ברצוננו להודות ריאן Maneri (Oystercatcher Productions, LLC) עבור הצילומים ההליך שלנו רודני McPhail (מחלקת מדעי הביולוגיה, אוניברסיטת Purdue) לקבלת סיוע עם עריכת וידאו לנתיחה. מחקר במעבדה סוטר הוא נתמך על ידי מענקים מ-NIH (R01 NS049233) והמרכז Bindley Bioscience באוניברסיטת Purdue כדי DMS

פתרונות <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> L15-ASW תרבית תאים בינוניים (1 ליטר) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 שקית אבקת L15 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 800 מ&quot;ל של H 2 O ultrapure </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> NaCl 400 מ&quot;מ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MgSO 4 27 mM </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MgCl 2 28 מ&quot;מ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> L-גלוטמין 4 מ&quot;מ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גנטמיצין 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HEPES 5 מ&quot;מ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם ל-pH 7.9 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה אחר טיפה CaCl 2 9.3 מ&quot;מ (אם להפסיק משקעים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף H 2 O ultrapure כדי l 1 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק osmolarity (950-1000 mmol / ק&quot;ג) עם (Wescor, לחץ אדים # 5520) osmometer </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן 0.22 מיקרומטר באמצעות לחץ חיובי סינון יחידה (מסננים: SVGV010RS Millipore) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד 1 בחודש </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פולי-L-ליזין (70-150 KD) 200 מיקרוגרם / מניות פתרון מ&quot;ל סטרילי H 2 O ultrapure המשיך -20 o C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 מ MgCl 2 פתרון </li></ul> יום 1: Dissection של הגנגליון Aplysia בטן הכנת התמיסה דיסוציאציה האנזימטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול 90-10 מ&quot;ג Dispase אנזים (וורטינגטון, חתול: LS02111) בצינור Eppendorf </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 900 μl של המדיום ASW-L15 התרבות, 100 μl של סטרילית H 2 O ultrapure </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים ומניחים בטמפרטורת החדר (RT) </li></ol> Dissection של הגנגליון בטן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים מזרק 50 מ&quot;ל עם 0.5 פתרון M MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח חיה אחת פגז מטנק, לטפל בעדינות כדי למנוע הגנה דיות של החיה התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את Aplysia על צידו על לוח דיסקציה (קלקר board), בצד מקורי לצד, ממש הזנב שמאלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט לתוך החיה מאחורי הראש להזריק כל פתרון MgCl 2 לחלל הגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשפשף בעדינות את החיה לפזר את הפתרון MgCl 2 בכל חלל הגוף, לחכות כמה דקות על החיה להיות מורדם לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פין ראש וזנב של החיה על קרש החיתוך עם שתי מחטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים להרים העור, לחתוך דרך העור שכבת השריר במספריים גדולים לכיוון הראש והזנב לעשות פתח גדול בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את הגנגליון בטן תחת מברשת השחלה דמוי. שימוש במלקחיים כדי להחזיק את העצבים על חיבור 1 ס&quot;מ מול הגנגליון בטן, לחתוך את העצבים במספריים לנתיחה מול עמדת מלקחיים מחזיק מאחורי הגנגליון הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגנגליון המקום לתוך הפתרון Dispase ו דגירה של 15-16 שעות ב 22 ° C בעזרת אמבט מים בטמפרטורה מבוקרת. </li></ol> יום 2: ציפוי של תאים Aplysia שקית הכנה מרובה ליזין מצופה coverslips <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשנת ספסל זרימה, להכין שלושה 35mm בצלחות פטרי כמו עבודה כלים לניתוח של הגנגליון, למלא אותם עם בינוני 4 L15-ASW מ&quot;ל כל אחד. מעבירים את הגנגליון בטן מפתרון dispase לאחד את הכלים לעבוד אחרי 15.5 שעות של מערכת העיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים לקחת חומצה לניקוי # 1.5 coverslips (22x22 מ&quot;מ) לאחסן אתנול, להסיר אלכוהול לעקר coverslips ידי בוער להם בקצרה על מבער בונזן. תנו להם להתקרר בקצרה לפני הצבת coverslips לתוך הכלים תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת ציפוי קצה מעוקל על ידי כיפוף קצה צהוב מעל מבער בונזן (להבה לזמן קצר בלבד, כדי למנוע התכה של פלסטיק!). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הכמות המתאימה של 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל פתרון מרובה ליזין על ידי דילול 200 מיקרוגרם / מ&quot;ל מניות פתרון סטרילי עם H 2 O ultrapure. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי כל coverslip עם μl של 500 מיקרוגרם 20 / ml poly-ליזין דגירה במשך 20 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף כל coverslip 3-5 פעמים עם 500 μl סטרילי H 2 O ultrapure כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מים coverslips; למלא צלחת עם כל 4 מ&quot;ל של מדיום L15-ASW תרבות. </li></ol> דיסוציאציה של תאים בשקית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתיחה, לחתוך את הגנגליון בטן במחצית מספריים לנתיחה ו מלקחיים באמצעות ניקה בעבר עם אתנול 95% (איור 1 שורה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על חצי אחד של הגנגליון, לחתוך בין אשכול תיק התא בתאי hemiganglion (1 איור קו 2), לחתוך שלוחות העצבים שנותרו בצד השני של תאים שק (איור 1 שורה 3). עבודה על חצי אחד של גנגליון בכל פעם; לעזוב את החצי השני בצלחת ואילו תאים אשכול הראשונים הם להיות מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש בשתי מלקחיים (או אחד מלקחיים ומספריים דיסקציה), תיק שחרור תא מצרר על ידי לחיצה בצד את מעטפת רקמת החיבור שסביב אשכול תא שקית. גזור משם רקמת חיבור במספריים לנתיחה במידת הצורך. היזהרו לא לסחוט ולגעת אשכול תא שקית יותר מדי במהלך תהליך זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר רוב רקמת החיבור מוסר, להעביר את bאשכול AG תא לצלוחית עבודה חדש עם קצה צהוב כפוף מוכן קודם לכן. היזהרו שלא להניח את האשכול תא שקית להיות לכוד בתוך קצה צהוב או תקוע ממשק האוויר / בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Triturate אשכול עם קצה צהוב להסיר תאים תיק בודדים. לעשות זאת על ידי pipetting אשכול פנימה והחוצה של קצה. התחל עם כוחות גזירה נמוכים ולהגדיל כוח כנדרש. השתמש תמיד הכוח הנמוך ביותר הנדרש כדי להסיר את הנוירונים בלי להרוג תאים רבים מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף 3-5 תאים בריאים שקית ולהעבירם צלחת עם coverslip poly-ליזין מצופה. הימנע להרים תאים מתים (הם שחור / שקוף במרכז) ופסולת רקמת חיבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 6. מקום על 15-25 נוירונים חיים למרכז coverslip כל אחד. אם תאים מתים או פסולת מועברים גם להסיר את החומר לא רצויות על ידי מרים אותו או לפוצץ אותו הרחק תאים בריאים. תהליך זה לוקח בערך 2-3 שעות אשכולות שניהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם סיים לשמור את הכלים תרבות על הספסל תזרים לפחות 2 שעות RT כדי לאפשר לתאים לצרף (לשמור על הספסל את זרימת מפוח כדי למנוע רעידות לא רצויות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכלים לתוך באינקובטור ב 14 מעלות צלזיוס למשך הלילה, או עד לשימוש נוסף. קונוסים הצמיחה עשויה להתפתח 40-10 שעות. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/old/662_2008_2_10_0/image001.jpg" alt="באיור 1. סכמטי של הגנגליון californica Aplysia הבטן. קווי צבע לציין היכן לחתוך כדי להשיג תא אשכולות שקית." /> באיור 1. סכמטי של הגנגליון californica Aplysia הבטן. קווי צבע לציין היכן לחתוך כדי להשיג תא אשכולות שקית. יום 3: הגדרת תא הדמיה חיה של תאים Aplysia שקית האסיפה של הדמיה קאמרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש בתאי שקית ניסויים הדמיה לחיות התא, לבדוק תאים על מיקרוסקופ כוח נמוך. אם התאים לא פיתחו קונוסים צמיחה בריאה, אספקת אמצעי לעזוב טריים ב RT במשך 1-2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לספק צלחות עם המדיום L15-ASW טריים, להסיר וחצי (~ 2ml) של המדיום הישן עם קו ריק, ולהוסיף 2 מ&quot;ל חדש L15-ASW בינוני לכל צלחת פטרי. חשוב לא להסיר לחלוטין את כל מדיום מן המנה בבת אחת, כמו זה יהיה להסיר תאים coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הדמיה תא שקית, אנחנו להרכיב two coverslips ושני מפרידי הפלסטיק בתא כריך דמוי הדמיה. Coverslip העליון הכריך הוא חתך קצר יותר, כדי לאפשר חילופי קל בינוני ריאגנטים. במהלך האסיפה, coverslips עם תאים בתיק המצורף צריך להיות שקוע בינוני L15-ASW בכל עת כדי למנוע מתאי פירוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את החדר, לחתוך ~ 2 מ&quot;מ מן הצד הימני של מ&quot;מ coverslips # 1 22x22 עם יהלום עט (חותך זכוכית) השליט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק 1 מ&quot;ל, למרוח משחה ואקום גבוה לשני הצדדים של coverslip הקצר, ולצרף מפרידי פלסטיק לכל צד. למרוח משחה ואקום לחלק העליון של מפרידי שניהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היפוך coverslip והרכבה spacer, ואת המקום לתוך צלחת פטרי המכילה תאים תיק על coverglass. יישר ולחץ בעדינות עד מקל coverslip coverslip מלמעלה למטה עם סיום הפוכה של שני Q-טיפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, בעדינות להרים הרכבה כריך מתוך צלחת פטרי ללא המדיום דולף החוצה. יישור שתי coverslips, במידת הצורך, ולנגב את עודפי בינוני עם Kimwipe. מניחים את הכריך על החלק התחתון של מחזיק שקופיות מיקרוסקופ ולצרף את המכסה עם טיפול באמצעות קליפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את מרכז בצד העליון של כריך עם Q-טיפים טפחה על לניקוי זכוכית (Sparkle משמש לניקוי זכוכית). יבש במהירות את מנקה זכוכית עם השני, יבש Q-טיפ להימנע קווי פס. לעשות את אותו הדבר עבור coverslip התחתונה. Coverslips נקי ללא קווי פס חשובים הדמיה באיכות גבוהה. </li></ol> תיק תאים המיקרוסקופ מאז תא Aplysia שקית תרבויות עצביים נמצאים בצפיפות נמוכה, עדיף אם ההתקנה מיקרוסקופ שלך יש מיצוב הבמה פונקציות כדי להקל על המעבר בין התאים. תאים תיק יכולים להישמר בקלות במשך כמה שעות על הבמה RT במהלך הניסויים הדמיה. הבורסה בינוני מעת לעת, כדי למנוע אידוי.

<ol>
	<li>Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP+induces+changes+in+distribution+and+transport+of+organelles+within+growth+cones+of+Aplysia+bag+cell+neurons.">Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).</li><li>Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ig+superfamily+cell+adhesion+molecule,+apCAM,+mediates+growth+cone+steering+by+substrate-cytoskeletal+coupling.">The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling.</a> J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).</li><li>Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+and+actin+arcs+guide+the+assembly+and+transport+of+two+populations+of+microtubules+with+unique+dynamic+parameters+in+neuronal+growth+cones.">Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones.</a> J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).</li><li>Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+are+necessary+for+SRC+family+kinase-dependent+growth+cone+steering.">Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering.</a> Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).</li></ol>

תא Aplysia נוירונים תיק לספק סרום ללא מערכת העצבית עם תרבית תאים לא עצביים תאים בודדים. נוירונים אלה מהווים קונוסים צמיחה גדול מאוד מתאים לכתובת מספר שאלות חשובות תא ביולוגי. תא עצב תיק יכול בקלות להיות מניפולציות צילמו בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות. באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>#1 glass coverslips 22x22 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>48366067</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>#1.5 glass coverslips 22x22 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>Corning</td>
<td>2870-22</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 mm Petri dishes</td>
<td>Tool</td>
<td>Falcon</td>
<td>353001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filters for medium filtration</td>
<td>Tool</td>
<td>Millipore</td>
<td>SVGV010RS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High vacuum grease</td>
<td>Tool</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>1597418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Osmometer</td>
<td>Tool</td>
<td>Wescor</td>
<td>5520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic shims</td>
<td>Tool</td>
<td>Small Parts Inc </td>
<td>SHSP-200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>C79-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15750-060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H4030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L15 medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>41300-039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8540</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mallinckrodt</td>
<td>5958-04</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mallinckrodt</td>
<td>6070-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-L-lysine (70-150 kD) </td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mallinckrodt </td>
<td>7581</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neutral Protease (Dispase)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Worthington</td>
<td>LS02111</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

neuronal cell cultures from aplysia for high-resolution imaging of growth cones

קונוסים הצמיחה העצבית הם מבנים ניעתי מאוד בקצה של אקסונים כי ניתן לזהות רמזים הדרכה הסביבה transduce מידע זה לתנועה כיוונית לכיוון תא היעד המתאים. כדי להבין כיצד מידע והדרכה מועבר מתא השטח לרשתות הבסיסית cytoskeletal דינמי, צריך מערכת מודל מתאים הדמיה תא חי של הדינמיקה חלבון ברזולוציה של זמן ומרחב גבוהה. טיפוסית גביעי צמיחה חוליות קטנים מדי כדי לנתח באופן כמותי F-אקטין ודינמיקה microtubule. נוירונים של ארנבת ים Aplysia californica לפעמים 5-10 גדול יותר נוירונים החוליות, יכול בקלות להיות כל הזמן בטמפרטורת החדר הם תאים חזקים מאוד המיקרומניפולציה מדידות biophysical. קונוסים הצמיחה שלהם הגדירו מאוד אזורים cytoplasmic ומערכת היטב תיאר cytoskeletal. גופי התא העצבי יכול להיות microinjected עם מגוון רחב של בדיקות לחקר חרוט צמיחה תנועתיות והדרכה. בפרוטוקול הנוכחי אנחנו מדגימים נוהל דיסקציה של הגנגליון הבטן, תרבות של נוירונים תא שקית והקמת תא הדמיה הדמיה תא חי של קונוסים צמיחה.

Watch this Scientific Journal Video about Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones at JoVE.com

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Aplysia נוירונים californica לפתח קונוסים צמיחה גדול בתרבות כי הם מעולה עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של תנועתיות צמיחה חרוט והדרכה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתיחה ו ציפוי של תא עצב Aplysia התיק, כמו גם להקמת תא הדמיה תא חי.

תא תרבויות העצבית מ Aplysia עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של קונוסים צמיחה

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

neuronal-cell-cultures-from-aplysia-for-high-resolution-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K Views.  Purdue University. Aplysia נוירונים californica לפתח קונוסים צמיחה גדול בתרבות כי הם מעולה עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של תנועתיות צמיחה חרוט והדרכה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתיחה ו ציפוי של תא עצב Aplysia התיק, כמו גם להקמת תא הדמיה תא חי.

Video: Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

תרבויות עצבית ראשונית של המוח של Late Stage תסיסנית גלמים

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

הכנת תרבויות העצבית מ Midgastrula עוברים שלב תסיסנית

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. Addition of interleukin 2 to the culture media during the expansion phase is necessary to prevent cell death and sufficient to maintain short-term T cell lines but has been shown to increase Th1 polarization 3. Replacement of interleukin 2 by T cell growth factor (TCGF) which contains a mix of cytokines is more effective than interleukin 2 in maintaining long-term T cell lines in vitro 3. Moreover, TCGF can easily be prepared in large amounts in the laboratory and is much cheaper than recombinant interleukin 2. 
Here, we show how to prepare TCGF from rat splenocyte culture supernatants. For this procedure, we harvest spleens from naive Lewis rats euthanized for thymus and blood collection. We prepare single-cell suspensions from the spleens, lyze the red blood cells by osmotic shock, and seed the splenocytes in culture medium. The cells are stimulated with concanavalin A, a mitogen that non-selectively activates all rat T lymphocytes, inducing the production of cytokines. The culture supernantant is collected 48 hours later andexcess concanavalin A is bound to alpha methyl mannoside to prevent it from activating T cell lines to which TCGF will be added. The TCGF is then sterile-filtered, aliquoted, and stored at -20&deg;C.

We describe the preparation of T cell growth factor used for the in vitro expansion of antigen-specific rat T lymphocyte lines.

הכנת פקטור T צמיחת תאים מן Splenocytes עכברוש

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

וידאו ברזולוציה גבוהה של מעקב אחר תנועה של מבוגרים תסיסנית melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons. The neurons are large (up to 1 mm in diameter) and identifiable, with distinct sizes, shapes, positions and pigmentations, and the cell bodies are externally exposed in five paired ganglia distributed throughout the body of the animal. These properties have allowed investigators to delineate the circuitry underlying specific behaviors in the animal1. The monosynaptic connection between sensory and motor neurons is a central component of the gill-withdrawal reflex in the animal, a simple defensive reflex in which the animal withdraws its gill in response to tactile stimulation of the siphon. This reflex undergoes forms of non-associative and associative learning, including sensitization, habituation and classical conditioning. Of particular benefit to the study of synaptic plasticity, the sensory-motor synapse can be reconstituted in culture, where well-characterized stimuli elicit forms of plasticity that have direct correlates in the behavior of the animal2,3. Specifically, application of serotonin produces a synaptic strengthening that, depending on the application protocol, lasts for minutes (short-term facilitation), hours (intermediate-term facilitation) or days (long-term facilitation). In contrast, application of the peptide transmitter FMRFamide produces a synaptic weakening or depression that, depending on the application protocol, can last from minutes to days (long-term depression). The large size of the neurons allows for repeated sharp electrode recording of synaptic strength over periods of days together with microinjection of expression vectors, siRNAs and other compounds to target specific signaling cascades and molecules and thereby identify the molecular and cell biological steps that underlie the changes in synaptic efficacy.
An additional advantage of the Aplysia culture system comes from the fact that the neurons demonstrate synapse-specificity in culture4,5. Thus, sensory neurons do not form synapses with themselves (autapses) or with other sensory neurons, nor do they form synapses with non-target identified motor neurons in culture. The varicosities, sites of synaptic contact between sensory and motor neurons, are large enough (2-7 microns in diameter) to allow synapse formation (as well as changes in synaptic morphology) with target motor neurons to be studied at the light microscopic level.
In this video, we demonstrate each step of preparing sensory-motor neuron cultures, including anesthetizing adult and juvenile Aplysia, dissecting their ganglia, protease digestion of the ganglia, removal of the connective tissue by microdissection, identification of both sensory and motor neurons and removal of each cell type by microdissection, plating of the motor neuron, addition of the sensory neuron and manipulation of the sensory neurite to form contact with the cultured motor neuron.

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Primary cultures of Aplysia sensory-motor neurons provide a model preparation for studying synapse formation and synaptic plasticity in vitro. This video demonstrates the identification and microdissection of sensory and motor neurons from Aplysia ganglia as well as the methods for establishing and maintaining sensory-motor neurons in culture.

הכנת Aplysia חושי, מנוע תא תרבויות העצבית

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

תא תרבויות ראשי מ תסיסנית Gastrula עוברים

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentation is a periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic formation of blocks of tissue called somites along the body axis is evidence of a genetic oscillator patterning the developing embryo. In zebrafish, the intracellular clock driving segmentation is comprised of members of the Her/Hes transcription factor family organized into negative feedback loops. We have recently generated transgenic fluorescent reporter lines for the cyclic gene her1 that recapitulate the spatio-temporal pattern of oscillations in the presomitic mesoderm (PSM). Using these lines, we developed an in vitro culture system that allows real-time analysis of segmentation clock oscillations within single, isolated PSM cells. By removing PSM tissue from transgenic embryos and then dispersing cells from oscillating regions onto glass-bottom dishes, we generated cultures suitable for time-lapse imaging of fluorescence signal from individual clock cells. This approach provides an experimental and conceptual framework for direct manipulation of the segmentation clock with unprecedented single-cell resolution, allowing its cell-autonomous and tissue-level properties to be distinguished and dissected.

Somitogenesis is a rhythmic developmental process that spatially patterns the body axis of vertebrate embryos. Previously, we developed transgenic zebrafish lines that use fluorescent reporters to observe the cyclic genes that drive this process. Here, we culture dispersed cells from these lines and image their oscillations over time in vitro.

דור של תרביות תאים המפוזרים Presomitic המזודרם להדמיה של דג הזברה פילוח השעון בתאים בודדים

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

שיטת vivo לשעבר להדמיה ברזולוציה גבוהה של תנועתיות צילה במכרסמי Airway epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

באמצעות plusTipTracker תוכנה כדי למדוד microtubule Dynamics ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; קונוסים צמיחה

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...