עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, כולל המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים, המרכזים למצוינות במחקר ביו-רפואי (COBRE), המרכז לחקר תגובת מארח לטיפול בסרטן [P20-GM109005], המכון הלאומי לסרטן [1R37CA282349-01], ומלגת הקדם-דוקטורט של איגוד הלב האמריקאי [מספר פרס: 23PRE1020738; https://doi.org/10.58275/AHA.23PRE1020738.pc.gr.161089]. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של NIH או AHA. איור 1 ואיור 3 נוצרו עם BioRender.com.

ניתוח בזמן אמת של סידן והתכווצות בכלי לימפה מבודדים

<ol>
	<li>Takahashi, T., Shibata, M., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+macromolecule+concentration+in+collecting+lymphatics+in+rat+mesentery.">Mechanism of macromolecule concentration in collecting lymphatics in rat mesentery.</a> Microvasc Res. 54 (3), 193-205 (1997).</li><li>Ishikawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+renal+lymphatics+under+normal+and+pathological+conditions.">The human renal lymphatics under normal and pathological conditions.</a> Histopathology. 49 (3), 265-273 (2006).</li><li>Fanous, M. Y. Z., Phillips, A. J., Windsor, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenteric+lymph:+the+bridge+to+future+management+of+critical+illness.">Mesenteric lymph: the bridge to future management of critical illness.</a> JOP. 8 (4), 374-399 (2007).</li><li>El-Chemaly, S., Levine, S. J., Moss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatics+in+lung+disease.">Lymphatics in lung disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1131 (1), 195-202 (2008).</li><li>Klotz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+lymphatics+are+heterogeneous+in+origin+and+respond+to+injury.">Cardiac lymphatics are heterogeneous in origin and respond to injury.</a> Nature. 522 (7554), 62-67 (2015).</li><li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels.">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).</li><li>Aukland, K., Reed, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial-lymphatic+mechanisms+in+the+control+of+extracellular+fluid+volume.">Interstitial-lymphatic mechanisms in the control of extracellular fluid volume.</a> Physiol Rev. 73 (1), 1-78 (1993).</li><li>Zawieja, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+physiology+of+lymphatics.">Contractile physiology of lymphatics.</a> Lymphat Res Biol. 7 (2), 87-96 (2009).</li><li>Nipper, M. E., Dixon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+Lymphatic+System.">Engineering the Lymphatic System.</a> Cardiovasc Eng Technol. 2 (4), 296-308 (2011).</li><li>Choi, I., Lee, S., Hong, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+era+of+the+lymphatic+system:+No+longer+secondary+to+the+blood+vascular+system.">The new era of the lymphatic system: No longer secondary to the blood vascular system.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (4), 006445 (2012).</li><li>Ji, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+endothelial+cells,+lymphedematous+lymphangiogenesis,+and+molecular+control+of+edema+formation.">Lymphatic endothelial cells, lymphedematous lymphangiogenesis, and molecular control of edema formation.</a> Lymphat Res Biol. 6 (3-4), 123-137 (2008).</li><li>Scallan, J. P., Zawieja, S. D., Castorena-Gonzalez, J. A., Davis, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+pumping:+mechanics,+mechanisms+and+malfunction.">Lymphatic pumping: mechanics, mechanisms and malfunction.</a> J Physiol. 594 (20), 5749-5768 (2016).</li><li>Lee, S., Roizes, S., vonder Weid, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+L-+and+T-type+voltage-dependent+Ca2++channels+in+regulation+of+lymphatic+vessel+contractile+activity.">Distinct roles of L- and T-type voltage-dependent Ca2+ channels in regulation of lymphatic vessel contractile activity.</a> J Physiol. 592 (24), 5409-5427 (2014).</li><li>Telinius, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lymphatic+vessel+contractile+activity+is+inhibited+in+vitro+but+not+in+vivo+by+the+calcium+channel+blocker+nifedipine.">Human lymphatic vessel contractile activity is inhibited in vitro but not in vivo by the calcium channel blocker nifedipine.</a> J Physiol. 592 (21), 4697-4714 (2014).</li><li>Imtiaz, M. S., Zhao, J., Hosaka, K., vonder Weid, P. Y., Crowe, M., van Helden, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaking+through+Ca2++stores+interacting+as+coupled+oscillators+via+membrane+depolarization.">Pacemaking through Ca2+ stores interacting as coupled oscillators via membrane depolarization.</a> Biophys J. 92 (11), 3843-3861 (2007).</li><li>Jo, M., Trujillo, A. N., Yang, Y., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+functional+ryanodine+receptors+in+rat+mesenteric+collecting+lymphatic+vessels.">Evidence of functional ryanodine receptors in rat mesenteric collecting lymphatic vessels.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 317 (3), H561-H574 (2019).</li><li>Stolarz, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+Activates+Ryanodine+Receptors+in+Rat+Lymphatic+Muscle+Cells+to+Attenuate+Rhythmic+Contractions+and+Lymph+Flow.">Doxorubicin Activates Ryanodine Receptors in Rat Lymphatic Muscle Cells to Attenuate Rhythmic Contractions and Lymph Flow.</a> J Pharmacol Exp Ther. 371 (2), 278-289 (2019).</li><li>Van, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+Prevents+the+Lymphostasis+Caused+by+Doxorubicin+in+the+Rat+Mesenteric+Circulation.">Dantrolene Prevents the Lymphostasis Caused by Doxorubicin in the Rat Mesenteric Circulation.</a> Front Pharmacol. 12, 727526 (2021).</li><li>Atchison, D. J., Johnston, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extra-+and+intracellular+Ca2++in+the+lymphatic+myogenic+response.">Role of extra- and intracellular Ca2+ in the lymphatic myogenic response.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 272 (1), R326-R333 (1997).</li><li>Atchison, D. J., Rodela, H., Johnston, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+stores+modulation+in+lymph+vessels+depends+on+wall+stretch.">Intracellular calcium stores modulation in lymph vessels depends on wall stretch.</a> Can J Physiol Pharmacol. 76 (4), 367-372 (1998).</li><li>Zhao, J., van Helden, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ET-1-associated+vasomotion+and+vasospasm+in+lymphatic+vessels+of+the+guinea-pig+mesentery.">ET-1-associated vasomotion and vasospasm in lymphatic vessels of the guinea-pig mesentery.</a> Br J Pharmacol. 140 (8), 1399-1413 (2003).</li><li>Cotton, K. D., Hollywood, M. A., McHale, N. G., Thornbury, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outward+currents+in+smooth+muscle+cells+isolated+from+sheep+mesenteric+lymphatics.">Outward currents in smooth muscle cells isolated from sheep mesenteric lymphatics.</a> J Physiol. 503 (1), 1-11 (1997).</li><li>Mathias, R., vonder Weid, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+NO-cGMP-KATP+channel+pathway+in+the+mesenteric+lymphatic+pump+dysfunction+observed+in+the+guinea+pig+model+of+TNBS-induced+ileitis.">Involvement of the NO-cGMP-KATP channel pathway in the mesenteric lymphatic pump dysfunction observed in the guinea pig model of TNBS-induced ileitis.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (6), G623-G634 (2013).</li><li>Garner, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KATP+channel+openers+inhibit+lymphatic+contractions+and+lymph+flow+as+a+possible+mechanism+of+peripheral+edema.">KATP channel openers inhibit lymphatic contractions and lymph flow as a possible mechanism of peripheral edema.</a> J Pharmacol Exp Ther. 376 (1), 40-50 (2021).</li><li>Souza-Smith, F. M., Kurtz, K. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cytosolic+Ca2++in+isolated+contractile+lymphatics.">Measurement of cytosolic Ca2+ in isolated contractile lymphatics.</a> J Vis Exp. (58), e3438 (2011).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li><li>Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+smooth+muscle.">Calcium signaling in smooth muscle.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), 1-20 (2011).</li><li>Harmer, A. R., Abi-Gerges, N., Morton, M. J., Pullen, G. F., Valentin, J. P., Pollard, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+an+in+vitro+contractility+assay+using+canine+ventricular+myocytes.">Validation of an in vitro contractility assay using canine ventricular myocytes.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 260 (2), 162-172 (2012).</li><li>IonOptix LLC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IonWizard 7.2 Acquisition. , (2017).</li><li>IonOptix LLC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IonWizard+7.2+Core+&amp;+Analysis+Functions.">IonWizard 7.2 Core &amp; Analysis Functions.</a> IonOptix LLC. , (2017).</li><li>Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Fura-2+for+measurements+of+cytosolic+free+calcium.">Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium.</a> Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).</li><li>Zawieja, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ano1+mediates+pressure-sensitive+contraction+frequency+changes+in+mouse+lymphatic+collecting+vessels.">Ano1 mediates pressure-sensitive contraction frequency changes in mouse lymphatic collecting vessels.</a> J Gen Physiol. 151 (4), 532-554 (2019).</li><li>Behringer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+electrical+dynamics+in+lymphatic+endothelium.">Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium.</a> J Physiol. 595 (24), 7347-7368 (2017).</li><li>Ferrusi, I., Zhao, J., van Helden, D., vonder Weid, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclopiazonic+acid+decreases+spontaneous+transient+depolarizations+in+guinea+pig+mesenteric+lymphatic+vessels+in+endothelium-dependent+and+-independent+manners.">Cyclopiazonic acid decreases spontaneous transient depolarizations in guinea pig mesenteric lymphatic vessels in endothelium-dependent and -independent manners.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (6), H2287-H2295 (2004).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

בשל אופיים השברירי והמזערי של LVs, הכרחי לנקוט בזהירות מרבית הן בתהליכי הדיסקציה והן בתהליכי הקנולציה. אפילו נזק קל לכלי יכול להוביל להתפתחות של LV שאינו בר קיימא או לגרום לחריגות ב [Ca2+]i transients. עקביות בהגדרות עירור חיונית באותה מידה לאורך כל סדרת הניסויים כדי להבטיח השוואה במדידות [Ca2+]i בין קבוצת הביקורת לקבוצות המטופלות. אי שמירה על הגדרות אחידות מהווה סיכון משמעותי להערכת יתר או חסר [Ca2+]i על פני כלי שיט בתוך סדרת ניסויים. באופן דומה, חשוב באותה מידה לזהות ולנטר במדויק את אותו אזור כלי דם לאורך כל ניסוי.
השימוש במחוון היחסימטרי Fura-2AM מנרמל שינויים פלואורסצנטיים הנגרמים על ידי עובי רקמה לא אחיד, פיזור/דליפה פלואורופורית או הלבנה, בעיות נפוצות בצבעים באורך גל יחיד. 31 הדבר מאפשר את הניטור הרציף המתואר בפרוטוקול זה. עם זאת, מכיוון ש- Fura-2 פועל על ידי כלאט Ca2+, ניתן להעמיס יתר על המידה את ה- LVs ולהפחית את [Ca2+]i הזמין להתכווצות או תגובה לתרופות. במקרים אלה, עדיין ניתן לראות קוצים Ca2+ בזמן שהתכווצויות קצובות נעדרות. גם אורך LV משתנה עשוי לתרום לתופעה זו. בעוד שמדידות Ca2+ אלה עשויות עדיין להיות תקפות, ייתכן שיהיה צורך להפחית את הריכוז של Fura-2AM בתצורות משוכפלות כדי להשיג בהצלחה הן מדידות Ca2+ והן מדידות קוטר. התוצאות שלנו כוללות רק LVs שעבורם היו גם קפיצות Ca2+ וגם התכווצויות קצובות בנקודת ההתחלה.
מדידת Rmin ו- Rmax הם שלבים קריטיים בחישוב מוחלט [Ca2+]i. מכיוון ש- R min צריך להיות יחס Fura-2 בהיעדר Ca2+, נוסף ריכוז גבוה של EGTA ל- PSS נטול Ca2+ כדי להבטיח את הקלציה של כל שארית Ca2+ . מחקרים ראשוניים נערכו עם EDTA ב- PSS נטול Ca2+, וזה הביא להתכווצויות כלי דם ספורדיות עם קוצים תואמים Ca2+ . עבור Rmax, ריכוז גבוה של Ca2+ נוסף ל-PSS יחד עם יונופור, יונומיצין, כדי למקסם את האות [Ca2+]i . הפתרון הגבוה Ca2+ עשוי לזרז, אשר עשוי לדרוש את הסרת EDTA מן PSS. חשוב לציין, מדידות נוספות אלה של Rmin ו- Rmax מספקות הזדמנות להעריך שינויים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ב- [Ca2+]i, אשר יכולים לספק מידע על מנגנוני עוררות והתכווצות הממברנה27 וכן לאפשר השוואות בסיסיות בין קבוצות ניסוי בהשוואה לפרוטוקולים המדווחים רק על יחס 340/380 עבור Fura-2. כישלון בהשגת ערכי Rmin ו- Rmax מספיקים מונע את היכולת לחשב ערכים מוחלטים [Ca2+]i.
בשל האופי המתכווץ של ה- LVs, שיטה זו יכולה לספק רק מדד של רמות Ca2+ גלובליות ולא אירועי שחרור מקומיים של Ca2+ שניתן למדוד בכלי דם משותקים32. עם זאת, שיטה זו היא יתרון בקורלציה שינויים בדינמיקה מוחלטת [Ca2+]i עם התכווצות בהשוואה לשיטות המשתמשות בכלי דם משותקים או תאים בודדים28,32. עבור גישה זו, ההנחה היא שרוב Ca2+ שנמדד מקורו בתאי שריר הלימפה. עם זאת, תאי אנדותל, אשר נמצאים גם ב- LVs מבודדים אלה, עשויים לתרום לאות Ca2+ הכולל שנצפה33. ניתן להעריך תרומה זו באמצעות LVs שנשללו מאנדותל34. התכווצויות LV עשויות גם לגרום לדופן כלי הדם לזוז מעט פנימה והחוצה ממיקוד במהלך מחזור ההתכווצות. לכן, חשוב להשתמש בקטעי כלי קצרים שניתן למשוך מתוח אך מבלי למתוח את הכלי.
מעבר ליישומה ב-LVs, שיטה זו יכולה לשמש לחקר כלי דם מבודדים ממיטות כלי דם אחרות, כולל עורקים וורידים, והיא טומנת בחובה הבטחה לשימוש פוטנציאלי בנוירוביולוגיה ובענפים אחרים של ביולוגיה וסקולרית. חקירת ההשפעות של אגוניסטים או אנטגוניסטים שונים המכוונים למסלולי העברת אותות שונים היא דרך נוספת לחקור את הדינמיקה הבסיסית של Ca2+ . יתר על כן, טכניקה זו יכולה לשמש גם למחקר השוואתי הכולל דגימות בקרה וטיפול מבעלי חיים בהתאמה. יתר על כן, גישה זו ניתנת להתאמה ליישום ברמה התאית, כגון בתאי שריר לימפטיים מבודדים, הדורשים התאמות מינימליות לתא הזילוח ולמטרות המיקרוסקופ. לסיכום, שיטה זו מספקת תובנה רלוונטית פיזיולוגית לדינמיקה הגלובלית של Ca2+ מכיוון שהיא קשורה להתכווצות וריתמיות ב- LVs ומספקת הערכה חזקה של רגולטורים פוטנציאליים של דינמיקת Ca2+ באיסוף LVs.

כלי הדם הלימפטיים נמצאים במערכות איברים רבות, כולל המוח, הלב, הריאות, הכליות והמזנטריה 1,2,3,4,5,6, ופועלים על ידי הנעת נוזל (לימפה) מהחללים הבין-תאיים אל צינורות הוורידים המרכזיים כדי לשמור על הומאוסטזיס נוזלים 7,8,9,10 . זה מתחיל עם נימי לימפה עיוורים בתוך מיטות נימי כלי הדם המתנקזים לכלי הלימפה הנאספים (LVs). איסוף LVs מורכב משתי שכבות של תאים: שכבה של תאי אנדותל המוקפת בשכבה של תאי שריר לימפה (LMCs)10,11. העברת נוזל הלימפה מושגת באמצעות כוחות חיצוניים (למשל היווצרות לימפה חדשה, פעימות עורקים, תנודות לחץ ורידי מרכזי) וכוחות פנימיים12.
הכוח הפנימי להובלת הלימפה הוא התכווצות קצבית ספונטנית של איסוף LVs, שהיא המוקד של רוב המחקרים הבוחנים את תפקוד הלימפה. משאבת לימפה פנימית זו מווסתת בעיקר על ידי העלייה והירידה המחזוריות של Ca2+ ([Ca2+]i). דפולריזציה ספונטנית של קרום הפלזמה ב- LMCs מפעילה ערוצי Ca2+ (Cav1.x) מגודרים במתח ומפעילה זרם Ca2+ והתכווצות קצבית LV 8,9,10. תפקיד זה הודגם על ידי חסימת Cav1.x עם חומרים ספציפיים, כמו nifedipine, אשר עיכב התכווצויות LV וגרם להרחבת כלי הדם13,14. העלייה הארעית ב[Ca2+]i או "Ca2+ ספייק" ב- LMCs בתיווך ערוצי Cav1.x עשויה גם להניע מאגרי Ca2+ תוך תאיים על ידי הפעלת קולטני אינוסיטול טריפוספט (IP3) וקולטני ריאנודין (RyRs) על הרשתית הסרקופלזמית (SR)15,16,17,18. הראיות הנוכחיות מצביעות על כך שקולטני IP3 תורמים יותר Ca2+ הנדרש להתכווצויות LV נורמליות בהשוואה ל- RyRs 15,16,19,20,21; עם זאת, RyRs עשוי לשחק תפקיד במהלך פתולוגיה או בתגובה להתערבות תרופתית 17,18. בנוסף, ההפעלה של תעלות K+ 22 המופעלות על ידי Ca2+ ותעלות אשלגן רגישות ל-ATP (KATP)23,24 יכולה לגרום להיפרפולציה של קרום LMC ולעכב פעילות התכווצות ספונטנית.
ישנן תעלות יונים וחלבונים רבים אחרים שעשויים לווסת את הדינמיקה של Ca2+ באיסוף LVs. שימוש בשיטות לחקר שינויים ב- Ca2+ והתכווצות כלי הדם בתגובה לסוכנים פרמקולוגיים בזמן אמת חשוב כדי להבין את הרגולטורים הפוטנציאליים הללו. שיטה מוקדמת יותר שהשתמשה בפורה-2 למדידת שינויים יחסיים ב-LV [Ca2+]i תוארה25. מכיוון שקבוע הדיסוציאציה עבור Fura-2 ו- Ca2+ ידוע26, ניתן לחשב ריכוזים בפועל של Ca2+, מה שמרחיב את היישום של שיטה זו ומספק תובנה נוספת לגבי איתות Ca2+ , רגישות הממברנה ומנגנוני ההתכווצות27, כמו גם מאפשר השוואה בסיסית בין קבוצות ניסוי. גישה אחרונה זו שימשה cardiomyocytes28, ולכן, ניתן להתאים LVs. מאמר זה מציג שיטה משופרת המשלבת את שתי הגישות הללו למדידה וחישוב של שינויים מוחלטים [Ca2+]i וכן התכווצות/ריתמוס כלי דם ברציפות בזמן אמת ב-LVs מבודדים בלחץ. אנו מספקים גם תוצאות מייצגות עבור LVs שטופלו בניפדיפין.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20x S Fluor objective</td>
			<td>Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, United States)</td>
			<td>UPlanSApo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass micropipettes</td>
			<td>Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, United States)</td>
			<td>GCP-75-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fisher Bioreagents (Waltham, MA, United States)</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide (CO2)</td>
			<td>nexAir (Memphis, TN, United States)</td>
			<td>UN3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (Foster City, CA, United States)</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (C10H16N2O8)</td>
			<td>Fisher Bioreagents (Waltham, MA, United States)</td>
			<td>BP118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA (C14H24N2O10)</td>
			<td>Fisher Bioreagents (Waltham, MA, United States)</td>
			<td>O2783-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2AM</td>
			<td>Invitrogen (Waltham, MA, United States)</td>
			<td>F1221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (C6H12O6)</td>
			<td>Fisher Bioreagents (Waltham, MA, United States)</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gravity-Fed Pressure regulator</td>
			<td>custom-made in the lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating unit</td>
			<td>Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, United States)</td>
			<td>TC-09S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>IonOptix (Westwood, MA, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, United States)</td>
			<td>IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Invitrogen (Waltham, MA, United States)</td>
			<td>I24222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix Cell Framing Adaptor</td>
			<td>IonOptix (Westwood, MA, United States)</td>
			<td>665 DXR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal Critical Care (Telangana, India)</td>
			<td>NDC 66794-017-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolated vessel perfusion chamber</td>
			<td>Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, United States)</td>
			<td>CH-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knot preparation forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (Foster City, CA, United States)</td>
			<td>11253-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light source</td>
			<td>Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, United States)</td>
			<td>TL4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Acros Organics (New Jersey, NJ, Unites States)</td>
			<td>213115000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoCam-S3 Fast CMOS video system</td>
			<td>IonOptix (Westwood, MA, United States)</td>
			<td>MCS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, United States)</td>
			<td>N7634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic sutures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen (O2)</td>
			<td>nexAir (Memphis, TN, United States)</td>
			<td>UN1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic acid</td>
			<td>Sigma (St. Louis, MO, United States)</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Bioreagents (Waltham, MA, United States</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure monitor system</td>
			<td>Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, United States)</td>
			<td>PM-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Transducer</td>
			<td>Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, United States)</td>
			<td>PT-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone-lined petri-dish</td>
			<td>custom-made in the lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher Bioreagents (Waltham, MA, United States</td>
			<td>BP328-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Bioreagents (Waltham, MA, United States</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate (NaH2PO4)</td>
			<td>Fisher Bioreagents (Waltham, MA, United States</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague-Dawley rats</td>
			<td>Envigo RMS (Indianapolis, IN, USA)</td>
			<td>Male</td>
			<td>9-13 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica Microsystems (Wetzlar, Germany)</td>
			<td>S9D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (Foster City, CA, United States)</td>
			<td>15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time evaluation of absolute, cytosolic, free ca2+ and corresponding contractility in isolated, pressurized lymph vessels

כלי הדם הלימפטיים, המכונים כיום לעתים קרובות "מחזור הדם השלישי", ממוקמים במערכות איברים חיוניות רבות. תפקיד מכני עיקרי של כלי הדם הלימפטיים הוא להחזיר נוזלים מחללים חוץ-תאיים בחזרה לצינורות הוורידים המרכזיים. הובלת הלימפה מתווכת על ידי התכווצויות קצובות ספונטניות של כלי הלימפה (LVs). התכווצויות LV מווסתות במידה רבה על ידי העלייה והירידה המחזוריות של סידן ציטוסולי, חופשי ([Ca2+]i).
מאמר זה מציג שיטה לחישוב בו-זמני של שינויים בריכוזים מוחלטים של [Ca2+]i והתכווצות/ריתמוס כלי הדם בזמן אמת ב-LVs מבודדים בלחץ. באמצעות LVs מזנטריים של חולדות מבודדות, חקרנו שינויים ב-[Ca2+]i והתכווצות/ריתמיות בתגובה להוספת תרופות. LVs מבודדים הועמסו במחוון חישת Ca2+ Fura-2AM, ומיקרוסקופ וידאו בשילוב עם תוכנת זיהוי קצה שימש כדי ללכוד [Ca2+]i ומדידות קוטר ברציפות בזמן אמת.
אות Fura-2AM מכל LV כויל לאות המינימלי והמקסימלי עבור כל כלי שיט ושימש לחישוב מוחלט [Ca2+]i. מדידות הקוטר שימשו לחישוב פרמטרים של התכווצות (משרעת, קוטר דיאסטולי סופי, קוטר סיסטולי סופי, זרימה מחושבת) וריתמיות (תדירות, זמן התכווצות, זמן הרפיה) וקורלציה עם מדידות מוחלטות [Ca2+]i .

The lymphatic vasculature is found in many organ systems including the brain, heart, lungs, kidney, and mesentery1,2,3,4,5,6, and operates by propelling fluid (lymph) from the interstitial spaces to the central venous ducts to maintain fluid homeostasis7,8,9,10. It starts with blind-ended lymphatic capillaries within the vascular capillary beds that drain into collecting lymph vessels (LVs). Collecting LVs are made of two layers of cells: a layer of endothelial cells encompassed by a layer of lymphatic muscle cells (LMCs)10,11. Lymph fluid transport is achieved through both extrinsic forces (e.g. new lymph formation, arterial pulsations, central venous pressure fluctuations) and intrinsic forces12.
The intrinsic force for lymph transport is the spontaneous rhythmic contraction of collecting LVs, which is the focus of the majority of studies investigating lymphatic function. This intrinsic lymphatic pump is principally regulated by the cyclic rise and fall of cytosolic, free Ca2+ ([Ca2+]i). Spontaneous depolarization of the plasma membrane in LMCs activates voltage-gated &#34;L-type&#34; Ca2+ (Cav1.x) channels triggering Ca2+ influx and subsequent LV rhythmic contraction8,9,10. This role was demonstrated by blocking Cav1.x with specific agents, like nifedipine, which inhibited LV contractions and caused vessel dilation13,14. The transient rise in [Ca2+]i or &#34;Ca2+ spike&#34; in the LMCs mediated by Cav1.x channels also may mobilize intracellular Ca2+ stores by activating inositol triphosphate (IP3) receptors and ryanodine receptors (RyRs) on the sarcoplasmic reticulum (SR)15,16,17,18. Current evidence suggests IP3 receptors contribute more Ca2+ required for normal LV contractions compared to RyRs15,16,19,20,21; however, RyRs may play a role during pathology or in response to pharmaceutical intervention17,18. Additionally, the activation of Ca2+-activated K+ channels22 and ATP-sensitive potassium (KATP) channels23,24 can hyperpolarize the LMC membrane and inhibit spontaneous contractile activity.
There are many other ion channels and proteins that may regulate Ca2+ dynamics in collecting LVs. Utilizing methods to study changes in Ca2+ and vessel contractility in response to pharmacological agents in real time is important to understand these potential regulators. An earlier method using Fura-2 to measure relative changes in LV [Ca2+]i has been described25. Because the dissociation constant for Fura-2 and Ca2+ is known26, it is possible to calculate actual concentrations of Ca2+, which broadens the application of this method and provides additional insight into Ca2+ signaling, membrane excitability, and contractility mechanisms27, as well as allowing for baseline comparisons between experimental groups. This latter approach has been used in cardiomyocytes28, and therefore, can be adapted to LVs. This paper presents an improved method that combines these two approaches to measure and calculate changes in absolute [Ca2+]i as well as vessel contractility/rhythmicity continuously in real time in isolated, pressurized LVs. We also provide representative results for LVs treated with nifedipine.

מחבר זרקור: שיטות חדשניות במחקר לימפדמה ויתר לחץ דם

הערכה בזמן אמת של Ca2+ מוחלט, ציטוסולי, חופשי והתכווצות מקבילה בכלי לימפה מבודדים בלחץ

We study mechanisms of lymph vessel contractions, and lymph flow to better understand the underlying pathology of cancer-related lymphedema, as well as the connection between the lymphatic system and hypertension. Our goal is to identify therapeutic targets within the lymphatic vasculature so that we can develop novel treatments for lymphatic diseases. Recent discoveries of different ang channels in lymphatic muscle and endothelial cells, which contribute to the underlying calcium dynamics have proved instrumental in moving the field forward.Isolated vessels and intravital microscope have been crucial techniques for studying lymphatic vessel functions. More recently, there has been an upward trend of using organ on a chip and micro-fabricated vessels to investigate many aspects of lymphatic biology. The very small tissue size challenges, studying the lymphatic vasculature, requiring a lot of time, patience, and the development of new technologies.The unavailability of lymphatic muscle cell specific markers is another hurdle for the whole scientific community. The advantage of this protocol is the ability to measure lymphatic contractions and absolute calcium concentrations within the same vessel. This provides additional insight into calcium signaling, mechanisms of contraction, as well as the ability to measure baseline comparisons between treatment groups.Compared to other techniques that maybe rely on relative changes in calcium or paralyzed vessels.

התכווצות של LVs ושינויים מקבילים ב-Ca2+ ציטוסולי חופשי ([Ca2+]i) הוערכו ב-LVs מזנטריים של חולדות מבודדות לאחר חשיפה לריכוזים משתנים של ניפדיפין (NIF; 0.1-100 ננומטר) (איור 6). הפרמטרים, כולל משרעת ספייק Ca2+, קו הבסיס Ca2+ ושיא Ca2+, הציגו ירידה תלוית ריכוז עם תוספת מצטברת של NIF לתא הזילוח (איור 7A). במקביל, פרמטרים של התכווצות כגון משרעת התכווצות וזרימה מחושבת הדגימו גם הם ירידה הדרגתית (איור 7B). הייתה עלייה קטנה בקוטר ה-EDD עם NIF (איור 7B). תדירות ספייק Ca2+ ותדירות ההתכווצות נראות כתגובת הכל או אף אחד. עם זאת, השפעה זו התרחשה ב -10 ננומטר עבור LV אחד, בעוד שכל ה- LVs הפסיקו את ההתכווצויות ב- 100 ננומטר. לפיכך, הנתונים המשולבים מייצרים גרפים הדומים לתגובת ריכוז מדורגת. השפעה זו עולה בקנה אחד עם פרסומים קודמים שהשתמשו ב- NIF על LVs בתכשירים אחרים (מיוגרפיה של חוטים ולחץ 13,14). תרשימי מנהטן מראים את תגובות ה-LV האינדיבידואליות עבור מדדים של ריתמיות, כולל מרווח, זמן התכווצות וזמן הרפיה (איור 7C). סוג זה של ייצוג נתונים מאפשר לחוקר להקניט את התגובות האלה של הכל או אף אחד או את השונות במקצבי ההתכווצות כדי לספק תובנה נוספת לגבי המנגנונים הבסיסיים. בסופו של דבר, הירידות באמפליטודת ההתכווצות ובתדירותן הביאו לירידה בזרימה המחושבת דרך LVs מבודדים אלה, המשמשים כאינדיקטור חלופי לתפקוד in vivo. בסך הכל, הירידה בהתכווצות LV מתואמת עם הירידה ב- [Ca2+]i. הממצאים שלנו מספקים ראיות ישירות לכך שבטווח של 100 ננומטר, הקרן החדשה לישראל עצרה ביעילות את ההתכווצויות ואת תנודות [Ca2+]i ב-LVs על ידי אנטגוניזם של תעלות Cav1.x הקיימות בתאי שריר הלימפה (LMC).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66535/66535fig01v2.jpg"> איור 1: תמונה של מבנה תא כלי הדם המבודד. מחקרי זילוח כלי דם השתמשו בתא כלי מבודד המצויד בתרמו-וסת. כוח הכבידה שימש לשליטה בלחץ באמצעות מאגר PSS. הלחץ נוטר על ידי מתמרים המחוברים הן לצינורות זרימה (P1) והן לצינורות זרימה החוצה (P2). קיצור: PSS = תמיסת מלח פיזיולוגית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66535/66535fig01largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66535/66535fig02.jpg"> איור 2: הכנת קשר במבט חטוף. (A) הכנת לולאה כפולה תחת מיקרוסקופ דיסקציה באמצעות חוט יחיד של חוט תפר משי 3 רובדים, (B) תפיסת הקצה הרופף ומשיכה שלו דרך שתי הלולאות, (C) משיכת הקשר משני הקצוות כדי לשמור על פתח קטן, ו- (D) חיתוך חוט הלהט העודף מכל צד והקופסה הכחולה מראה קשר ידני כפול מוכן לשימוש. סרגל קנה מידה = 1.5 מ"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66535/66535fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66535/66535fig03.jpg"> איור 3: סכמטיות של זרימת עבודה ניסיונית לרכישת נתונים. חולדה בריאה הורדמה בהשראת איזופלורן 5% ובוצעה עריפת ראש להוצאת דם גזע. בוצע חתך בקו האמצע כדי לחשוף ולבודד את המזנטריה. המזנטריה המבודדת נפרסה בתמיסת PSS קרה כקרח ו-LV נותח ללא שומן לצורך קנולציה בתא זילוח כלי מבודד. האמבטיה הונחה על במת המיקרוסקופ ההפוך באמצעות עדשה אובייקטיבית פי 20. הספינה התרגשה לחילופין עם אור באורך גל של 340 ו-380 ננומטר והספקטרום הפלואורסצנטי של הפליטה נאסף באמצעות מצלמת CCD ב-510 ננומטר. המחשב המחובר למיקרוסקופ יצר את עקבות ההתכווצות וה- Ca2+ באמצעות לכידת פלואורסצנטיות ותוכנת הדמיה לזיהוי קצה. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. קיצורים: PSS = תמיסת מלח פיזיולוגית; LV = כלי לימפה; CCD = התקן מצומד טעינה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66535/66535fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66535/66535fig04.jpg"> איור 4: מעקב התכווצות LV מייצג. (A) הקלטה לדוגמה של שינויים בקוטר של LVs משומרים העמוסים במחוון הדמיה Ca2+ Fura 2 AM ב-PSS ו-(B) מעקב מוגדל כדי להציג את כל הפרמטרים הקשורים להתכווצות כלי שיט: EDD, ESD, AMP ותדירות. ערכים אלה שימשו לחישוב ריתמיות וזרימה. קיצורים: PSS = תמיסת מלח פיזיולוגית; LV = כלי לימפה; EDD = קוטר דיאסטולי סופי; ESD = קוטר סיסטולי סופי; AMP = משרעת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66535/66535fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66535/66535fig05.jpg"> איור 5: מעקב הדמיה מייצג של LV Ca2+ . (A) הקלטה לדוגמה של שינויים ב- [Ca2+]i מוחלט ב- LVs משומרים העמוסים ב- Fura-2 ב- PSS ו- (B) מעקב מוגדל כדי להציג את כל הפרמטרים (שיא, משרעת וקו בסיס) הקשורים ל- [Ca2+]i (לא מתוקן רקע). קיצור: PSS = תמיסת מלח פיזיולוגית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66535/66535fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66535/66535fig06.jpg"> איור 6: התכווצות LV והדמיית Ca2+ במבט חטוף. עקבות מייצגים המתאימים לקוטר (A), (B) יחס 340/380, ו- (C) מוחלט [Ca2+]i של קו בסיס PSS, nifedipine, אנטגוניסט ערוץ Cav1.x (Ca2+), תגובת ריכוז, כולל Rmin ו- Rmax. קיצורים: PSS = תמיסת מלח פיזיולוגית; LV = כלי לימפה; NIF = nifedipine; Rmin = מינימום Fura-2 אות פלואורסצנטי; Rmax = אות פלואורסצנטי מרבי של Fura-2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66535/66535fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66535/66535fig07.jpg"> איור 7: תנודת Ca2+ והתכווצות מקבילה שנחסמה על-ידי ניפדיפין ב-LVs. (A) הפרמטרים Ca2+ (n = 3) ו-(B) התכווצות (n = 3) ירדו באופן תלוי ריכוז עם תוספת של nifedipine, אנטגוניסט ערוץ Cav1.x (Ca2+) תלוי מתח. (C) תרשימי מנהטן מייצגים מראים מרווח זמן ממוצע (Δt) בין צירים לבין זמני התכווצות והרפיה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. קיצורים: PSS = תמיסת מלח פיזיולוגית; LV = כלי לימפה; NIF = nifedipine; EDD = קוטר דיאסטולי סופי; AMP = משרעת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66535/66535fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Innovative Methods in Lymphedema and Hypertension Research at JoVE.com

פרוטוקול זה מתאר שיטה למדוד בו זמנית סידן ציטוסולי, חופשי [Ca2+]i וקוטר כלי הדם בהתכווצות כלי הלימפה בזמן אמת ולאחר מכן לחשב ריכוזי Ca2+ מוחלטים וכן פרמטרים של התכווצות/ריתמוס. פרוטוקול זה יכול לשמש לחקר Ca2+ ודינמיקה של התכווצות במגוון תנאי ניסוי.

The lymphatic vasculature, now often referred to as &#34;the third circulation,&#34; is located in many vital organ systems. A principal mechanical ...

אנו חוקרים מנגנונים של התכווצויות כלי הלימפה, וזרימת הלימפה כדי להבין טוב יותר את הפתולוגיה הבסיסית של לימפאדמה הקשורה לסרטן, כמו גם את הקשר בין מערכת הלימפה ליתר לחץ דם. מטרתנו היא לזהות מטרות טיפוליות בתוך כלי הדם הלימפטיים כדי שנוכל לפתח טיפולים חדשניים למחלות לימפה. תגליות אחרונות של תעלות ANG שונות בשרירי הלימפה ובתאי אנדותל, התורמות לדינמיקה הבסיסית של הסידן, הוכיחו את עצמן כחיוניות בהנעת התחום קדימה.כלי דם מבודדים ומיקרוסקופ תוך חיוני היו טכניקות חיוניות לחקר תפקודי כלי הלימפה. לאחרונה, יש מגמת עלייה של שימוש באיבר על שבב וכלי דם מיקרו-מפוברקים כדי לחקור היבטים רבים של ביולוגיה לימפתית. גודל הרקמה הקטן מאוד מאתגר, חקר כלי הדם הלימפה, דורש הרבה זמן, סבלנות, ופיתוח טכנולוגיות חדשות.חוסר הזמינות של סמנים ספציפיים לתאי שריר לימפטיים הוא מכשול נוסף עבור הקהילה המדעית כולה. היתרון של פרוטוקול זה הוא היכולת למדוד התכווצויות לימפה וריכוזי סידן מוחלטים באותו כלי. זה מספק תובנה נוספת לגבי איתות סידן, מנגנוני התכווצות, כמו גם היכולת למדוד השוואות בסיסיות בין קבוצות טיפול.לעומת טכניקות אחרות שאולי מסתמכות על שינויים יחסיים בסידן או בכלי דם משותקים.

real-time-evaluation-absolute-cytosolic-free-ca2-corresponding

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Evaluation of Absolute, Cytosolic, Free Ca2+ and Corresponding Contractility in Isolated, Pressurized Lymph Vessels

642 Views.  University of Arkansas for Medical Sciences. אנו חוקרים מנגנונים של התכווצויות כלי הלימפה, וזרימת הלימפה כדי להבין טוב יותר את הפתולוגיה הבסיסית של לימפאדמה הקשורה לסרטן, כמו גם את הקשר בין מערכת הלימפה ליתר לחץ דם. מטרתנו היא לזהות מטרות טיפוליות בתוך כלי הדם הלימפטיים כדי שנוכל לפתח טיפולים חדשניים למחלות לימפה. תג?...

Video: מחבר זרקור: שיטות חדשניות במחקר לימפדמה ויתר לחץ דם

The lymphatic vasculature, now often referred to as &#34;the third circulation,&#34; is located in many vital organ systems. A principal mechanical function of the lymphatic vasculature is to return fluid from extracellular spaces back to the central venous ducts. Lymph transport is mediated by spontaneous rhythmic contractions of lymph vessels (LVs). LV contractions are largely regulated by the cyclic rise and fall of cytosolic, free calcium ([Ca2+]i).
This paper presents a method to concurrently calculate changes in absolute concentrations of [Ca2+]i and vessel contractility/rhythmicity in real time in isolated, pressurized LVs. Using isolated rat mesenteric LVs, we studied changes in [Ca2+]i and contractility/rhythmicity in response to drug addition. Isolated LVs were loaded with the ratiometric Ca2+-sensing indicator Fura-2AM, and video microscopy coupled with edge-detection software was used to capture [Ca2+]i&#160;and diameter measurements continuously in real time.
The Fura-2AM signal from each LV was calibrated to the minimum and maximum signal for each vessel and used to calculate absolute [Ca2+]i. Diameter measurements were used to calculate contractile parameters (amplitude, end diastolic diameter, end systolic diameter, calculated flow) and rhythmicity (frequency, contraction time, relaxation time) and correlated with absolute [Ca2+]i measurements.

This protocol describes a method to simultaneously measure cytosolic, free calcium [Ca2+]i and vessel diameter in contracting lymph vessels in real time and then calculate absolute Ca2+ concentrations as well as contractility/rhythmicity parameters. This protocol can be used to study Ca2+ and contractile dynamics across a variety of experimental conditions.

Setting Up the Perfusion Chamber to Measure Contractility in Isolated, Pressurized Lymph Vessels

To begin, take borosilicate glass micro-pipettes acquired from a commercial source. Cut and polish the micro-pipettes to a length of approximately one to two centimeters for use in the isolated vessel perfusion chamber. Connect each mounted glass cannula in the vessel perfusion chamber to independent pressure transducers aligned with independent gravity-fed pressure regulators and connected using polyethylene tubing.Backfill the profusion chamber, glass micro-pipettes, and the gravity-fed pressure regulator along with the polyethylene tubing with the physiological salt solution, then clamp the pressure to ensure the cannulas are not pressurized.