מחקר זה מומן על ידי תוכנית המחקר למדע בסיסי באמצעות קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון משרד החינוך, המדע והטכנולוגיה (2013068067); על ידי התכנית הבוגרת 21 מוח קוריאה של משרד קוריאני חינוך, מדע והטכנולוגיה, אונ&#39; הלאומית בסיאול החולה, האגודה הקוריאנית של יתר לחץ דם (2013), קרן מחקר SK טלקום (לא. 3420130290) ומן הקרן הלאומית למדע הטבעי של סין (NSFC 31,460,265; NSFC 81,260,035).

הפרוטוקול הוא בהתאם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה שפורסם על ידי המכונים הלאומיים האו&quot;ם הבריאות (פרסום NIH מס 85-23, מתוקנת 1996). זה אושר על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) של האוניברסיטה הלאומית בסיאול (אישור IACUC לא .: SNU-101,213-1). הכנת הצפה 1. (חומרי שולחן וציוד) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 300 מ&quot;ל של פתרון בידוד טריים ביום של הניסוי (מ&quot;מ: NaCl, 135; KCl, 5.4; 2 MgCl, 3.5; גלוקוז, 5; HEPES, 5; Na 2 4 HPO, 0.4; טאורין, 20; pH 7.4 עם NaOH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 100 מ&quot;ל של פתרון אחסון טריים ביום של הניסוי (מ&quot;מ: 120 NaCl; KCl 5.4; MgSO 4 5; CaCl 2 0.2; נתרן-פירובט 5; גלוקוז 5.5; טאורין 20; HEPES 10; מניטול 29; pH 7.4 עם NaOH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 ליטר של פתרון זלוף (מ&quot;מ: NaCl, 141.4; KCl, 4; לאא 2 4 PO, 0.33; MGCl 2, 1; HEPES, 10; גלוקוז, 5.5; 2 CaCl, 1.8; מניטול, 14.5; pH 7.4 עם NaOH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 30 מ&quot;ל של תמיסת collagenase 1 על ידי הוספת collagenase (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל), פרוטאז (0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל), אלבומין בסרום שור (BSA, 1.67mg / מ&quot;ל), ו Ca 2 + (0.05 מ&quot;מ) עד 25 מ&quot;ל של בידוד פִּתָרוֹן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 20 מ&quot;ל של תמיסת collagenase 2 על ידי הוספת collagenase (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל), ארגון ה- BSA (1.67 מ&quot;ג / מ&quot;ל), ו Ca 2 + (0.05 מ&quot;מ) 16.7 מ&quot;ל של פתרון בידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 40 מ&quot;ל של תמיסת BSA על ידי הוספת 0.4 גרם של BSA 40 מ&quot;ל של פתרון בידוד. הפרד 10 מ&quot;ל ו -30 מ&quot;ל לשתי כוסות. הוספת Ca 2 + 30 מ&quot;ל של תמיסת BSA כך הריכוז הסופי Ca 2 + בתמיסה BSA הוא 1 מ&quot;מ. </li></ol> 2. הכנה עבור הבידוד של החדר השמאלי (LV) myocytes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבר 8-12 בן שבוע, ספראג-Dawley זכר (SD) חולדות בכלובי תחבורה נקיות ממתקן החיה לחדר ההכנה ובידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hלאכול שתי אמבטיות מים ל -37 מעלות צלסיוס הערה: השתמש באמבט מים אחד על המים - המאגר במקטורן ואת צינורות טפטוף של מערכת זלוף Langendorff. השתמש באמבט מים אחרים כדי להתסיס גזעי רקמת שריר הלב על מנת להפריד myocytes יחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל ו 3.3 מ&quot;ל של תמיסת BSA (ללא Ca 2 +) ל -25 מ&quot;ל של collagenase פתרון 1 פתרון collagenase 16.7 מ&quot;ל 2 לפצות את נפח 30 מ&quot;ל ו 20 מ&quot;ל, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון הבידוד (100 מ&quot;ל) ו collagenase פתרון 1 (30 מ&quot;ל) לעמודה 1 (אל&quot;מ 1) ועמודה 2 (אל&quot;מ 2) במערכת זלוף Langendorff, בהתאמה (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חמצן פתרון הבידוד collagenase פתרון 1 אל&quot;מ 1 ו Col.2 דרך צינור חיבור חמצן במערכת זלוף Langendorff (איור 1 א). בדומה לכך, פתרון collagenase oxygenate 2 והפתרון BSA באמבט מים רועד 100% O 2 דרךצינור חיבור חמצן. </li></ol> 3. בידוד של LV myocytes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים חולדה SD באמצעות זריקה intraperitoneal של נתרן pentobarbital (30 מ&quot;ג / ק&quot;ג) ולאשר את מצב הרדמה על ידי הבוהן צובט וחוסר השתקפות הנסיגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את החולדה מגש לנתיחה. במצב שכיבה, לאבטח את ארבע רגליו אל צידי הגוף עם קלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל חתכים-ציריים באמצע חזה עם מספרי כירורגיות כדי לפתוח את החזה, הבטחה שלא לפגוע בלב. השתמש עוד זוג מספרי נקי לנתח את הלב מכלי החיבור (למשל, הווריד נבוב עליון ונחות, כלי ריאתי, ואב עורקים) ואת קרום קרום לב 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו חלק של אבי העורקים של אורך מספיק (5 - 8 מ&quot;מ), מהדק את אבי העורקים עם מלקחיים בסדר, במהירות הר צינורית של מערכת זלוף Langendorff בתוך דקות 1 (איור 1 א). לקשור תפר חוט 4/0 בחוזקה על אבי העורקים. </li><li&gt; הפעל את שסתום על אל&quot;מ 1 ו perfuse בלב מבודד עם פתרון בידוד מראש התחמם מחומצן במשך 10 דקות (שיעור זלוף: 12-14 מ&quot;ל / דקה). כבה את השסתום על אל&quot;מ 1, להפעיל את השסתום על אל&quot;מ 2 ו perfuse את הלב עם פתרון collagenase 1 עבור 8 - 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרדת בלב מתעכל על ידי חיתוך אבי העורקים ולהעביר אותו על ידי לחיצה על אבי העורקים עם מלקחיים לתוך הבקבוק המכיל פתרון בידוד טריים (איור 1Bi). השתמש במספריים בסדר מלקחיים לחתוך את רוב הקיר בחינם LV (כולל מחצה) לחתיכות קטנות יותר (~ 22 מ&quot;מ, איור 1Bii). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את חתיכות לתוך בקבוק המכיל תמיסת collagenase טרי מראש התחמם מחומצן 2 (איור 1Biii). Shake למשך 10 דקות. שמור אספקת חמצן פתרון collagenase המכיל myocyte 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את myocyte - ההשעיה לצינור 10 מ&quot;ל צנטריפוגות באמצעות טפטפות עם נורת שאיבה ולהוסיף Ca 2 + - המכיל פתרון BSA (1: 1 בנפח). צנטריפוגה ב 30 גרם במשך 2 דקות וזורקים supernatant. Re- להשעות גלולה myocyte ב 5 מ&quot;ל של תמיסת BSA. צנטריפוגה וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר את כדורי myocyte ולשמור מיוציטים ב 10 מ&quot;ל של פתרון האחסון מראש מחומצן ב RT (איור 1Biv-vi). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על נהלים (שלבים 3.7 - 3.9) עם רקמות LV שנותרו בבקבוק. הערה: המשך לחזור ההליכים (שלבים 3.7 - 3.9) שוב עד שרוב רקמות LV נעלמת להשיג תשואה טובה של מיוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את מיוציטים בתמיסה אחסון במשך 6-8 שעות ב RT עד תום הניסויים. </li></ol> 4. מדידות סימולטני של הארעית 2+ Ca התאי Myocyte התכווצות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיוציטים LV טען עם אסתר acetoxymethyl פורעה -2 AM (2 מיקרומטר). הערה: בצע את כל נהלי העמסת ניסויים עם מיוציטים טעונים בתוך שפופרת כהה (האיור 1Bvii). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> centrifuge ההשעיה myocyte (1 מ&quot;ל) XG ב 2000 במשך 10 שניות. בטל supernatant מחדש להשעות גלולה myocyte ב 1 מ&quot;ל של תמיסת Tyrode עם ריכוז נמוך Ca 2 + (250 מיקרומטר, לוח חומרים וציוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף פורעה-02:00 ו poloxamer 407 (2 μl), בעדינות לפיזור ההשעיה myocyte, ולשמור את התערובת ב RT (20 - 24 מעלות צלסיוס) במשך 15 דקות (איור 1Bvii). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את התערובת במשך 5 שניות, לבטל את supernatant לפזר את גלולה myocyte ב 1 מ&quot;ל של תמיסת זלוף המכיל 500 מיקרומטר Ca 2 +. לאחר 10 דקות, צנטריפוגה את התערובת במשך 5 שניות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון זלוף טריים (500 מיקרומטר Ca 2 +, 1 מ&quot;ל) ולשמור את פורעה-02:00 - גלולה myocyte טעון בפתרון זה עבור הקלטות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידה של התכווצות myocyte LV ו- CA התאי 2+ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההקלטה, למלא את הצינור זלוף שיוצא דרךז&#39;קט מים עם פתרון Tyrode, שהוא מחומם מראש ל 36 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כמה טיפות של AM 2 פורעה - השעיה myocyte LV טעון על החדר של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה במשך 5 - דקות 8. לאט perfuse הפתרון Tyrode (2.2 mL / min). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כפתור &quot;התחל&quot; על הפנל הקדמי של הממריץ הדיגיטלי להתחיל גירוי שדה (2 הרץ). הערה: מתח המוצא (10 V, 5 msec משך) מוחלים על מיוציטים בתא באמצעות חוטי פלטינה ממוקמים משני צדי האולם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיוציטים בוחר שחוזה ביציבות (לא אלה מוצגים פיגמנטציית-יתר או התכווצות היפו) להקלטה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את myocyte של בחירה במצב האופקי של מערכת זיהוי מבוסס וידאו sarcomere ולהתאים את הפוקוס של המיקרוסקופ כדי להשיג תמונות אופטימליות של סרקומר. מקם את הקופסה המלבנית הסגולה על האזור שבו סרקומר ברור הם נצפו בבירור עד לממוצעבאורכי sarcomere (שיא אדום) מציג פסגה חדה יחידה (איור 2 א, תמונה תחתונה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את השינויים באורך sarcomere בתגובה לגירוי שדה (איור 2 א &#39;וב&#39;). הערה: השתמש מיוציטים טעונים בתוך 1 - 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הצמצם של המצלמה כך שהשדה במערכת זיהוי sarcomere וידאו מבוסס הוא בגודל של (איור 2 א) myocyte. לעורר את myocyte עם עירור ב 360 ננומטר / 380 ננומטר פליטה ב 510 ננומטר (תדירות הרכישה 1,000 הרץ). קיצור sarcomere שיא ויחס AM Fura2 עם גירוי שדה (תרשים 2B). </li></ol></li></ol> 5. הערכת רגישות 2+ Myofilament Ca <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע אורכי sarcomere ו Ca 2 + ארעי ב יציב (10 - 20 עקבות) ואת עלילת לולאת שלב המטוס של יחס פורעה-2 לעומת אורך sarcomere מאותו myocyte (שניהם עם ערך נמדדשינויים של ודלתה; איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל עלילה, להגדיר יחס -2 פורעה ב -50 הרפיה% (50 EC, איור 2C). השוואת שתי הלולאה ו- EC 50 של כל התערבות. </li></ol>

<ol>
	<li>Bers, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+excitation-contraction+coupling.">Cardiac excitation-contraction coupling.</a> Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).</li><li>Eisner, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analysis+of+calcium+cycling+in+cardiac+muscle.">Integrative analysis of calcium cycling in cardiac muscle.</a> Circ Res. 87 (12), 1087-1094 (2000).</li><li>Palmiter, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+regulating+the+myofilament+response+to+Ca2+:+implications+of+mutations+causal+for+familial+hypertrophic+cardiomyopathy.">Molecular mechanisms regulating the myofilament response to Ca2+: implications of mutations causal for familial hypertrophic cardiomyopathy.</a> Basic Res Cardiol. 92 (S1), 63-74 (1997).</li><li>Missiaen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+intracellular+Ca2++homeostasis+and+disease.">Abnormal intracellular Ca2+ homeostasis and disease.</a> Cell Calcium. 28 (1), 1-21 (2000).</li><li>Trafford, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+rapid+and+reversible+method+to+measure+Ca+buffering+and+time-course+of+total+sarcoplasmic+reticulum+Ca+content+in+cardiac+ventricular+myocytes.">A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes.</a> Pflugers Arch. 437 (3), 501-503 (1999).</li><li>Berlin, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+cytosolic+calcium+buffering+properties+of+single+rat+cardiac+myocytes.">Intrinsic cytosolic calcium buffering properties of single rat cardiac myocytes.</a> Biophys J. 67 (4), 1775-1787 (1994).</li><li>Robertson, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+time-course+of+Ca2++exchange+with+calmodulin,+troponin,+parvalbumin,+and+myosin+in+response+to+transient+increases+in+Ca2+.">The time-course of Ca2+ exchange with calmodulin, troponin, parvalbumin, and myosin in response to transient increases in Ca2+.</a> Biophys J. 34 (3), 559-569 (1981).</li><li>Schober, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofilament+Ca2++sensitization+increases+cytosolic+Ca2++binding+affinity,+alters+intracellular+Ca2++homeostasis,+and+causes+pause-dependent+Ca2+-triggered+arrhythmia.">Myofilament Ca2+ sensitization increases cytosolic Ca2+ binding affinity, alters intracellular Ca2+ homeostasis, and causes pause-dependent Ca2+-triggered arrhythmia.</a> Circ Res. 112 (2), 170-179 (2012).</li><li>Briston, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balanced+changes+in+Ca+buffering+by+SERCA+and+troponin+contribute+to+Ca+handling+during+&#946;-adrenergic+stimulation+in+cardiac+myocytes.">Balanced changes in Ca buffering by SERCA and troponin contribute to Ca handling during &#946;-adrenergic stimulation in cardiac myocytes.</a> Cardiovasc Res. 104 (2), 347-354 (2014).</li><li>Patel, B. G., Wilder, T., John Solaro, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+control+of+cardiac+myofilament+response+to+calcium+by+S-glutathionylation+at+specific+sites+of+myosin+binding+protein+C.">Novel control of cardiac myofilament response to calcium by S-glutathionylation at specific sites of myosin binding protein C.</a> Front Physiol. 4, 336 (2013).</li><li>Jin, C. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofilament+Ca2++desensitization+mediates+positive+lusitropic+effect+of+neuronal+nitric+oxide+synthase+in+left+ventricular+myocytes+from+murine+hypertensive+heart.">Myofilament Ca2+ desensitization mediates positive lusitropic effect of neuronal nitric oxide synthase in left ventricular myocytes from murine hypertensive heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 60, 107-115 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+L-type+Ca2++channel+activity+by+neuronal+nitric+oxide+synthase+and+myofilament+Ca2++sensitivity+in+cardiac+myocytes+from+hypertensive+rat.">Modulation of L-type Ca2+ channel activity by neuronal nitric oxide synthase and myofilament Ca2+ sensitivity in cardiac myocytes from hypertensive rat.</a> Cell Calcium. 58 (3), 264-274 (2015).</li><li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cardiomyocyte+isolation,+culture,+and+gene+transfer.">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).</li><li>Spurgeon, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+calcium+and+myofilaments+in+single+rat+cardiac+myocytes+achieve+a+dynamic+equilibrium+during+twitch+relaxation.">Cytosolic calcium and myofilaments in single rat cardiac myocytes achieve a dynamic equilibrium during twitch relaxation.</a> J Physiol. 447, 83-102 (1992).</li><li>Preston, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+effects+of+the+DCM+mutant+Gly159Asp+troponin+C+in+skinned+muscle+fibres.">Functional effects of the DCM mutant Gly159Asp troponin C in skinned muscle fibres.</a> Pflugers Arch. 453 (6), 771-776 (2007).</li><li>Willott, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Troponin+that+cause+HCM,+DCM+AND+RCM:+what+can+we+learn+about+thin+filament+function?.">Mutations in Troponin that cause HCM, DCM AND RCM: what can we learn about thin filament function?.</a> J Mol Cell Cardiol. 48 (5), 882-892 (2010).</li><li>Yasuda, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+study+contraction+characteristics+of+a+single+cardiac+myocyte+using+carbon+fibers.">A novel method to study contraction characteristics of a single cardiac myocyte using carbon fibers.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (3), H1442-H1446 (2001).</li><li>Sears, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+neuronal+nitric+oxide+synthase+isoform+regulates+myocardial+contraction+and+calcium+handling.">Cardiac neuronal nitric oxide synthase isoform regulates myocardial contraction and calcium handling.</a> Circ Res. 92 (5), e52-e59 (2003).</li><li>Ashley, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+nitric+oxide+synthase+1+regulates+basal+and+beta-adrenergic+contractility+in+murine+ventricular+myocytes.">Cardiac nitric oxide synthase 1 regulates basal and beta-adrenergic contractility in murine ventricular myocytes.</a> Circulation. 105 (25), 3011-3016 (2002).</li><li>Zhang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+phospholamban+phosphorylation+is+associated+with+impaired+relaxation+in+left+ventricular+myocytes+from+neuronal+NO+synthase-deficient+mice.">Reduced phospholamban phosphorylation is associated with impaired relaxation in left ventricular myocytes from neuronal NO synthase-deficient mice.</a> Circ Res. 102 (2), 242-249 (2008).</li><li>Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Fura-2+for+measurements+of+cytosolic+free+calcium.">Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium.</a> Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).</li><li>Grynkiewicz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

כאן אנו מתארים את הפרוטוקולים כדי להעריך את השינויים של רגישות 2+ myofilament Ca ב myocyte הלב יחיד מבודד ולהדגיש את החשיבות של מדידת פרמטר זה לצד תכונות אלקטרו, הארעיים Ca 2 + תאיים, ודינמיקה myofilament. הסיבה לכך היא כי ההקלטות של אחד או שניים מהפרמטרים לא יכולות להסביר את...

צימוד עירור-התכווצות הלב (EC) הוא ערכת היסוד לניתוח תכונות מכניות של שריר הלב, כלומר, הפונקציה התכווצות של הלב 1,2. צימוד EC הוא שיזם שלילת קוטביות הממברנה משנית לפעילות של תעלות יונים sarcolemmal (למשל, ערוץ Na + מתח מגודרת, אשר ניתן למדוד באמצעות טכניקות תיקון- clamp). ההפעלה הבאה של זרם מתח מגודר L- סוג Ca 2 + ערוצים (LTCCs) ו Ca 2 + דרך LTCCs לעורר את חלק הארי של Ca 2 + שחרור דרך קולטני ryanodine (RyRs), גברת ריכוז cytosolic Ca 2 + מ nanomolar (ננומטר ) כדי מיקרו ברמה (מיקרומטר). כגון עלייה Ca cytosolic 2+ מקדמת Ca 2 + מחייבת טרופונין C (TNC) ב חוטים דקים מעוררת שינויים מרחביים של מתחם הנימה כדי להקל על האינטראקציה תקטין שרירן ומשיגה myocardi<html> אל התכווצות 3. מנגד, cytosolic Ca 2 + מחדש uptaken בחזרה הרטיקולום sarcoplasmic (SR) דרך Ca 2 + -ATPase ב SR (SERCA2a) או הנמתח מן myocyte באמצעות מחליפי Na + / Ca 2 + ואת plasmalemmal Ca 2 + ATPase 1,2. כתוצאה מכך, הירידה Ca cytosolic 2+ instigates שינויים מרחביים של חוטים דקים חזרה למצב המקורי, וכתוצאה מכך ניתוק של אקטין שרירן myocyte הרפיה 1-3. לפי שיטה זו, את הפעילות של SERCA2a נחשבת בדרך כלל כדי לקבוע את המהירות של הרפיה שריר הלב כי זה חשבונות עבור 70 - 90% של הסרת cytosolic Ca 2 + ברוב תאי לב יונקים 1. ככזה, טיפול Ca 2+ נורמלי ידי LTCC, RyR ו SERCA2a, וכו &#39;כבר נחשב המנגנונים העיקריים עבור התכווצות לקויה ורוגע בלב החולה 1-4. &gt; במציאות, חינם cytosolic Ca 2 + שמתפקד השליח בחשבונות צימוד EC כ 1% בסך הכל Ca תאיים 2+ ואת רוב Ca 2 + מאוגד מאגרים תאיים Ca 2 + 5,6. זאת בשל העובדה כי מאגרים שונים Ca 2+ נמצאים בשפע myocytes לב, למשל, פוספוליפידים בממברנה, ATP, phosphocreatine, calmodulin, parvalbumin, myofibril TNC, שרירן, SERCA2a, ו calsequestrin ב SR. 5,6,7. ביניהם, SERCA2a ו TNC הם מאגרי Ca 2+ השולט 5,6,7. יתר על כן, Ca 2 + מחייב המאגרים שלה הוא תהליך דינמי במהלך עווית (למשל, 30-50% של Ca 2 + נקשרו TNC ו לנתק ממנו במהלך Ca 2 + ארעיים 7) ושינוי Ca 2 + מחייב גורם נוסף &quot;לשחרר&quot; של חינם Ca 2 + אל cytosol, תוצאות בהתאמות של Ca התאי 2+ קונצרט כלשהוentration. כתוצאה מכך, הפרעות של רמת תאיים Ca 2 + גורמות תנועות myofilament חריגות, אשר הן המבשרים של חוסר תפקוד התכווצות והפרעות קצב 8,9. גורמים רבים (הן פיזיולוגיים ופתולוגיים) יכול להיות מקורות שינויים שלאחר תעתיק של חלבונים myofilament, המשפיעים חציצה myofilament Ca 2+ myofilament רגישות Ca 2 + 8-10. לאחרונה, דווח כי מוטציות בחלבוני myofilament להגדיל את Ca 2 + זיקה מחייבת וטיפול תאיים Ca 2 +, מפעיל הגברה תלוית הפסקה של Ca 2 + ארעי, חריגת Ca 2 + שחרור, הפרעות קצב 8. עולים בקנה אחד עם המושג הזה, אנחנו גם הראינו כי הפחתת רגישות myofilament Ca 2+ בלבבות חולדה עם יתר לחץ דם משתי לרגולציה-אפ של synthase תחמוצת חנקן העצבית קשורות הדיאסטולי מוגבה סיסטולי Ca 2 + רמות11, אשר בתורו, מגביר את הפגיעות של LTCC כדי האיון התלוי 2+ Ca 12. לפיכך, רגישות 2+ myofilament Ca הוא רגולטור &quot;פעיל&quot; של פונקצית התכווצות הומאוסטזיס תאית Ca 2 + ו myocyte. זה הפך להיות צורך לנתח אינטראקציות בין myofilament ו Ca 2 + טיפול חלבונים לחקירה יסודית של צימוד myocyte EC ותפקוד הלב. כאן אנו מתארים פרוטוקול מעריך את השינויים של רגישות 2+ myofilament Ca ב myocytes לב מבודד. ניתוח מקיף של פרופיל תאיים Ca 2 +, Ca 2 + myofilament רגישות וההתכווצות לחפור מנגנוני רומן מכניקת שריר לב בסיסית.

<table><tbody><tr><td>Sprague Dawley rat</td><td>Koatech</td><td></td><td>8-12 weeks</td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodium</td><td>Hanlim Pharmaceutical (Korea)</td><td>AHN901</td><td>Insurance code:645301220</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Merck</td><td>8.08616.1000</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&amp;nbsp;&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>71649</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Fetal Albumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Protease</td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 (AM)</td><td>Molecular Probes</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127 20% solution in DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Shaking Water Bath</td><td>Chang Shin Scientific</td><td>Model: C-108</td><td></td></tr><tr><td>IonWizard Softwae Suite</td><td>IonOptix Ltd</td><td>Experimental Builder</td><td>Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes</td></tr><tr><td>Myocyte Calcium &amp;amp; Contractility Recording System</td><td>IonOptix Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Circulating Water Bath</td><td>BS-Tech</td><td>BW2-8</td><td></td></tr><tr><td>Myocyte Fluorescence Microscope</td><td>Nikon</td><td>DIATPHOTO 200</td><td></td></tr><tr><td>MyoCam-S Power</td><td>IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence &amp;amp; Video Detection</td><td>IonOptix</td><td>MyoCam-S</td><td></td></tr><tr><td>CFA300</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMT400</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence &amp;amp; System Interface</td><td>IonOptix</td><td>FSI700</td><td></td></tr><tr><td>Excitation Light Source</td><td>IonOptix</td><td>mSTEP</td><td></td></tr><tr><td>High intensity ARC Lamp Power supply</td><td>Cairn Reseach</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter wheel controller</td><td>IonOptix</td><td>GB/MUS200</td><td></td></tr><tr><td>Digital Stimulator</td><td>Medical Systems Corportion</td><td>S-98 Mutimode</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Compositions of Experimental Solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentration (mmol) 135</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Concentration (mmol) 5.4</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Concentration (mmol) 5</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Concentration (mmol) 5</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td>Concentration (mmol) 3.5</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>CB2742654</td><td>Concentration (mmol) 20</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&amp;nbsp;&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>71649</td><td>Concentration (mmol) 0.4</td></tr><tr><td>Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentration (mmol) 120</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Concentration (mmol) 5.4</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Concentration (mmol) 10</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Concentration (mmol) 5.5</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentration (mmol) 0.2</td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>Concentration (mmol) 29</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td>Concentration (mmol) 5</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td>Concentration (mmol) 5</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>CB2742654</td><td>Concentration (mmol) 20</td></tr><tr><td>Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentration (mmol) 141.4</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Concentration (mmol) 4</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>Concentration (mmol) 0.33</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Concentration (mmol) 10</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Concentration (mmol) 5.5</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentration (mmol) 1.8&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td>Concentration (mmol) 1</td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>Concentration (mmol) 14.5</td></tr><tr><td>Collangenase Solution 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolation Solution (30mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml)</td><td></td><td></td><td>Concentration (mmol) 1.67 mg/mL</td></tr><tr><td>Collagenase Type 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td>Concentration (mmol) 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Protease</td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td>Concentration (mmol) 0.1 mg/mL</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentration (mmol) 0.05 mM</td></tr><tr><td>Collangenase Solution 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolation Solution (20mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL)</td><td></td><td></td><td>Concentration (mmol) 1.67 mg/mL</td></tr><tr><td>Collagenase Type 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td>Concentration (mmol) 1 mg/mL</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentration (mmol) 0.05 mM</td></tr><tr><td>BSA solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolation Solution (40mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Fetal Albumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>Concentration (mmol) 400 mg</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentration (mmol) 1mM</td></tr></tbody></table>

assessment of myofilament ca2+ sensitivity underlying cardiac excitation-contraction coupling

אי ספיקת לב והפרעות קצב הלב הם הגורמים המובילים לתמותה ותחלואה בעולם. עם זאת, המנגנון של מחלה ו תקלת שריר לב בלב החולה נשאר להתברר במלואה. ראיות משכנעות אחרונות מוכיחות כי שינויים ברגישות 2+ myofilament Ca להשפיע Ca התאי 2+ פעילויות הומאוסטזיס יון ערוץ myocytes הלב, המנגנונים החיוניים אחראים פוטנציאל הפעולה של הלב והתכווצות בלבבות בריאים וחולים. ואכן, פעילויות של תעלות יונים מובילי שבבסיס פוטנציאל פעולת לב (למשל, Na +, Ca 2 + ו K + ערוצים מחליפים Na + -Ca 2+) ו- CA תאי 2+ טיפול חלבונים (למשל., קולטנים ryanodine ו- CA 2+ -ATPase ב הרטיקולום sarcoplasmic (SERCA2a) או phospholamban ו זירחון שלה) נמדדים כמקובל כדי evaluאכול את המנגנונים הבסיסיים של התכווצות עירור לב (EC) צימוד. שני פעילויות חשמל בקרום והשינויים 2+ Ca התאיים הן אותות ההדק של צימוד EC, ואילו myofilament היא היחידה התפקודית של התכווצות והרפיה, ו myofilament Ca רגיש 2+ הכרחית ביישום ביצועי myofibril. אף על פי כן, כמה מחקרים לשלב myofilament רגישות Ca 2 + לתוך האנליזה הפונקציונלית של שריר הלב, אלא אם כן הוא המוקד של המחקר. כאן אנו מתארים פרוטוקול המודד קיצור sarcomere / מחדש התארכות ורמת תאיים Ca 2 + באמצעות פורעה -2 AM (זיהוי ratiometric) ולהעריך את השינויים של רגישות 2+ myofilament Ca ב myocytes לב מלבבות חולדה. המטרה העיקרית היא להדגיש myofilament שרגישות 2+ Ca צריכה להילקח בחשבון צימוד EC לניתוח מכניסטית. חקירה מקיפה של iבערוצים, מובילי יון, טיפול Ca 2 + תאיים, ורגישות 2+ myofilament Ca העומדים בבסיס התכווצות myocyte בלבבות בריאים וחולים יספק מידע רב ערך לתכנון אסטרטגיות יעילות יותר של translational ואת הערך טיפולי.

מיוציטים LV מבודדים לבבות עכברוש נורמלי יתר לחץ דם. רוד בצורה מיוציטים עם פסים ברורים (מייצג סרקומר) ואת צירים יציבים בתגובה לגירוי שדה נחשבים להיות מיוציטים האופטימלי ונבחרים להקלטות (איור 2 א). בדוגמה המוצגת F igure 2A, פורעה 2 לפני הצה?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling at JoVE.com

Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca2+ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca2+ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

הערכת Myofilament Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; עירור-התכווצות לב ביסוד רגישה זיווגים

Heart failure and cardiac arrhythmias are the leading causes of mortality and morbidity worldwide. However, the mechanism of pathogenesis and myocardial ...

assessment-myofilament-ca2-sensitivity-underlying-cardiac-excitation

Research

JoVE Journal

Biology

Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

9.4K Views.  Seoul National University College of Medicine. This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca2+ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca2+ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts. 

Video: Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

מדידת Fluxes סידן מהיר ב cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum (SR) serves as a Ca2+ reservoir for contraction, which reuptakes intracellular Ca2+ during relaxation. The SR Ca2+ reserve available for beats is determinate for cardiac contractibility, and the removal of intracellular Ca2+ is critical for cardiac diastolic function. Under some pathophysiological conditions, such as diabetes and heart failure, impaired calcium clearance and SR Ca2+ store in cardiomyocytes may be involved in the progress of cardiac dysfunction. Here, we describe a protocol to evaluate SRCa2+ reserve and diastolic Ca2+ removal. Briefly, a single cardiomyocyte was enzymatically isolated, and the intracellular Ca2+ fluorescence indicated by Fura-2 was recorded by a calcium imaging system. To employ caffeine for inducing total SR Ca2+ release, we preset an automatic perfusion switch program by interlinking the stimulation system and the perfusion system. Then, the mono-exponential curve fitting was used for analyzing decay time constants of calcium transients and caffeine-induced calcium pulses. Accordingly, the contribution of the SR Ca2+-ATPase (SERCA) and Na+-Ca2+ exchanger (NCX) to diastolic calcium removal was evaluated.

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Here, we describe a protocol to evaluate sarcoplasmic reticulum Ca2+ reserve and diastolic calcium removal function in cardiomyocytes by a calcium imaging system.

הערכה של רשת Sarcoplasmic סידן סידן הדיאסטולי שימור, תאיים הסרת Cardiomyocytes חדרית מבודד

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

Medicine

Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

In cardiac muscle, intracellular Ca2+ transients activate contractile myofilaments, causing contraction, macroscopic shortening, and geometric&#160;deformation. Our understanding of the internal relationships between these events has been limited because we can neither &#39;see&#39; inside the muscle nor precisely track the spatio-temporal nature of excitation-contraction dynamics. To resolve these problems, we have constructed a device that combines a suite of imaging modalities. Specifically, it integrates a brightfield microscope to measure local changes of sarcomere length and tissue strain, a fluorescence microscope to visualize the Ca2+ transient, and an optical coherence tomograph to capture the tissue&#39;s geometric&#160;changes throughout the time-course of a cardiac cycle. We present here the imaging infrastructure and associated data collection framework. Data are collected from isolated rod-like tissue structures known as trabeculae carneae. In our instrument, a pair of position-controlled platinum hooks hold each end of an ex vivo muscle sample while it is continuously superfused with nutrient-rich saline solution. The hooks are under independent control, permitting real-time control of muscle length and force. Lengthwise translation enables the piecewise scanning of the sample, overcoming limitations associated with the relative size of the microscope imaging window (540 &#181;m by 540 &#181;m) and the length of a typical trabecula (&#62;2000 &#181;m). Platinum electrodes at either end of the muscle chamber stimulate the trabecula at a user-defined rate. We exploit the stimulation signal as a trigger for synchronizing the data from each imaging window to reconstruct the entire sample twitching under steady-state conditions. Applying image-processing techniques to these brightfield imaging data provides tissue displacement and sarcomere length maps. Such a collection of data, when incorporated into an experiment-modeling pipeline, will provide a deeper understanding of muscle contractile homogeneity and heterogeneity in physiology and pathophysiology.

Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

This protocol presents a collection of sarcomere, calcium, and macroscopic geometric&#160;data from an actively contracting cardiac trabecula ex vivo. These simultaneous measurements are made possible by the integration of three imaging modalities.

ברייטפילד בו זמנית, פלואורסצנטיות והדמיה טומוגרפית קוהרנטית אופטית של התלקחות טרבקולה לב Ex Vivo

In cardiac muscle, intracellular Ca2+ transients activate contractile myofilaments, causing contraction, macroscopic shortening, and ...

Bioengineering

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

הערכת Vivo לשעבר של התכווצות, ועיפנות Alternans בשרירי שלד מבודדים

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

הערכה של סידן ניצוצות בסיבי שריר שלד שלמים

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring apparatus and a motor to perform functional studies. These studies will allow measurement of cardiomyocyte stiffness (passive force) and its activation with different calcium (Ca2+)-containing solutions to determine, amongst others: maximum force development, myofilament Ca2+-sensitivity (pCa50), cooperativity (nHill) and the rate of force redevelopment (ktr). This method also enables determination of the effects of drugs acting directly on myofilaments and of the expression of exogenous recombinant proteins on both active and passive properties of cardiomyocytes. Clinically, skinned cardiomyocyte studies highlight the pathophysiology of many myocardial diseases and allow in vitro assessment of the impact of therapeutic interventions targeting the myofilaments. Altogether, this technique enables the clarification of cardiac pathophysiology by investigating correlations between in vitro and in vivo parameters in animal models and human tissue obtained during open heart or transplant surgery.

This protocol aims to describe step-by-step the technique of extraction and assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes. This methodology allows measurement and acutemodulation of myofilament function using small frozen biopsies that can be collected from different cardiac locations, from mice to men.

להערכת ויטרו של תפקוד הלב באמצעות קרדיומיוציטים עור

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Electromechanical Assessment of Optogenetically Modulated Cardiomyocyte Activity

Over the past two decades, optogenetic tools have been established as potent means to modulate cell-type specific activity in excitable tissues, including the heart. While Channelrhodopsin-2 (ChR2) is a common tool to depolarize the membrane potential in cardiomyocytes (CM), potentially eliciting action potentials (AP), an effective tool for reliable silencing of CM activity has been missing. It has been suggested to use anion channelrhodopsins (ACR) for optogenetic inhibition. Here, we describe a protocol to assess the effects of activating the natural ACR GtACR1 from Guillardia theta in cultured rabbit CM. Primary readouts are electrophysiological patch-clamp recordings and optical tracking of CM contractions, both performed while applying different patterns of light stimulation. The protocol includes CM isolation from rabbit heart, seeding and culturing of the cells for up to 4 days, transduction via adenovirus coding for the light-gated chloride channel, preparation of patch-clamp and carbon fiber setups, data collection and analysis. Using the patch-clamp technique in whole-cell configuration allows one to record light-activated currents (in voltage-clamp mode, V-clamp) and AP (current-clamp mode, I-clamp) in real time. In addition to patch-clamp experiments, we conduct contractility measurements for functional assessment of CM activity without disturbing the intracellular milieu. To do so, cells are mechanically preloaded using carbon fibers and contractions are recorded by tracking changes in sarcomere length and carbon fiber distance. Data analysis includes assessment of AP duration from I-clamp recordings, peak currents from V-clamp recordings and force calculation from carbon fiber measurements. The described protocol can be applied to the testing of biophysical effects of different optogenetic actuators on CM activity, a prerequisite for the development of a mechanistic understanding of optogenetic experiments in cardiac tissue and whole hearts.

We present a protocol for evaluating the electromechanical effects of GtACR1 activation in rabbit cardiomyocytes. We provide detailed information on cell isolation, culturing and adenoviral transduction, and on functional experiments with the patch-clamp and carbon-fiber techniques.

הערכה אלקטרו-מגנטית של אלקטרואופטיקה פעילות מודולציט

Over the past two decades, optogenetic tools have been established as potent means to modulate cell-type specific activity in excitable tissues, including ...

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

מדידות התכווצות שרירים בpapillary מבודדים לחקירת הלב Inotropy בעכברים

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

מיפוי אופטי של Intra-sarcoplasmic reticulum Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ופוטנציאל הטרנסממברני בלב ארנב Langendorff-perfused

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury and/or remodeling. One approach for assessing these functional alterations utilizes unloaded shortening and Ca2+ transient analyses in primary adult cardiac myocytes. For this approach, adult myocytes are isolated by collagenase digestion, made Ca2+ tolerant, and then adhered to laminin-coated coverslips, followed by electrical pacing in serum-free media. The general protocol utilizes adult rat cardiac myocytes but can be readily adjusted for primary myocytes from other species. Functional alterations in myocytes from injured hearts can be compared to sham myocytes and/or to in vitro therapeutic treatments. The methodology includes the essential elements needed for myocyte pacing, along with the cell chamber and platform components. The detailed protocol for this approach incorporates the steps for measuring unloaded shortening by sarcomere length detection and cellular Ca2+ transients measured with the ratiometric indicator Fura-2 AM, as well as for raw data analysis.

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

A set of protocols are presented that describe the measurement of contractile function via sarcomere length detection along with calcium (Ca2+) transient measurement in isolated rat myocytes. The application of this approach for studies in animal models of heart failure is also included.

ניתוח של תפקוד לקוי של התכווצות הלב ו- Ca2 + טרנזיינטים במיוציטים של מכרסמים

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury ...

הערכת Myofilament Ca

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video