control cells. Addition of 300 micromolar cobalt chloride resulted in a significant decrease in TEER values compared to the control at both the 12-hour and 24-hour time points.After 24 hours, the TEER value of 300 micromolar cobalt chloride group reduced compared to the control group, indicating breakdown of the cell barrier that was induced by hypoxic conditions due to cobalt chloride.