עבודה במעבדה מעורבים culturing של Aplysia נוירונים ממומנת על ידי רשימה NIH R01 ו-NIH R21MH077921.

אופן ההכנה (ראה סעיף פתרונות בסוף פרוטוקול להרכב של פתרונות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו מאכלים תרבות. סמל זכוכית היטב צלחת זכוכית התחתונה תרבות Mattek עם פולי-L-ליזין (שנעשו borate נתרן). הוסף מספיק כדי לכסות לחלוטין את הזכוכית היטב לצאת&gt; 1 שעות (אפשר להשאיר למשך הלילה). ביסודיות להסיר את פולי-L-ליזין על ידי שטיפה במי ים מלאכותי (ASW) 4-5 פעמים. לאחר הסרת האחרון לשטוף, להוסיף 2 MLS של 50% L15 (בתוספת מלחים המכיל L-גלוטמין בריכוז הסופי של 2 מ&quot;מ) / hemolymph 50%. זה חייב להיות בינוני תרבות בצלחת למשך שעה אחת לפחות לפני תאים ציפוי כך מעילים hemolymph את המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את כלי ומנות Sylgard עם אתנול, לשטוף אותם ביסודיות עם DDH 2 0 ולאחר מכן למקם אותם על שעה 1&gt; תחת אור UV במנדף התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אלקטרודות חדה microdissection של נוירונים. בעזרת חולץ microelectrode (למשל סאטר Flaming בראון P-97), למשוך פיפטה אלקטרודות זכוכית בקוטר 1.5 מ&quot;מ החיצוניות, 0.86-1.12 מ&quot;מ קוטר פנימי 100 מ&quot;מ אורך (למשל AM קטלוג מערכת # 628000; מכשירים העולם Precision TW150-4, 1.55 / 1.12). שימוש בפרמטרים המייצרים אלקטרודה עם קצה קנס ארוך ומדובלל של עמידות גבוהה כך שאין צריכת נימי של נוזל כאשר הניח פתרון. הנוכחות של המניסקוס נוזל כלומר קצה האלקטרודה יפגע נוירון במהלך הבידוד. בישול אלקטרודה סאטר מספק הנחיות מעולה להקמת תוכניות אלקטרודה. אנו משתמשים בתיבת נימה, וכן צעד אחד למשוך לייצר אלקטרודות תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ההרדמה (0.35M MgCl2), בינוני תרבות (L15 בתוספת מלחים hemolymph), והפתרון פרוטאז (1% פרוטאז סוג IX, Sigma, 1 יחידה / מ&quot;ג, לריכוז סופי של 10 יחידות / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי חיים: להשתמש 80-100 גרם Aplysia מבוגר לבידוד של נוירונים חושית של נוירונים LFS המנוע. השתמש לנוער 1-4 גרם Aplysia עבור בידוד של L7 הנוירונים המנוע. הסר את החיות בעדינות את הטנקים ים, ולשמור במי ים (בדלי כוס, או שקית ניילון) לא יותר מ 30 דקות לפני תחילת ההרדמה נוהל תרבות. </li></ol> תרבות נוהל א pleural culturing עצב סנסורי 8-10 גרם Aplysia <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את החיות להסרת הגרעינים: להזריק 0.35 M MgCl 2 לתוך מבוגר Aplysia (8-10 גרם) באמצעות מזרק 60 מ&quot;ל עם מחט מד 18 1.5 אינץ. הזן את כף הרגל של החיה בזווית של כ 35 מעלות, לא להיכנס עמוק מדי. המטרה היא להזריק לתוך hemocoel של החיה בלי לחדור לאיברים הפנימיים. החיה צריכה להיות נפוחה מאוד רגוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנתחים את הגרעינים: פין החיה הרדים על צלחת לנתח, עם סיכה (18 מד מחטים לעבוד גם עבור חיות 80-100 גר &#39;) בראש ואת הזנב, ואת כף הרגל כלפי מעלה. החזיקו את כף הרגל עם מלקחיים שיניים לחתוך דרך העור ורקמות החיבור שבבסיס באורך מלא של כף הרגל (מן הראש אל הזנב) עם מספריים כירורגיות. הצמד את שני הצדדים כלפי מטה. בעזרת מלקחיים ומספריים, לחתוך את הוושט ולמשוך לצד לחשוף את הגרעינים. בעזרת מלקחיים ומספריים בסדר בסדר, לחתוך את הגרעינים דוושת פלאורלי (נוירונים חושיים הם בגרעיני פלאורלי). השאירו כמות נכבדה של עצב מאז זה מקל להצמיד את הגרעינים לאחר הטיפול פרוטאז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העיכול פרוטאז של הגרעינים: מניחים את הגרעינים בפתרון פרוטאז (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​יחידה 1 / מ&quot;ג L15) בערכת באינקובטור ב 34.5 מעלות צלזיוס (34-35 מעלות צלזיוס זה בסדר) עבור 2 שעות ו 15 דקות. משתמש קצה בסדר מלקחיים להעביר לשטוף את הגרעינים ב ASW שלוש פעמים. שמור את הגרעינים ב L15. שים לב כי זמן דגירה פרוטאז יכול להשתנות. המטרה היא לאפשר את רקמת החיבור להסירו בקלות. אם זה קשה מדי desheath הגרעינים מבלי לפגוע נוירונים, להגדיל את זמן הדגירה פרוטאז. אם זה קל מאוד desheath הגרעינים, לבין הנוירונים הם &quot;רכים&quot;, לצמצם את זמן הדגירה פרוטאז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Desheathing הגרעינים: העברת פרוטאז-מתעכל הגנגליונים 60 מ&quot;מ או 35 מ&quot;מ מאכל המכיל sylgard ו L15. צפייה במיקרוסקופ, סטריאו (עם תאורת הלוגן חיצוני), להסיר את הגרעינים ואת דוושת להצמיד את הגרעינים pleural בצלחת Sylgard בכיוון הנכון באמצעות סיכות חרקים מלקחיים בסדר. בעזרת מלקחיים בסדר מספריים Vanna כירורגית, בזהירות להרים את רקמת החיבור ופצע אותו לחשוף את אשכול חושית. היזהר שלא לגעת בכלל או נזק somata עצביים. הסר את כל רקמת החיבור עודפי המנה ולהוסיף בינוני יותר, כדי לוודא שלא לחשוף את הגנגליון desheathed לאוויר. אשכול חושית כוללת של כ 200 נוירונים מקובצים בקוטר 40-50 מיקרון. הגדר סיכה לעשות &quot;פוסט&quot; במרחק קצר מן ganglיון (בתחום של השקפה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של נוירונים: שימוש ארוך, אלקטרודה חד תרבות זכוכית, לשלוף את הנוירונים זיהו אחד אחד על ידי נגיעה בגוף התא ממש ליד מרכז (לא לדקור) ו לאט ובהתמדה משיכת סומה תא, יחד עם האקסון, הרחק גנגליון. לטפוח בעדינות על הפין כדי לסלק את הנוירונים של האלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוירונים ציפוי: השתמש pipetman (P10) להעביר נוירונים בודדים מצלחת לצלחת Sylgard תרבות. לפני העברת נוירונים, תרבות בינוני pipet אל קצה, כך קצה פלסטיק מצופה hemolymph (זה מונע את הנוירונים של דבק פלסטי). קח בזהירות רבה, כדי למנוע חשיפת נוירונים לכל בועות אוויר או כל כוחות קיצוניים (כלומר בעדינות לקחת את ולהסיר את הנוירונים מפני pipetteman). הפץ את הנוירונים באופן שווה על פני הצלחת. השתמש אלקטרודה חד בעדינות ישר התהליכים ברז אותם לתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה: השאר את הכלים על הבמה מיקרוסקופ בטמפרטורת החדר למשך לא פחות מ 3 שעות. אנו שגרתי להשאיר אותם בין לילה. ודא כי בשלב מיקרוסקופ הוא מוטרד בתקופה זו. מכסים את הבמה עם רדיד אלומיניום על מנת להגן מפני אור. בעדינות ולהעביר אותם ל 18 מעלות צלזיוס חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבויות צריך לדבוק המנה בתוך כ 3 שעות וצמיחה neurite חדש צריך להיות גלוי בתוך כ 6-12 שעות. הצמיחה של עצב סנסורי המבודדת מגיע לרמה של DIV 3 או 4. שים לב, עצב סנסורי מבודד איילה לא autapses טופס או סינפסות כימיות אחד עם השני, למרות שהם עושים חשמל טופס צמתים הפער. </li></ol> ב הכנת חושי נוירון-מנוע נוירון cocultures עצב סנסורי טופס סינפסה עם מנוע נוירונים היעד בתרבות. הנוירונים המנוע הנפוץ ביותר הם מנוע נוירונים LFS לבין הנוירון המוטורי L7, מן הגנגליון הבטן. המנוע נוירונים LFS מבודדים מבוגר (80-100 גרם) Aplysia, ויש כ 20 נוירונים LFS מנוע לכל הגנגליון הבטן. L7 המנוע נוירון מבודד נעורים (1-4 גרם) בעלי חיים, יש רק אחד L7 לכל הגרעינים הבטן. LFS הנוירונים המנוע הם 40-50 מיקרון בקוטר, משובצים בין עצב סנסורי LE קרוב לשורש העצב סיפון על פני השטח הגחון של בגרעיני בטן, מאופיינים כתם פיגמנט עדין חשוך כל סומה. L7 הנוירון המוטורי הוא 100-150 מיקרון בקוטר נמצא על פני השטח הגבי של הגנגליון, על קצה באמצע בצד שמאל של הגנגליון. אמנם זה חסכוני יותר להשתמש LFS הנוירונים המנוע, גודל גדול של הנוירון המוטורי L7 הוא יתרון עבור כמה ניסויים. המנוע L11 נוירון, גם על פני השטח שמאל הגנגליון הגבי של הבטן, הזנב ל L7, הוא nontarget הנוירון המוטורי ניתן להשתמש ביעילות כביקורת שבה נוירון חושי fasciculates אבל לא בצורה סינפסות כימיות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את החיות להסרת הגרעינים. עבור נוירונים LFS המנוע, לעשות כפי שתואר על עצב סנסורי פלאורלי. עבור L7 הנוירונים המנוע, להזריק 0.35 M MgCl 2 לתוך נעורים Aplysia (1-4 גרם) באמצעות מזרק 10 מ&quot;ל עם מחט 21-מד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנתחים את הגרעינים בטן: פין החיה הרדים על צלחת לנתח כמתואר לעיל (באמצעות 21 מחטים מד לבעלי חיים נעורים). בעזרת מלקחיים ומספריים בסדר בסדר, לחתוך את הגרעינים הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העיכול פרוטאז של הגרעינים: זה נעשה כפי שתואר על עצב סנסורי פלאורלי, פרט לכך את הזמן העיכול מצטמצם 45 דקות 1 שעה עבור הגרעינים מן נעורים (1-4 גרם) בעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Desheathing הגרעינים: העברת פרוטאז-מתעכל הגרעינים אל צלחת 35 או 60 מ&quot;מ המכיל sylgard ו L15. צפייה במיקרוסקופ, סטריאו (עם תאורת הלוגן חיצוני), בגרעיני מטה בצלחת Sylgard בכיוון הנכון באמצעות סיכות חרקים מלקחיים בסדר. בעזרת מלקחיים בסדר מספריים Vanna כירורגית, בזהירות להרים את רקמת החיבור ופצע אותו לחשוף את גופי התא העצבי. כדי לבודד את המנוע נוירונים LFS, הסיכה הגנגליון כך את פני השטח הגחון הוא פונה כלפי מעלה, עם מלקחיים למשוך את נדן רקמת החיבור בחזרה לחשוף את המחצית כולה הגנגליון המכיל את המנוע LFS נוירונים (מימין), desheath החלקים הנותרים של הגנגליון, להסיר את כל רקמת החיבור של המנה ולהוסיף L15 יותר. כדי לבודד את L7 או L11 הנוירון המוטורי, הסיכה הגנגליון כך את פני השטח הגבי פונה כלפי מעלה, עם מלקחיים למשוך את נדן רקמת החיבור בחזרה לחשוף את מחצית הגנגליון המכיל גם L7 L11 ו (שמאלה). היזהר שלא לגעת בכלל או נזק somata עצביים. המקום סיכה לעשות &quot;פוסט&quot; במרחק קצר מן הגנגליון (בתחום של השקפה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של נוירונים: הסר נוירונים עם אלקטרודה חדה כפי שתואר על עצב סנסורי. הנוירונים הם LFS הבדלerentiated מן השכנות נוירונים LE חושית על בסיס של מקום קטן פיגמנט כהה somata שלהם. הנוירון L7 ניתן להבדיל בין תא עצב L11 L11 הראשון כי הוא הזנב ל L7, כי הגוף L11 התא מלבני יותר בכושר, בעוד L7 גוף התא הוא עגול ומשום האקסון L11 נוטה לתוך סניף קרוב פעמיים עד התא גוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוירונים ציפוי: השתמש pipetman (P10) להעביר נוירונים בודדים מצלחת לצלחת Sylgard תרבות כפי שמתואר על עצב סנסורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיווג עם עצב סנסורי: תן את הנוירונים המנוע לדבוק המנה תרבות עבור שעה לפחות 1. ואז להוסיף את עצב סנסורי מבודד עם pipetman, אספקת כל נוירון סנסורי בסמוך נוירון מנוע מצופה. בעזרת כוס חד האלקטרודה בזהירות ליישר את האקסון נוירון חושי, ומשדלת את הגוף תא חושית למיקום ליד הנוירון המוטורי, במרחק שווה או מעט פחות מ אורך האקסון לתא חושית. באמצעות אלקטרודת הזכוכית, לפתות את האקסון חושית לבוא במגע עם הנוירון המוטורי, מאוד בעדינות בעזרת הצד של האלקטרודה קוני סוף סוף יש את האקסון החושית פיזית לפנות האקסון של הנוירון המוטורי. לא להרים את המנה תרבות, אלא להחליק בעדינות את המנה לאורך הבמה מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו את הכלים על הבמה מיקרוסקופ בטמפרטורת החדר למשך לא פחות מ 3 שעות והעברה 18 ° C חממה כפי שתואר על עצב סנסורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבויות צריך לדבוק המנה בתוך כ 3 שעות וצמיחה neurite חדש צריך להיות גלוי בתוך כ 6-12 שעות. עצב סנסורי טופס glutamatergic סינפסות עם נוירונים המנוע מהר מאוד - ברגע התא הם חסיד מספיק כדי לבצע הקלטה אלקטרודה חדה (3-5 שעות), מעוררות פוטנציאל פוסט סינפטי ניתן להקליט. קישוריות Synaptic ממשיכה לגדול עד DIV 3, אז היא יציבה עד DIV7. הנוירונים צריך להראות תוצאה neurite לפרט במהלך 1-3 הימים הראשונים בתרבות. </li></ol> ג הכנת Hemolymph Hemolymph משמש כגורם גדילה בתרבות Aplysia (מקביל השימוש בסרום עגל עוברי יונקים בתרבית תאים). זה שנאספו (500 גרם, 1 ק&quot;ג) בעלי חיים גדולים, הזמן הטוב ביותר לאסוף hemolymph (anecdotally) היא באביב (אמצע מרץ עד יוני). לעטוף את החיה underpad הפנויה, כך שרק חלק קטן של החיה היא חשופה, לנקות אותו חלק של העור עם אתנול, ולאחר מכן להחזיק אותו בשעה שאדם אחר משתמש סכין גילוח סטרילי לבצע חתך באזור חשוף. לסחוט את בעל החיים, כך מתיז hemolymph לתוך מבחנה נקייה, מוודא שזה לא קשר את העור מלוכלך של החיה. Hemolymph ממלא את hemocoel של בעל החיים (כלומר, החיה היא בעצם שק של hemolymph). Rewrap החיה פעם או פעמיים, לעשות חתך חדשים לסחוט קשה לאסוף hemolymph ככל האפשר (לאסוף בכוס חדשה, כך שאם הוא הופך להיות מזוהמים, את האוסף הראשון הוא עדיין שמיש). Hemolymph מבעל חיים אחד צריך להישמר בנפרד (כלומר, לא hemolymph בריכה מבעלי חיים שונים). ספין hemolymph XG ב 2000 ל 10 דקות להסיר את כדוריות הדם. Supernatant Aliquot ב 10 aliquots מ&quot;ל, התווית על ידי בעלי חיים החנות ב -80 ° C. שים לב hemolymph המאוחסן -20 ° C ומהווה לזרז בינוני. Aliquot חדשה של hemolymph יש להשתמש בכל אמצעי תרבות זמן מוכן, ואת aliquot צריך להיות מופשר רק לקראת הכנת בינוני. אל refreeze לאחר ההפשרה.

<ol>
	<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+memory+storage:+a+dialogue+between+genes+and+synapses.">The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses.</a> Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).</li><li>Rayport, S. G., Schacher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+in+vitro:+cell+culture+of+identified+Aplysia+neurons+mediating+short-term+habituation+and+sensitization.">Synaptic plasticity in vitro: cell culture of identified Aplysia neurons mediating short-term habituation and sensitization.</a> J Neurosci. 6 (3), 759-763 (1986).</li><li>Goldberg, D. J., Schacher, S., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , 213-236 (1998).</li><li>Glanzman, D. L., Kandel, E. R., Schacher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identified+target+motor+neuron+regulates+neurite+outgrowth+and+synapse+formation+of+aplysia+sensory+neurons+in+vitro.">Identified target motor neuron regulates neurite outgrowth and synapse formation of aplysia sensory neurons in vitro.</a> Neuron. 3 (4), 441-450 (1989).</li><li>Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+and+mRNA+localization+in+cultured+Aplysia+neurons.">Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons.</a> Neuron. 49 (3), 349-356 (2006).</li><li>Martin, K. C., Casadio, A., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse-specific,+long-term+facilitation+of+aplysia+sensory+to+motor+synapses:+a+function+for+local+protein+synthesis+in+memory+storage.">Synapse-specific, long-term facilitation of aplysia sensory to motor synapses: a function for local protein synthesis in memory storage.</a> Cell. 91 (7), 927-938 (1997).</li><li>Guan, Z., Giustetto, M., Lomvardas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+long-term-memory-related+synaptic+plasticity+involves+bidirectional+regulation+of+gene+expression+and+chromatin+structure.">Integration of long-term-memory-related synaptic plasticity involves bidirectional regulation of gene expression and chromatin structure.</a> Cell. 111 (4), 483-493 (2002).</li></ol>

הכנה מוצלחת של Aplysia חושית מוטורית תרבויות יש עקומת למידה איטי במקצת, שכן הוא כרוך בפיתוח המוטוריקה העדינה קשורה microdissection ומניפולציה של נוירונים בודדים נצפים מבעד למיקרוסקופ, סטריאו. מניסיוננו, זה לוקח כ 1-3 שבועות של תרגול כדי להשיג בריא עצב סנסורי בודד בתרבות 1-3 ש...

הפתרונות הדרושים תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.35 מ MgCl 2, לאחסן בטמפרטורת החדר, המשמש להרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פולי-L-ליזין פתרון, סיגמא: P-1524, MW&gt; 300000, תוצרת 0.1M נתרן borate pH8.2 כדי 0.5mg/ml פתרון. וורטקס היטב ולסנן לעקר דרך מסנן 0.22 מיקרומטר, לאחסן אותו ° 4C. אין להקפיא להפשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבקת L-15 בינוני (ליבוביץ) (סיגמא: L4386) בתוספת מלחים להלן כדי להפוך 1 ליטר <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> L-15 אבקת </td><td> 13.8g </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 15.4 גרם </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> 6.24 גר &#39; </td></tr><tr><td> MgSO 4 7H 2 0 </td><td> 6.45g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 350 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 170 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> MgCl 2 6 שעות 2 O </td><td> 5.49 גר &#39; </td></tr><tr><td> CaCl 2 2H 2 O </td><td> 1.43g </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 3.53g </td></tr></table> הוסף ddH20 עד 1 ליטר. PH צריך להיות על 7.4-7.5, להוסיף 10 מ&quot;ל של תמיסת פן / סטרפטוקוקוס 100x, ולסנן-לעקר דרך מסנן 0.22 מ &#39;. חנות ב 4C0 לא יותר מחודש 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העיכול פרוטאז פתרון: 1% פרוטאז IX (1unit/mg) הוא עשה L15 (בתוספת מלחים לעיל) או ASW מיד לפני השימוש, פילטר עיקור באמצעות 0.22 מ &#39;Millipore. 5mls צריך להיות מספיק בשביל הגרעינים משני בעלי חיים (לוודא את הגרעינים שקועים לחלוטין פתרון פרוטאז). סיגמא יש דיווחו כי תפסיק למכור פרוטאז IX. פרוטאז הוא תחליף: Dispase II (Roche Applied Science קטלוג # 04942078001). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות בינוני. מיד לפני הכנת תרבויות, הפשרה aliquot 10 מ&quot;ל של hemolymph ומערבבים אותו עם 10 MLS של L15 (בתוספת מלחים לעיל) כדי להפוך בינוני תרבות 20mls. הוסף 200 μl של 200mm L-גלוטמין, מערבבים היטב להשתמש להכנת תרבויות. בינוני זה אמור להיות מוכן טרי כל התרבויות הזמן נעשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מי ים מלאכותיים יכול להתבצע מיידית מן האוקיינוס ​​(אקווריום מערכות, מנטור, OH) או כדלקמן: 450 mM NaCl, KCl 10 mM, 30 מ&quot;מ MgCl 2 (6 שעות 2 O), 20 מ&quot;מ MgSO 4, 10 mM CaCl 2 (2H 2 O), HEPES 10 מ&quot;מ, עם pH 7.4 המותאמת. </li></ol>

preparation of aplysia sensory-motor neuronal cell cultures

מערכת העצבים של רכיכה ימית Aplysia californica היא פשוטה יחסית, בהיקף של כ -20,000 נוירונים. הנוירונים הם גדולים (עד 1 מ&quot;מ קוטר) לזיהוי, עם גדלים, צורות שונות, עמדות pigmentations, ואת גופי התא נחשפים מבחוץ בגרעיני five לזווג מופץ בכל רחבי הגוף של החיה. תכונות אלו אפשרו לחוקרים לשרטט את המעגלים החשמליים הבסיסיים התנהגויות ספציפיות החיה 1. הקשר בין הנוירונים monosynaptic החושי והמוטורי היא מרכיב מרכזי של רפלקס הזימים-הנסיגה בשנת החיה, רפלקס הגנתי פשוט שבו החיה תיסוג הזימים שלו בתגובה לגירוי חוש המישוש של הסיפון. רפלקס זה עובר צורות של למידה בלתי אסוציאטיביים אסוציאטיבי, כולל רגישות, התרגלות ועל התניה קלאסית. תועלת מיוחדת ללימוד הפלסטיות הסינפטית, בסינפסה חושית מוטורית ניתן מחדש בתרבות, שם היטב מאופיין גירויים להפיק צורות פלסטיות כי יש מקבילות ישיר בהתנהגות של החיה 2,3. באופן ספציפי, יישום של סרוטונין מייצרת חיזוק הסינפטי, בהתאם לפרוטוקול הבקשה, נמשך דקות (לטווח קצר סיוע), שעות (טווח ביניים סיוע) או ימים (לטווח ארוך סיוע). לעומת זאת, יישום FMRFamide את המשדר פפטיד מייצרת היחלשות דיכאון סינפטיים או, בהתאם לפרוטוקול הבקשה, יכול להימשך בין דקות יום (לטווח ארוך דיכאון). גודל גדול של נוירונים מאפשר הקלטה חזר אלקטרודה חדה של חוזק סינפטי על פני תקופות של ימים יחד עם microinjection של וקטורים הביטוי, siRNAs ותרכובות אחרות למקד מפלי איתות ספציפיים מולקולות ובכך לזהות את השלבים ביולוגי מולקולרית של התא העומדים בבסיס השינויים ביעילות סינפטית. יתרון נוסף של מערכת התרבות Aplysia נובעת מהעובדה כי הנוירונים סינפסה להפגין-סגוליות בתרבות 4,5. לפיכך, עצב סנסורי לא יוצרים סינפסות עם עצמם (autapses) או עם עצב סנסורי אחרים, ואין הם יוצרים סינפסות עם יעד שאינו הנוירונים המנוע מזוהה בתרבות. ורידים, אתרים של הקשר הסינפטי בין הנוירונים החושי והמוטורי, הם גדולים מספיק (2-7 מיקרון בקוטר) כדי לאפשר היווצרות הסינפסה (כמו גם שינויים במורפולוגיה הסינפטי) עם הנוירונים המנוע היעד להיחקר ברמה המיקרוסקופית אור. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את כל שלב הכנת חושית מוטורית תרבויות נוירון, כולל הרדמה מבוגר ו Aplysia נעורים, לנתח הגרעינים שלהם, העיכול פרוטאז של הגרעינים, הסרת רקמת החיבור ידי microdissection, זיהוי של שני נוירונים החושי והמוטורי והסרה של כל סוג תא ידי microdissection, ציפוי של הנוירון המוטורי, תוספת של הנוירון מניפולציה חושית של neurite החושי כדי ליצור קשר עם תרבות מוטורית נוירון.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures at JoVE.com

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

תרבויות ראשונית של<em&gt; Aplysia</em&gt; חושית מוטורית נוירונים לספק הכנת מודל לחקר היווצרות הסינפסה ואת הפלסטיות הסינפטית<em&gt; במבחנה</em&gt;. וידאו זה מדגים את זיהוי microdissection של נוירונים החושי והמוטורי מ<em&gt; Aplysia</em&gt; הגרעינים, כמו גם את השיטות לקביעת ושמירה על חושית, מוטורית נוירונים בתרבית.

הכנת Aplysia חושי, מנוע תא תרבויות העצבית

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

preparation-of-aplysia-sensory-motor-neuronal-cell-cultures

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

15.9K Views.  University of California, Los Angeles. תרבויות ראשונית של Aplysia חושית מוטורית נוירונים לספק הכנת מודל לחקר היווצרות הסינפסה ואת הפלסטיות הסינפטית במבחנה. וידאו זה מדגים את זיהוי microdissection של נוירונים החושי והמוטורי מ Aplysia הגרעינים, כמו גם את השיטות לקביעת ושמירה על חושית, מוטור?...

Video: Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

תא תרבויות העצבית מ Aplysia עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של קונוסים צמיחה

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific molecular mechanisms are identified, new therapeutic strategies can be developed to treat abnormalities in specific behaviors caused by degenerative diseases or aging of the nervous system. The marine snail Aplysia californica is well suited for the investigations of cellular and molecular basis of behavior because neural circuitry underlying a specific behavior could be easily determined and the individual components of the circuitry could be easily manipulated. These advantages of Aplysia have led to several fundamental discoveries of neurobiology of learning and memory. Here we describe a preparation of the Aplysia nervous system for the electrophysiological and molecular analyses of individual neurons. Briefly, ganglion dissected from the nervous system is exposed to protease to remove the ganglion sheath such that neurons are exposed but retain neuronal activity as in the intact animal. This preparation is used to carry out electrophysiological measurements of single or multiple neurons. Importantly, following the recording using a simple methodology, the neurons could be isolated directly from the ganglia for gene expression analysis. These protocols were used to carry out simultaneous electrophysiological recordings from L7 and R15 neurons, study their response to acetylcholine and quantitating expression of CREB1 gene in isolated single L7, L11, R15, and R2 neurons of Aplysia.

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

Marine snail Aplysia californica has been widely used as a neurobiology model for the studies on cellular and molecular basis of behavior. Here a methodology is described for exploring the nervous system of Aplysia for the electrophysiological and molecular analyses of single neurons of identified neural circuitry.

אקליפסיה (1991) הכנת גנגליה לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של נוירונים בודדים

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

Bioengineering

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., homosynaptic facilitation) 1. These hypotheses can be tested by simultaneously monitoring changes in intracellular calcium and alterations in synaptic efficacy. We demonstrate how this can be accomplished by combining calcium imaging with intracellular recording techniques. Our experiments are conducted in a buccal ganglion of the mollusc Aplysia californica. This preparation has a number of experimentally advantageous features: Ganglia can be easily removed from Aplysia and experiments use adult neurons that make normal synaptic connections and have a normal ion channel distribution. Due to the low metabolic rate of the animal and the relatively low temperatures (14-16 &deg;C) that are natural for Aplysia, preparations are stable for long periods of time. 
To detect changes in intracellular free calcium we will use the cell impermeant version of Calcium Orange 2 which is easily 'loaded' into a neuron via iontophoresis. When this long wavelength fluorescent dye binds to calcium, fluorescence intensity increases. Calcium Orange has fast kinetic properties 3 and, unlike ratiometric dyes (e.g., Fura 2), requires no filter wheel for imaging. It is fairly photo stable and less phototoxic than other dyes (e.g., fluo-3) 2,4. Like all non-ratiometric dyes, Calcium Orange indicates relative changes in calcium concentration. But, because it is not possible to account for changes in dye concentration due to loading and diffusion, it can not be calibrated to provide absolute calcium concentrations. 
An upright, fixed stage, compound microscope was used to image neurons with a CCD camera capable of recording around 30 frames per second. In Aplysia this temporal resolution is more than adequate to detect even a single spike induced alteration in the intracellular calcium concentration. Sharp electrodes are simultaneously used to induce and record synaptic transmission in identified pre- and postsynaptic neurons. At the conclusion of each trial, a custom script combines electrophysiology and imaging data. To ensure proper synchronization we use a light pulse from a LED mounted in the camera port of the microscope. Manipulation of presynaptic calcium levels (e.g. via intracellular EGTA injection) allows us to test specific hypotheses, concerning the role of intracellular calcium in mediating various forms of plasticity.

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

We demonstrate how changes in the intracellular free calcium concentration and synaptic efficacy can be simultaneously monitored in a ganglion preparation of Aplysia. We image intracellular calcium using a fluorescent dye, Calcium Orange, and induce and monitor synaptic transmission with sharp (intracellular) electrodes.

מעקב אחר שינויים בריכוז הסידן התאיים ויעילות הסינפטית ברכיכות<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

Neuroscience

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

Multifunctionality, the ability of one peripheral structure to generate multiple, distinct behaviors1, allows animals to rapidly adapt their behaviors to changing environments. The marine mollusk Aplysia californica provides a tractable system for the study of multifunctionality. During feeding, Aplysia generates several distinct types of behaviors using the same feeding apparatus, the buccal mass. The ganglia that control these behaviors contain a number of large, identified neurons that are accessible to electrophysiological study. The activity of these neurons has been described in motor programs that can be divided into two types, ingestive and egestive programs, based on the timing of neural activity that closes the food grasper relative to the neural activity that protracts or retracts the grasper2. However, in isolated ganglia, the muscle movements that would produce these behaviors are absent, making it harder to be certain whether the motor programs observed are correlates of real behaviors. In vivo, nerve and muscle recordings have been obtained corresponding to feeding programs2,3,4, but it is very difficult to directly record from individual neurons5. Additionally, in vivo, ingestive programs can be further divided into bites and swallows1,2, a distinction that is difficult to make in most previously described in vitro preparations.
The suspended buccal mass preparation (Figure 1) bridges the gap between isolated ganglia and intact animals. In this preparation, ingestive behaviors - including both biting and swallowing - and egestive behaviors (rejection) can be elicited, at the same time as individual neurons can be recorded from and stimulated using extracellular electrodes6. The feeding movements associated with these different behaviors can be recorded, quantified, and related directly to the motor programs. The motor programs in the suspended buccal mass preparation appear to be more similar to those observed in vivo than are motor programs elicited in isolated ganglia. Thus, the motor programs in this preparation can be more directly related to in vivo behavior; at the same time, individual neurons are more accessible to recording and stimulation than in intact animals. Additionally, as an intermediate step between isolated ganglia and intact animals, findings from the suspended buccal mass can aid in interpretation of data obtained in both more reduced and more intact settings. The suspended buccal mass preparation is a useful tool for characterizing the neural control of multifunctionality in Aplysia.

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

We describe a technique to extracellularly record and stimulate from nerves, muscles, and individual identified neurons in vitro while eliciting and observing different types of feeding behaviors in the feeding apparatus of Aplysia.

<em&gt; במבחנה</em&gt; הכנה להפקה והקלטה של ​​תוכניות רכב האכלה עם תנועות פיסיולוגיות<em&gt; Aplysia californica</em

Multifunctionality, the ability of one peripheral  structure to generate multiple, distinct behaviors1, allows animals  to rapidly adapt their behaviors ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extracellularly זיהוי תאי עצב מוטורי לשריר בברכת מוטור<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Much information about the coupling of presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained from invertebrate preparations, most notably the squid giant synapse1. However, except for the preparation described here, few vertebrate preparations exist in which it is possible to make simultaneous measurements of neurotransmitter release and presynaptic ionic currents. Embryonic Xenopus motoneurons and muscle cells can be grown together in simple culture medium at room temperature; they will form functional synapses within twelve to twenty-four hours, and can be used to study nerve and muscle cell development and synaptic interactions for several days (until overgrowth occurs). Some advantages of these co-cultures over other vertebrate preparations include the simplicity of preparation, the ability to maintain the cultures and work at room temperature, and the ready accessibility of the synapses formed2-4. The preparation has been used widely to study the biophysical properties of presynaptic ion channels and the regulation of transmitter release5-8. In addition, the preparation has lent itself to other uses including the study of neurite outgrowth and synaptogenesis9-12, molecular mechanisms of neurotransmitter release13-15, the role of diffusible messengers in neuromodulation16,17, and in vitro synaptic plasticity18-19.

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

This video demonstrates the procedures used to grow primary cultures of embryonic Xenopus nerve and muscle cells and the usefulness of this preparation for making simultaneous pre- and post-synaptic patch clamp recordings.

סימולטני טרום והקלטת אלקטרו פוסט סינפטי מ<em&gt; Xenopus</em&gt; עצבי שרירי Co-תרבויות

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

בידוד של נוירונים חושיים של<em&gt; Aplysia californica</em&gt; להקלטות מהדק תיקון של זרמי glutamatergic

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA (&#947;-aminobutyric acid) is the predominant inhibitory neurotransmitter in the brain. It is released from the presynaptic terminals of inhibitory neurons within highly specialized intercellular junctions known as synapses, where it binds to GABAA receptors (GABAARs) present at the plasma membrane of the synapse-receiving, postsynaptic neurons. Activation of these GABA-gated ion channels leads to influx of chloride resulting in postsynaptic potential changes that decrease the probability that these neurons will generate action potentials. 
During development, diverse types of inhibitory neurons with distinct morphological, electrophysiological and neurochemical characteristics have the ability to recognize their target neurons and form synapses which incorporate specific GABAARs subtypes. This principle of selective innervation of neuronal targets raises the question as to how the appropriate synaptic partners identify each other. 
To elucidate the underlying molecular mechanisms, a novel in vitro co-culture model system was established, in which medium spiny GABAergic neurons, a highly homogenous population of neurons isolated from the embryonic striatum, were cultured with stably transfected HEK293 cell lines that express different GABAAR subtypes. Synapses form rapidly, efficiently and selectively in this system, and are easily accessible for quantification. Our results indicate that various GABAAR subtypes differ in their ability to promote synapse formation, suggesting that this reduced in vitro model system can be used to reproduce, at least in part, the in vivo conditions required for the recognition of the appropriate synaptic partners and formation of specific synapses. Here the protocols for culturing the medium spiny neurons and generating HEK293 cells lines expressing GABAARs are first described, followed by detailed instructions on how to combine these two cell types in co-culture and analyze the formation of synaptic contacts.

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

The molecular mechanisms that co-ordinate the formation of inhibitory GABAergic synapses during ontogeny are largely unknown. To study these processes,we have developed a co-culture model system which incorporates embryonic medium spiny GABAergic neurons cultured together with stably transfected human embryonic kidney 293 (HEK293) cells expressing functional GABAA receptors.

היווצרות הסינפסה מעכבת בשיתוף תרבות נוירונים דגם שילוב GABAergic בינוני קוצניים וHEK293 תאים ביציבות להביע GABA<sub&gt;</sub&gt; רצפטורים

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and &ldquo;Neuron Ball&rdquo; Culture

During neuronal development, synapse formation is an important step to establish neural circuits. To form synapses, synaptic proteins must be supplied in appropriate order by transport from cell bodies and/or local translation in immature synapses. However, it is not fully understood how synaptic proteins accumulate in synapses in proper order. Here, we present a novel method to analyze presynaptic formation by using the combination of neuron ball culture with beads to induce presynapse formation. Neuron balls that is neuronal cell aggregates provide axonal sheets far from cell bodies and dendrites, so that weak fluorescent signals of presynapses can be detected by avoiding overwhelming signals of cell bodies. As beads to trigger presynapse formation, we use beads conjugated with leucine-rich repeat transmembrane neuronal 2 (LRRTM2), an excitatory presynaptic organizer. Using this method, we demonstrated that vesicular glutamate transporter 1 (vGlut1), a synaptic vesicle protein, accumulated in presynapses faster than Munc18-1, an active zone protein. Munc18-1 accumulated translation-dependently in presynapse even after removing cell bodies. This finding indicates the Munc18-1 accumulation by local translation in axons, not transport from cell bodies. In conclusion, this method is suitable to analyze accumulation of synaptic proteins in presynapses and source of synaptic proteins. As neuron ball culture is simple and it is not necessary to use special apparatus, this method could be applicable to other experimental platforms.

Presynapse formation is a dynamic process including accumulation of synaptic proteins in proper order. In this method, presynapse formation is triggered by beads conjugated with a presynapse organizer protein on axonal sheets of &#8220;neuron ball&#8221; culture, so that accumulation of synaptic proteins is easy to be analyzed during presynapse formation.

שיטת היווצרות טרום-סינפסה באמצעות חרוזי סדרן ותרבות "תא כדור"

During neuronal development, synapse formation is an important step to establish neural circuits. To form synapses, synaptic proteins must be supplied in ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, assembly and activity-dependent plasticity. Giant ankyrin-G, the master organizer of AIS, directly associates with membrane-spanning voltage gated sodium (VSVG) and potassium channels (KCNQ2/3), as well as 186 kDa neurofascin, a L1CAM cell adhesion molecule. Giant ankyrin-G also binds to and recruits cytoplasmic AIS molecules including beta-4-spectrin, and the microtubule-binding proteins, EB1/EB3 and Ndel1. Giant ankyrin-G is sufficient to rescue AIS formation in ankyrin-G deficient neurons. Ankyrin-G also includes a smaller 190 kDa isoform located at dendritic spines instead of the AIS, which is incapable of targeting to the AIS or rescuing the AIS in ankyrin-G-deficient neurons. Here, we described a protocol using cultured hippocampal neurons from ANK3-E22/23-flox mice, which, when transfected with Cre-BFP exhibit loss of all isoform of ankyrin-G and impair the formation of AIS. Combined a modified Banker glia/neuron co-culture system, we developed a method to transfect ankyrin-G null neurons with a 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid, which is sufficient to rescue the formation of AIS. We further employ a quantification method, developed by Salzer and colleagues to deal with variation in AIS distance from the neuronal cell bodies that occurs in hippocampal neuron cultures. This protocol allows quantitative studies of the de novo assembly and dynamic behavior of AIS.

Here, we described a protocol to quantitatively study the assembly and structure of the axon initial segments (AIS) of hippocampal neurons that lack pre-assembled AIS due to the absence of a giant ankyrin-G.

הכנת Aplysia חושי, מנוע תא תרבויות העצבית

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

תא תרבויות העצבית מ Aplysia עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של קונוסים צמיחה

אקליפסיה (1991) הכנת גנגליה לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של נוירונים בודדים

מעקב אחר שינויים בריכוז הסידן התאיים ויעילות הסינפטית ברכיכות

Extracellularly זיהוי תאי עצב מוטורי לשריר בברכת מוטור

סימולטני טרום והקלטת אלקטרו פוסט סינפטי מ

בידוד של נוירונים חושיים של

היווצרות הסינפסה מעכבת בשיתוף תרבות נוירונים דגם שילוב GABAergic בינוני קוצניים וHEK293 תאים ביציבות להביע GABA

שיטת היווצרות טרום-סינפסה באמצעות חרוזי סדרן ותרבות "תא כדור"

שימוש בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס כדי לחקור את ההרכבה של מקטעים ראשוניים של אקסון