מחקר במעבדות ממומן על ידי קרן פריץ-בנדר, מינכן, גרמניה (לTD) ואוניברסיטה וויטן / מענק מחקר הפנימי Herdecke (לW.-KL). ברצוננו להודות לפרופ &#39;ד&quot;ר ד&quot;ר פרנק Thévenod (מכון לפיסיולוגיה, פתופיזיולוגיה וטוקסיקולוגיה, האוניברסיטה וויטן / Herdecke) להצעות מועילות.

1. הכנת ריאגנטים ופתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הפתרון של האנק שונה המאוזן מלח (HBSS) (מ&quot;מ: 136.9 NaCl, KCl 5.37, 0.34 Na 2 4 HPO, 0.44 KH 2 PO 4, 4.17 NaHCO 3, pH 7.2, לא פנול אדום). חנות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 1.5 M CaCl 2 ו 2 M 4 חומצה (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) (pH 7.2) פתרונות מניות באמצעות מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 250 מניות מ&quot;מ של probenecid. לצורת החומצה החופשית (המכונה לעתים קרובות במים מסיסים), לפזר אבקת probenecid ב 1 N NaOH, למלא עד שלושה רבעים מהנפח הסופי עם מים מזוקקים ולכייל לאט pH 7.4 עם 1 N HCl. חנות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר צבע קרום ניאון סידן חדיר מחייב בsulfoxide דימתיל נטול מים (DMSO) לריכוז מניות של 1 מ&quot;מ. חנות ב -20 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני כל ניסוי, טרי להכין H המכיל probenecidBSS שטף חיץ (PHF) על ידי שילוב של שינוי HBSS עם (בריכוזים סופיים) 1.5 מ&quot;מ CaCl 2, 10 HEPES מ&quot;מ, pH 7.2, 5% בסרום שור עוברי, 2 probenecid מ&quot;מ, ו5.55 גלוקוז מ&quot;מ. חם 37 מעלות צלזיוס. </li></ol> תרבות 2. תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צלחת 2.5 x 10 5 כליות הפרוקסימלי אבובית (WKPT-0293 Cl.2) לכל טוב של צלחת 6 צלחת גם או 35 מ&quot;מ במדיום התרבות הסטנדרטי ולגדול במשך 2 ימים להגיע confluency של כ -70%. </li></ol> טעינת צבע 3. סיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל מנה טובה או, לערבב מדיום תרבות מיליליטר 1 המכיל 5% בסרום שור עוברי, צבע סיד חדיר 4 תאי מיקרומטר מחייב ו -2 probenecid מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את התרבות בינונית עם תערובת צבע טעינת 1 מיליליטר בכל טוב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחממה humidified עם 5% CO 2. מכסה את הצלחת בנייר אלומיניום כדי למנוע הלבנה של מחוון הניאון. </li></ol> 4. הכנת CeLLS לcytometry הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון חומצת טריפסין-ethylenediaminetetraacetic 0.05% חמים (EDTA) עד 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון טעינת צבע סידן לשאוב מכל טוב ולהוסיף טריפסין 1 מיליליטר לאורך הקיר גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס עד שכל התאים מנותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאי צינור 1.5 מיליליטר וכדור על ידי צנטריפוגה בmicrocentrifuge ב 10,000 גרם במשך דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant מבלי להפריע גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים על ידי הוספת חיץ PHF 1 מ&quot;ל וגלול על ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב 10,000 גרם במשך דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.6. ו4.7. עוד שתי פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים בנפח סופי של 500 חיץ PHF μl ולהשתמש בתאים לניסויים בשעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונליים: תאי ספירה כדי לקבוע את ריכוז התא ולהשתמש 5 x 04-01 אוקטובר x 10 5 תאים לכל מדידה. </li></ol> 5. הזרימה CYTהתקנת ometer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל cytometer הזרימה, לפתוח את מגירת fluidics ולוחץ על מתג דו-מצבי שסתום האוורור כדי להגדיל את לחץ האוויר של מיכל נדן הנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;ראש&quot; המכשיר כדי להסיר בועות אוויר המתגורר פוטנציאליות מתוך הצינורות הפנימיים ותא הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנת cytometry זרימה, שני חלונות עלילת נקודה פתוחים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלילת הנקודה הראשונה דורשת קדימה אור מפוזר (FSC) עבור פרמטר X ואור בצד מפוזר (SSC) לפרמטר Y כדי לשלוט על האיכות של התאים בתוך המדגם באמצעות גודלם והגרעיניות שלהם, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלילת הנקודה השנייה מודדת את עוצמת הקרינה של הצבע-קשור סידן. בחר את ערוץ גילוי הקרינה המתאים לפרמטר Y באמצעות סולם וזמן לוגריתמים בשניות עבור פרמטר X בקנה מידה ליניארי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את קצב הזרימה ל&quot; גבוה &quot;. </li></ol> 6. cytometry הזרימה Measurement <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את המדידות בRT. בcytometry זרימת צינור דגימה (11.5 x 75 מ&quot;מ), להוסיף למאגר PHF 480 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף השעיה תא 20 μl בקצרה מערבולת לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את זרוע תמיכת צינור בצד ולמקם את צינור הדגימה מעל צינור הזרקת מדגם עד חותם חזק נוצר. החזר את זרוע תמיכת צינור לעמדה המקורית שלו במרכז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעל מדידה על ידי התאמת ערוץ הקרינה כזו שעוצמת הקרינה הממוצעת של המדגם היא בכ -10 2 על ציר y. לשמור ולהשתמש בניסויים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל ניסוי, חזור על שלבים 6.1-6.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקרינה בסיס שיא 50 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השהה מדידה, להסיר את צינור המדגם, להוסיף מתחם של עניין, בקצרה מערבולת ולחזור לצינור הזרקת מדגם. צעד זה לא אמור לקחת יותר מ -15 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קורות חיים מדידה ולהמשיך לסך כולל של 204.8 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש i סידןonophore, כגון ionomycin (10 מיקרומטר), וchelator סידן, כגון חומצת tetraacetic אתילן גליקול (EGTA), MnCl 2 או CoCl 2 (2 מ&quot;מ), לבקרות חיוביות ושליליות, בהתאמה. </li></ol> ניתוח 7. נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח נתונים באמצעות תוכנת cytometry הזרימה ייעודית לניתוח לא מקוון, כגון WinMDI (ממשק המסמך מרובה של Windows עבור cytometry הזרימה), חבילת תוכנה חופשית שפותחה על ידי ג &#39;טרוטר בסקריפס המכון, מתקן cytometry הזרימה Core. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח עלילת נקודה עם פרמטרים SSC וFSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את האזור של תאים לניתוח שימוש באפשרות &quot;האזורים&quot; (לחץ לחיצה ימנית על התמונה) שלא לכלול תאים מתים או פסולת תא שנמצאה בפינה השמאלית התחתונה מניתוח נתונים (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח Quadrant (איור 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח עלילת צפיפות עם זמן על ציר X ועוצמת הקרינה על ציר y. להשתמש בכל האירועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלנודואר באותו האזור gating כמו ב7.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את הנתונים על-ידי שימוש באפשרות &quot;Quadrant&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את המפרידים הרבע כך הקו האנכי ממוקם בזמן בנוסף מתחם והקו האופקי ממוקם במרכזה של הקרינה הבסיסית בבקרה. ודא שהמיקום של מפרידי רבע שווה בכל הדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחוז התאים בכל רבע מוצג בכל פינה (איור 2). להשוות ברבע הימני העליון (UR) בין דגימות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח היסטוגרמה (איור 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את נתוני בקרה בחלון היסטוגרמה עם עוצמת הקרינה על ציר ה- x ואירועים על ציר y. להשתמש בכל האירועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסקירה ציורית, להוסיף את נתוני הבדיקה להשוואה לעלילת השליטה כחלקות כיסוי (ללכת קובץ → פתח קובץ → כיסוי → בחר קובץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח כמותי, היסטוגרמה אחת לנצחיש להשתמש Dows. שער אוכלוסיית התא באמצעות אזור R1 מצעד 7.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשליטה שאינו מטופלים, להשתמש בפונקציית הסמן (&quot;מרקרים&quot;) כדי לסמן את האזור לניתוח מתחיל מנקודת האמצע בין המינימום והקרינה המרבית של שיא השליטה ומסתיים בעוצמת הקרינה המרבית. אחוז התאים באזור זה מחושב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזור נתונים מחלון הסטטיסטיקה. חזור לנותר קבצי נתונים תוך שימוש באותו האזור המסומן לניתוח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח עוצמת הקרינה (איור 4) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח עלילת נקודה עם זמן על ציר X ועוצמת הקרינה על ציר y. להשתמש בכל האירועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר &quot;קינטיקס Mode&quot; ו- &quot;Overlay קינטיקס קו&quot;. קו כחול יופיע בעלילת הנקודה המייצגת את עוצמת הקרינה הממוצעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את זרימת סידן היחסית על ידי יצירת אזורים מלבניים מרובים. כל אזור צריך להיות awidth של כ &quot;50&quot;, שהוא שווה ערך ל &quot;10 שניות&quot;. להגדיר עד 15 אזורים מלבניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזר כימות מחלון הסטטיסטיקה ולהעתיק לגיליון אלקטרוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בנתוני y-ממוצע לניתוח. לחשב את הממוצע של R2 לR6, שהוא שווה ערך ל20-50 שניות. זהו הערך הבסיסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מרווח זמן מתאים לניתוח זרימת סידן (תלוי בהופעה, משך ועוצמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את אותות סידן מכל אזור בתוך מרווח זמן יחסי זה לערך הבסיס הממוצע, כלומר, אות הקרינה לפני בנוסף מתחם, אשר נקבע על 100%. לקבוע את התוחלת וסטיית תקן של האזורים לפרסם בנוסף מתחם; זה אות סידן הממוצעת שמעוררת את המתחם. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li><li>Brini, M., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+pumps+in+health+and+disease.">Calcium pumps in health and disease.</a> Physiol Rev. 89, 1341-1378 (2009).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling.">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361, 315-325 (1993).</li><li>Putney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+actions+of+calcium-mobilizing+messenger,+inositol+1,4,5-trisphosphate.">Formation and actions of calcium-mobilizing messenger, inositol 1,4,5-trisphosphate.</a> Am J Physiol. 252, 149-157 (1987).</li><li>Putney, J. W., Ribeiro, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+between+the+plasma+membrane+and+endoplasmic+reticulum+calcium+stores.">Signaling pathways between the plasma membrane and endoplasmic reticulum calcium stores.</a> Cell Mol Life Sci. 57, 1272-1286 (2000).</li><li>Soboloff, J., Rothberg, B. S., Madesh, M., Gill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIM+proteins:+dynamic+calcium+signal+transducers.">STIM proteins: dynamic calcium signal transducers.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 549-565 (2012).</li><li>Williams, G. S., Boyman, L., Chikando, A. C., Khairallah, R. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+uptake.">Mitochondrial calcium uptake.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10479-10486 (2013).</li><li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+calcium+and+cell+death:+a+deadly+triad+in+neurodegeneration.">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787, 335-344 (2009).</li><li>Monteith, G. R., Davis, F. M., Roberts-Thomson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channels+and+pumps+in+cancer:+changes+and+consequences.">Calcium channels and pumps in cancer: changes and consequences.</a> J Biol Chem. 287, 31666-31673 (2012).</li><li>Roderick, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+in+the+heart:+when+it's+good,+it's+very+very+good,+but+when+it's+bad,+it's+horrid.">Calcium in the heart: when it's good, it's very very good, but when it's bad, it's horrid.</a> Biochem Soc Trans. 35, 957-961 (2007).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260, 3440-3450 (1985).</li><li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilioplasm+is+a+cellular+compartment+for+calcium+signaling+in+response+to+mechanical+and+chemical+stimuli.">Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli.</a> Cell Mol Life Sci. , (2013).</li><li>Valet, G., Raffael, A., Russmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+intracellular+calcium+in+vital+cells+by+flow-cytometry.">Determination of intracellular calcium in vital cells by flow-cytometry.</a> Naturwissenschaften. 72, 600-602 (1985).</li><li>June, C. H., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+cellular+ionized+calcium+concentration.">Flow cytometric measurement of cellular ionized calcium concentration.</a> Pathology and immunopathology research. 7, 409-432 (1988).</li><li>Ransom, J. T., DiGiusto, D. L., Cambier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+intracellular+calcium+mobilization.">Flow cytometric analysis of intracellular calcium mobilization.</a> Methods Enzymol. 141, 53-63 (1987).</li><li>Gergely, L., Cook, L., Agnello, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+Ca2++flux+measurement+on+isolated+human+B+cells+that+uses+flow+cytometry.">A simplified method for Ca2+ flux measurement on isolated human B cells that uses flow cytometry.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 4, 70-74 (1997).</li><li>Seidel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotransmitter+GABA+is+a+potent+inhibitor+of+the+stromal+cell-derived+factor-1alpha+induced+migration+of+adult+CD133++hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">The neurotransmitter GABA is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1alpha induced migration of adult CD133+ hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Stem cells and development. 16, 827-836 (2007).</li><li>Lee, W. K., Chakraborty, P. K., Roussa, E., Wolff, N. A., Th&#233;venod, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK1/2-dependent+bestrophin-3+expression+prevents+ER-stress-induced+cell+death+in+renal+epithelial+cells+by+reducing+CHOP.">ERK1/2-dependent bestrophin-3 expression prevents ER-stress-induced cell death in renal epithelial cells by reducing CHOP.</a> Biochim Biophys Acta. 1823, 1864-1876 (2012).</li><li>Woost, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+and+characterization+of+proximal+tubule+cells+derived+from+kidneys+of+spontaneously+hypertensive+and+normotensive+rats.">Immortalization and characterization of proximal tubule cells derived from kidneys of spontaneously hypertensive and normotensive rats.</a> Kidney Int. 50, 125-134 (1996).</li><li>Beyer, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benemid,'+p-(di-n-propylsulfamyl)-benzoic+acid;+its+renal+affinity+and+its+elimination.">Benemid,' p-(di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; its renal affinity and its elimination.</a> Am J Physiol. 166, 625-640 (1951).</li><li>Buckley, B. J., Whorton, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunicamycin+increases+intracellular+calcium+levels+in+bovine+aortic+endothelial+cells.">Tunicamycin increases intracellular calcium levels in bovine aortic endothelial cells.</a> Am J Physiol. 273, 1298-1305 (1997).</li><li>Koepsell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SLC22+family+with+transporters+of+organic+cations,+anions+and+zwitterions.">The SLC22 family with transporters of organic cations, anions and zwitterions.</a> Molecular aspects of medicine. 34, 413-435 (2013).</li><li>Dean, M., Hamon, Y., Chimini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+ATP-binding+cassette+(ABC)+transporter+superfamily.">The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily.</a> J Lipid Res. 42, 1007-1017 (2001).</li><li>Brezden, C. B., Hedley, D. W., Rauth, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+expression+of+P-glycoprotein+as+a+determinant+of+loading+with+fluorescent+calcium+probes.">Constitutive expression of P-glycoprotein as a determinant of loading with fluorescent calcium probes.</a> Cytometry. 17, 343-348 (1994).</li><li>Th&#233;venod, F., Friedmann, J. M., Katsen, A. D., Hauser, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+multidrug+resistance+P-glycoprotein+via+nuclear+factor-kappaB+activation+protects+kidney+proximal+tubule+cells+from+cadmium-+and+reactive+oxygen+species-induced+apoptosis.">Up-regulation of multidrug resistance P-glycoprotein via nuclear factor-kappaB activation protects kidney proximal tubule cells from cadmium- and reactive oxygen species-induced apoptosis.</a> J Biol Chem. 275, 1887-1896 (2000).</li><li>Chakraborty, P. K., Lee, W. K., Molitor, M., Wolff, N. A., Th&#233;venod, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadmium+induces+Wnt+signaling+to+upregulate+proliferation+and+survival+genes+in+sub-confluent+kidney+proximal+tubule+cells.">Cadmium induces Wnt signaling to upregulate proliferation and survival genes in sub-confluent kidney proximal tubule cells.</a> Mol Cancer. 9, 102 (2010).</li><li>Jennings, L. K., Dockter, M. E., Wall, C. D., Fox, C. F., Kennedy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+mobilization+in+human+platelets+using+indo-1+and+flow+cytometry.">Calcium mobilization in human platelets using indo-1 and flow cytometry.</a> Blood. 74, 2674-2680 (1989).</li><li>Lopez, M., Olive, D., Mannoni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cytosolic+ionized+calcium+variation+in+polymorphonuclear+leukocytes+using+flow+cytometry+and+Indo-1+AM.">Analysis of cytosolic ionized calcium variation in polymorphonuclear leukocytes using flow cytometry and Indo-1 AM.</a> Cytometry. 10, 165-173 (1989).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

סידן הוא אירוע מרכזי בתהליכים תאיים רבים מתנהגים כמו מולקולת איתות השליח שנייה וגם כאמצעי לתקשורת בין ER ומיטוכונדריה. היכולת למדוד שינויים בריכוזי סידן cytosolic חופשיים היא טכניקה שימושית שיכול לחול על כל תחומי ביולוגיה של תא. ישנן שיטות שונות לזיהוי אותות סידן cytosolic. קלסי, אותות ממחוון סידן ratiometric, כגון פורע-2, נמצאים במעקב בתאים חיים באמצעות התקנת הדמיה הקרינה וריכוזי סידן מוחלטים יכול לנבוע מקביעת עוצמות הקרינה מינימליות ומקסימלי. עם זאת, טכניקה זו דורשת ציוד מיוחד, כגון מיקרוסקופ פלואורסצנטי, הדמיה תא חי להגדיר ותוכנת ניתוח. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה לזיהוי סידן בcytosol של תאי האפיתל חסיד באמצעות cytometry זרימה, שהוא נגיש לרוב המעבדות. Epithelia נמצא בת.ד.ssession של מערך של מובילים אחראים על ההעברה של מטבוליטים, xenobiotics ותרופות. חשיבות מיוחדת הוא superfamily SLC22A, שאליו מובילי קטיון האורגני ואניון האורגני שייכים 22, ואת קלטת ATP מחייבת superfamily (ATP), אשר מונתה התנגדות multidrug חלבוני ABCB1 והתנגדות multidrug גליקופרוטאין-P (MRPs) בין חבריה 23 . ניסויים ראשוניים באמצעות כליות חולדה שורת תאי אבובית הפרוקסימלי WKPT-0293 Cl.2 בוצעו כמתואר בעיתון על ידי אל גרגלי ואח. 16. התאים הוכנסו להשעיה ועמוסה Fluo-3 בבוקר. עם זאת, רק שינוי צנוע נצפה עם ionomycin 10 מיקרומטר (38.14% לעומת 50.95% בשליטה על ידי ניתוח ברבע או 1.78 לקפל על ידי ניתוח אזור מרובה). חוקרים שערנו כי מובילי אפיתל היו אחראים לעניי הטעינה של התאים עם Fluo-3 בבוקר. כדי לעקוף את הבעיה, probenecid זה וPSC833, מעכבי אורגנייםמובילי Nion וP-גליקופרוטאין ההתנגדות מרובה-בהתאמה, יושמו בו זמנית עם סידן מחייב צבע לmonolayers תא. Probenecid השתפר סידן מחייב טעינת צבע, כפי שצוין על ידי עלייה בעוצמת הקרינה בנקודת ההתחלה, ואילו PSC833 אין השפעה, שעומדת בניגוד לדוח קודם בתאים שחלה של אוגר הסיני 24. הבדל זה כנראה טמון ברמות של ABCB1 בשורות תאים השונים; שורת תאי Cl.2 WKPT-0293 נמלי רמה נמוכה אנדוגני של ABCB1, שיכול להיגרם על ידי חומרים רעילים, כגון מתכות רעילות 25,26. השימוש בprobenecid לשפר טעינת צבע סידן יכול להתארך עד סוגי תאים אחרים שמציגים מערכות תחבורת probenecid רגיש, כגון תאים של מערכת העצבים, מחסום דם-מוח ואת הכבד, שבו איתות סידן עשויה לשחק תפקיד באיתות תאית מסלולים. זיהוי קל של סידן מחייב לFluo-3 שקרים בrequirement אחד בלבד גל עירור (506 ננומטר) ואורך גל אחד פליטה (525 ננומטר). עם זאת, נתונים שנוצרו עם סידן אורך גל יחיד מחייב צבעים, כמו צבע שאינה ratiometric, ניתן להשתמש רק לכמת עליות יחסי בסידן cytosolic על בקרות שאינן מטופלים. כדי לקבוע ריכוזי סידן מוחלטים, צבע ratiometric נחוץ משום שינוי רפאים מתרחש לאחר סידן מחייב שמאפשר לתיקון של טעינת צבע לא שוויונית והלבנה. צבע ratiometric הודו-1 כבר נעשה שימוש בזיהוי של גיוס סידן בתאים של מערכת חיסון על ידי cytometry זרימת 27,28 אך עד כה, זה לא בוצע בתאי האפיתל. שימוש בספקטרום הפליטה של שתי הודו-1 UV להתרגש (ננומטר 400 כאשר סידן קשור ו475 ננומטר כאשר סידן חופשי) ניתן לקבוע, שריכוז יוני הסידן cytosolic המוחלט כפי שתואר על ידי et al Grynkiewicz. 11. נתוני הדוגמא שלנו מועסקים תרכובות תרופתיות שגורמות apשינוי ermanent בסידן cytosolic. אותות סידן פיסיולוגיים הם בעוצמה נמוכה, להציג קינטיקה מהירה וחולפים, וכך נשאלים השאלה, אם cytometry זרימת השיטה היא רגישה מספיק כדי לזהות אותות סידן פיסיולוגיים. ניסויים עם ATP בוצעו עם קו WKPT-0293 Cl.2 התא, אוצרת בחובה קולטנים purinergic כפי שהודגם על ידי אות מוגברת בסידן על יישום של ה- ATP (שנמדדה על ידי הדמיה תא חי). באמצעות cytometer הזרימה, סידן cytosolic מוגבר יכול להיבחן עם 1-100 ATP מיקרומטר, אך טבעה המהיר של האות בשילוב עם העיכוב בחידוש מדידה לאחר תוספת תרכובת המשמעות היא שרק חלק של האות יכול להיות מוקלטת. כך חסרון עיקרי של הזרימה cytometry השיטה היא יכולתה המוגבלת להקליט מהירות (&lt;10 שניות) ואותות סידן חולפים; ולא בשיטה מתאימה יותר לגירויים שיוצרים אותות איטיים חולפים (&gt; 10 שניות) או calc הגבוה מתמידאותות ium. מגבלות אלו עשויות לעקוף על ידי הפחתת ריכוז ממריץ או על ידי יישום מעכבי ספיגה חוזרת של סידן למנגנונים כדי לשמור על סידן שוחרר בcytosol אבל זהירות יש לנקוט כדי לבחור ריכוז מעכב שלא להגדיל סידן כשלעצמה cytosolic. המידע שנרכש על ידי הדמיה תא חי וcytometry זרימה היא שונות לגמרי. עם הדמיה תא חי, ברזולוציה הגבוהה משמעות הדבר היא ששינויים המרחביים בסידן ניתן למדוד על ידי בחירת אזורים תאיים של תאים בודדים להדמיה. יתר על כן, אותות הקרינה נרכשים ללא הפסקה בכל 1 - שניות 2 ולכן ניתן להקליט אותות סידן מהירים. בניגוד לכך, cytometry זרימה מתאים יותר לאותות סידן לאורך זמן איטיים יותר וארוכים ומודד אותות סידן מאוכלוסיית תא כולו. רק שינויים יחסי באותות סידן ניתן לכמת עם cytometry זרימת השיטה. אבל, יש לו את הזרימה cytometry שיטת מספר advanTages על הדמיה תא חי קונבנציונלית: 1) הקרנת תפוקה גבוהה של תרכובות (גירוי ומעכבים של איתות סידן) יכול להתבצע; 2) מומחיות הדמיה ספציפית אינה נדרשת; 3) טכנאי מחקר יכולים לבצע מדידות; 4) מעבדות קליניות ולא-קליניות שאין לי האמצעים לבצע הדמיה ברזולוציה גבוהה ומדידות סידן ratiometric יכולה לחקור איתות סידן. יחדיו, cytometry זרימת השיטה שימושית אם החוקר בתחילה חפץ להקים תפקיד לסידן ויכול בקלות ליישם מעכבים לקבוע מסלולי איתות במורד זרם, ואילו הייתה נדרשת הדמיה תא חי כדי לאפיין את אות סידן (לדוגמא., קינטיקה , עוצמה, שינויים המרחביים) בפירוט נוסף. לסיכום, אנו מתארים שיטה מהירה, פשוטה ורגישה לזיהוי של שינויים יחסי בזמן אמת בסידן cytosolic בקשה לעומס בכליות אפיתל חסידתאים, שהובאו להשעיה. לנסיינים ללא גישה לcytometry זרימה, שיטה זו יכולה להיות מיושמת בקלות לspectrofluorimeter עם ההשעיה תא קובט.

סידן הוא שליח שני חשוב אחראי להעברת פיזיולוגית סלולריים ואותות pathophysiological 1. ריכוז יוני הסידן Cytosolic נשמרים נמוך באמצעות הפעילות של משאבות סידן ומחליפי סידן. ATPase סידן הרשתית / endoplasmic sarcoplasmic (SERCA) ממלא reticulum endoplasmic (ER) חנות סידן כחלק ממערכת &quot;דליפת משאבה&quot;, ואילו ATPase סידן קרום פלזמה (PMCA) extrudes סידן לתא תאי, הן בנימוסים תלוי ATP 2. שליחים פיסיולוגיים, כמו הורמונים או נוירוטרנסמיטרים, לשדר אותותיהם באמצעות קולטנים G- חלבון בשילוב, הפעלה של C פוספוליפאז, שhydrolyses phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) בקרום הפלזמה לייצר אדנוזין diacylglycerol ואינוסיטול (IP3) 3. בעוד diacylglycerol נשאר בקרום הפלזמה, IP3 מתמוסס לתוך cytosol ונקשר לקולטן ה- IP3s (IP3Rs), אשר יגנד מופעלות ערוצי סידן, שנמצאה בקרום ER וסידן משתחררת מחנות luminal ER הגיעה לשיאה בעלייה בריכוז יוני הסידן cytosolic 4. תוואי חלופי לסידן כדי להגיע לcytosol הוא בערוצי סידן ומחליפים קיימים בקרום הפלזמה. Crosstalk בין שני תאים אלו תוארו: שחרור סידן נגרם סידן (CICR) שבו סידן תאי גורם לשחרור סידן מחנויות ER 5, וחנות המופעלים על כניסת סידן (SOCE) שבו מתרוקן מחנויות ER נקלטת על ידי STIM וגורם לפתיחה של Orai ערוצי סידן בקרום הפלזמה לקדם מילוי חוזר של חנויות ER 6. בתנאי pathophysiological, תגובת סידן התאית היא עליות סידן וחוסר פיקוח ממשלתיות וcytosolic בהעדר הגירוי פיסיולוגי 1. תגובת סידן עלולה להיות מושפעת במספר הדרכים: ממושך בסידןאות, התעכב פינוי סידן מcytosol, דלדול של חנויות סידן או שינויים מקומיים בסידן. יתר על כן, המיטוכונדריה לקחת על עצמו תפקיד מרכזי בחציצה ושחרור סידן 7. מתמשך ו / או עליית סידן cytosolic supramaximal מובילה למוות של תאים. למעשה, סידן הוא לעתים קרובות יותר מאשר לא מעורב בתגובת pathophysiological הסלולרית והוא אירוע מרכזי במגוון רחב של מחלות, כגון מחלת ניוון עצבי, מחלות לב, סרטן, מחלות עצם ומחלת כליות, אשר קשור בעיקר עם מוות של תאים ואובדן או שינוי של איבר או רקמת הפונקציה 8-10. יתר על כן, ההפרעות של אותות סידן נקשרה להסתגלות ושינויים בפונקציות ותגובות תאיות סלולריים. באופן מסורתי, אותות סידן נמדדים עם מחוון סידן ניאון טעון שלילי שהוא נטען לתוך תאים בצורת acetoxymethyl החדיר תא (AM) אסתר. ביקע פעם אחת על ידי esteras הסלולריes, אינדיקטורים הניאון להישאר בתוך התא תאיים ועלייה בעוצמת הקרינה כאשר סידן הוא מחויב. מחוון סידן הידוע ביותר ומשמש הוא הפורע-2 ratiometric שפותח על ידי רוג&#39;ר Tsien ועמיתים 11. מדדי סידן עם זיקות שונות מן לסידן לאפשר בריכות סידן שונות כדי להיות במעקב. שיטות זיהוי כוללות הדמיה תא חי, קורא microplate הקרינה וcytometry זרימה. קינטיקה מהירה יחסית של אותות סידן (בדרך כלל תוך מספר שניות עד דקות), הופכת את התא חי הדמיה השיטה הטובה ביותר להשגת רוב המידע על מאפיינים של אות סידן. מלבד קינטיקה מהירה של אותות סידן (באלפיות שני), הדמיה תא חי היא שיטה טובה יותר ללימודי מידור סלולארי של איתות סידן בתוך תא בודד 12. ניתן לחשב ריכוז יוני הסידן המוחלט על ידי קביעת הקרינה המינימלית ומקסימלי של ind סידןicator על ידי הוספת chelator סידן וpermeabilizing התאים, בהתאמה, כפי שתואר על ידי et al Grynkiewicz. 11. השימוש בזרימת cytometry למדוד אותות סידן פותחה לראשונה בשנת 1980 בתאים חיסוניים שבו את ההזדמנות כדי למדוד פרמטרים מרובים, כגון שלמות קרום והפרדה של אוכלוסיית תאים, ואת הדרישה של תאים בתרחיף בשילוב עם הפיתוח של אורך גל יחיד מדדי סידן עשויות cytometry זרימת שיטה אידיאלית וconvenientdetection 13-15. בתאים חסיד, הדמיה תא חי מספקת את רוב המידע על איתות סידן, הכי חשוב קינטיקה, אבל דורשת התקנה מסובכת הכוללת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, מערכת זלוף, תחזוקה של הסביבה התאית, כגון טמפרטורה, ותוכנת מיקרוסקופ מיוחדת לרכישה וניתוח נתונים. שיטות חלופיות כגון קורא microplate הקרינה או Pharmacolאמצעי ogical באמצעות שימוש בchelators סידן הוא שאין במונחים של מידע שנצבר. Cytometry זרימה הופכת שימוש נרחב יותר כדי לפקח על סידן cytosolic בתאים חסיד אם כי, ברוב המכריע של מחקרים, נקודת סיום מדידות מתבצעות רק. תוך שימוש בשיטה פותחה בתחילה על ידי אל גרגלי ואח. בתאי B של מערכת חיסון 16, שינויים בריכוז סידן חופשי cytosolic ידי cytometry זרימה עם קינטיקה בזמן אמת וניטור עוצמת הקרינה בתאים בודדים מאוכלוסיית מדגם נמדדו בהצלחה בתאי האפיתל סרטן ותא גזע סרטני כלאי 17. שיטה זו הותאמה נוספת לשימוש בתאי אפיתל חסיד, שקשה לטעון עם אינדיקטורים סידן 18. כאן, באמצעות שורת תאי אפיתל הונצחה חסיד נגזרת ממגזר S1 של אבובית הפרוקסימלי כליות חולדה (WKPT-0293 Cl.2) 19, אנו מתארים מותאם מ &#39;פשוטיםethod למדידת שינויים בריכוז סידן cytosolic ידי cytometry זרימה. מאחר ורבים מתאים אפיתל בעלי מספר המובילים האורגניים לתרכובות אניוני, טעינה של תאים עם מחוון סידן יכולה להוכיח להיות אתגר. כדי למנוע הזרימה של אינדיקטורים סידן, probenecid, המעכב הטיפוסי של מובילי אניון אורגניים ופותח במקור כדי להקטין את הפרשת כליות של פניצילין 20, מיושם בו זמנית במדיום הדגירה. התאים נשמרים בmonolayers לטעינת מחוון סידן, הביאו לאותות השעיה וסידן יכולים להתגלות מייד לאחר בנוסף מתחם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="735">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:79px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:321px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-3, AM</td>
			<td style="width:79px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">F-1241&#160;</td>
			<td>Cell permeable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Probenecid</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-8761</td>
			<td>Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:79px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ionomycin</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I9657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thapsigargin</td>
			<td style="width:79px;">Tocris Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tunicamycin</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software</td>
			<td style="width:79px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)</td>
			<td style="width:79px;">Joe Trotter, The Scripps Institute</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line</td>
			<td style="width:79px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology &#38; Biophysics, Case 
			Western Reserve University, Cleveland, OH)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cytosolic calcium measurements in renal epithelial cells by flow cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

כדי להגדיל סידן cytosolic, שתי תרכובות תרופתיות יושמו תאי כליות הפרוקסימלי אבובית (WKPT-0293 Cl.2) עמוסים צבע סיד חדיר תא מחייב, Fluo-3-AM. דגימות בקרת Nontreated הועמסו עם צבע מחייב סידן בנוכחות probenecid והיו מעורבות אך ללא תוספת של כל תרכובות. Thapsigargin (TG) הוא מעכב קלאסי של משאבת SERCA המובילה לזליגה החוצה של חדר המיון, וכתוצאה מכך סידן cytosolic מוגבר. בלוקים Tunicamycin (TUN) N-glycosylation של חלבונים מובילים להפעלה של תגובת החלבון המקופלת אלא גם מגביר סידן cytosolic 18,21. כביקורת חיובית, ionomycin (IONO), ionophore סידן מה שהופך את הממברנה חדירה לסידן תאי, היה בשימוש. לניתוח, אוכלוסיית התאים הייתה מגודרת על ידי בחירת אזור בעלילת נקודת SSC / FSC (R1 באיור 1). עלילת צפיפות לעוצמת הקרינה לעומת הזמן נוצרה עבור כל קובץ נתונים. על ידי שימוש בפונקציה רבע, עלילת הנקודה הופרדה לארבעה אזורים המייצגים Fluo-3 עוצמת הקרינה לפני ואחרי בנוסף מתחם ומעל ומתחת לקרינה בנקודת ההתחלה. כימות כאחוז מאוכלוסיית תא מגודרת בכל רבע מאפשרת קביעת ריכוז סידן cytosolic המוגבר. בדוגמא זו, 3 מיקרומטר TG גורם לעלייה באחוז התאים ברבע הימני העליון מצביע על כך שאות סידן הוצמחה. אחוז התאים מגביר מ42.8% בשליטה ל51.3% (1.20 לקפל) בתאי TG טופל. באופן דומה, 6 TUN מיקרומטר מרחיב את אחוז התאים עם עוצמת הקרינה סידן מוגברת ל49.9% (1.17 לקפל). יישום של 10 מיקרומטר IONO הביא 65.5% (1.53 לקפל) של תאים ברבע הימני העליון (איור 2). ניתוח ההיסטוגרמה הביא 1.41 פי, 1.36 לקפל ו2.11 לקפל על ידי TG, TUN וIONO, בהתאמה (איור 3) (לסטטיסטיקה, ראה &lt;sup&gt; 18). לבסוף, שימוש במצב ניתוח האזור מרובה, TG, TUN וIONO גרמו 1.55 פי, 1.29 לקפל ו4.54 עליות של פי אות סידן על שליטה, בהתאמה (איור 4). מצב הניתוח רגיש ביותר היה הניתוח באזור מרובה. בניגוד לרבע ומצבי ניתוח ההיסטוגרמה, שבו חלוקת אוכלוסיית התאים היא לכמת, מצב ניתוח האזור מרובה מכמת את השינוי באות ניאון מכלל אוכלוסיית התאים. הפער הגדול ביותר בתוצאות ממצבי ניתוח שונים היה לionomycin שנע בין עלייה של פי 1.53 על שליטה מהניתוח ברבע ל4.54 פי מניתוח האזור מרובה. התרכובות שנבדקו ואינן מראות הבדלים הללו. עם זאת, בכל מצבי הניתוח, המידה של אות סידן עוררה נשארה אותו הדבר אם כי הערכים מוחלטים שונות, כלומר, היה לו ההשפעה הגדולה ביותר IONO אחרי TG ולאחר מכן TUN. </p&gt; יישום של TG, TUN או IONO תוצאות בשינויים קבועים בסידן cytosolic. כדי לקבוע אם אותות פיסיולוגיים סידן, שהן חולפות, ניתן למדוד באמצעות שיטה זו, ATP היה מוחל על תאי Cl.2 WKPT-0293. ATP עורר אות סידן מהירה וחולפת, שלא ניתן היה נרשמה בשלמותו על ידי הזרימה cytometry שיטה. ריכוזי ATP ב20-100 מיקרומטר היו קשה לזהות ולכן הריכוז הופחת ל &quot;להאט&quot; אותות סידן. כפי שניתן לראות בתרשים 5, שינוי בסידן cytosolic ניתן היה למדוד לאחר תוספת של 5 ATP מיקרומטר. ובכל זאת, השיא של שינוי הקרינה לא נרשם. שימוש בניתוח ברבע (איור 5) וניתוח ההיסטוגרמה מצבים (איור 5 ג), אין הבדל באותות סידן בATP ניתן היה לזהות בשל האופי הארעי של אות סידן. עם זאת, עם חלקים נבחרים של העקבות, rectangula מרובהמצב ניתוח אזור r נרשם גידול של פי 1.85 באות סידן מייד לאחר חזר מדידה (איור 5 א). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51857/51857fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. SSC לעומת עלילת נקודת FSC. היושרה של אוכלוסיית התאים נבחנת באמצעות פיזור בצד (SSC) ופיזור קדימה (FSC). אזור נבחר (R1) לניתוח נוסף. תאים מתים ופסולת תא, שצמצמו פיזור אור, אינם נכללים. עלילת נקודת נציג מוצגת. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51857/51857fig2highres.jpg" width="500" /> ניתוח Quadrant איור 2.. הקרינה Baseline של סידן מחייב WKPT-0293 תאי Cl.2 טעון צבע נמדדה במשך 50 שניות. מדידה הופסקה, מתחם או דיluent נוספה, vortexed לערבב ומדידה התחדשה מייד לסך כולל של 204.8 שניות. כימות בוצע באמצעות ניתוח ברבע. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51857/51857fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51857/51857fig3highres.jpg" width="500" /> ניתוח היסטוגרמה איור 3.. עלילת היסטוגרמה של סידן מחייב WKPT-0293 תאי Cl.2 טעון צבע שטופלו בTG, TUN או IONO. שימוש בפונקציית הסמן, אחוז התאים מגודר עם עוצמת הקרינה צבע גבוה של סידן מחייבת היה לכמת ידי מיקום הנקודה של סמן ההתחלה בשיא של עקומת השליטה ומסתיים בקרינה המרבית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51857/51857fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בlarg</a>גרסה אה של נתון זה. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51857/51857fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4. ניתוח אזור מרובה. הקרינה Baseline של סידן מחייב WKPT-0293 תאי Cl.2 טעון צבע נמדדה במשך 50 שניות. מדידה הופסקה, מתחם או מדללים נוספו, vortexed לערבב ומדידה התחדשה מייד לסך כולל של 204.8 שניות. כימות בוצע באמצעות ניתוח אזור מלבני מרובה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51857/51857fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51857/51857fig5highres.jpg" width="500" /> איור ניתוח 5. של אותות סידן מושרה ATP. o הקרינה Baselineסידן ו מחייב WKPT-0293 תאי Cl.2 טעון צבע נמדד במשך 50 שניות. מדידה הופסקה, 5 ATP מיקרומטר נוספה, vortexed לערבב ומדידה התחדשה מייד לסך כולל של 204.8 שניות. הנתונים היה לכמת באמצעות ניתוח מרובה מלבני אזור (), ניתוח ברבע (ב) או ניתוח היסטוגרמה (C). לניתוח האזור מרובה, רק אות סידן החולפת נותחה. נתונים או ניתוח מn נציג = 3 -. 7 מוצגים <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51857/51857fig5highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

סידן הוא מעורב במסלולי איתות פיסיולוגיים וpathophysiological רבות. הדמיה תא חי דורשת ציוד מיוחד ויכולה להיות זמן רב. שיטה מהירה, פשוטה באמצעות cytometer זרימה לקבוע שינויים יחסי בסידן cytosolic בתאי האפיתל חסיד הביאו להשעיה הייתה מותאמת.

מדידות סידן cytosolic בתאי האפיתל כליות על ידי cytometry הזרימה

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

cytosolic-calcium-measurements-renal-epithelial-cells-flow

Google

Research

JoVE Journal

Biology

15.2K Views.  University of Witten/Herdecke.  סידן הוא מעורב במסלולי איתות פיסיולוגיים וpathophysiological רבות. הדמיה תא חי דורשת ציוד מיוחד ויכולה להיות זמן רב. שיטה מהירה, פשוטה באמצעות cytometer זרימה לקבוע שינויים יחסי בסידן cytosolic בתאי האפיתל חסיד הביאו להשעיה הייתה מותאמת. 

Video: Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP-FCM: immunoprecipitation זוהה על ידי זרימת cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

אופטימיזציה שיטות דוגמנות מכתימה והפצת נשק לניטור חלוקת תא באמצעות צבעי מעקב סלולרי

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the heart, and improving strategies to accurately model heart disease. The potential of exploiting human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology to generate cardiac muscle &#8220;in a dish&#8221; for these applications continues to generate high enthusiasm. In recent years, the ability to efficiently generate cardiomyogenic cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) has greatly improved, offering us new opportunities to model very early stages of human cardiac development not otherwise accessible. In contrast to many previous methods, the cardiomyocyte differentiation protocol described here does not require cell aggregation or the addition of Activin A or BMP4 and robustly generates cultures of cells that are highly positive for cardiac troponin I and T (TNNI3, TNNT2), iroquois-class homeodomain protein IRX-4 (IRX4), myosin regulatory light chain 2, ventricular/cardiac muscle isoform (MLC2v) and myosin regulatory light chain 2, atrial isoform (MLC2a) by day 10 across all human embryonic stem cell (hESC) and hiPSC lines tested to date. Cells can be passaged and maintained for more than 90 days in culture. The strategy is technically simple to implement and cost-effective. Characterization of cardiomyocytes derived from pluripotent cells often includes the analysis of reference markers, both at the mRNA and protein level. For protein analysis, flow cytometry is a powerful analytical tool for assessing quality of cells in culture and determining subpopulation homogeneity. However, technical variation in sample preparation can significantly affect quality of flow cytometry data. Thus, standardization of staining protocols should facilitate comparisons among various differentiation strategies. Accordingly, optimized staining protocols for the analysis of IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, and TNNT2 by flow cytometry are described.

The article describes the detailed methodology to efficiently differentiate human pluripotent stem cells into cardiomyocytes by selectively modulating the Wnt pathway, followed by flow cytometry analysis of reference markers to assess homogeneity and identity of the population.

בידול יעילות גבוה של תאי גזע pluripotent האדם לשריר לב ואפיון על ידי cytometry הזרימה

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

ניתוח של המתלים תא מבודד מרקמות Solid ידי זרימת cytometry ספקטרלי

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

מדידת Endoreduplication על ידי Cytometry זרימה של פקעת מבודד Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion and the spread of neurodegenerative diseases. The commonly used laboratory strains of the amoeba Dictyostelium discoideum have extremely high fluid uptake rates when grown in nutrient medium, over 90% of which is due to macropinocytosis. In addition, many of the known core components of mammalian macropinocytosis are also present, making it an excellent model system for studying macropinocytosis. Here, the standard technique to measure internalized fluid using fluorescent dextran as a label is adapted to a 96-well plate format, with the samples analyzed by flow cytometry using a high-throughput sampling (HTS) attachment.
Cells are fed non-quenchable fluorescent dextran for a pre-determined length of time, washed by immersion in ice-cold buffer and detached using 5 mM sodium azide, which also stops exocytosis. Cells in each well are then analyzed by flow cytometry. The method can also be adapted to measure membrane uptake and phagocytosis of fluorescent beads or bacteria.
This method was designed to allow measurement of fluid uptake by Dictyostelium in a high-throughput, labor and resource efficient manner. It allows simultaneous comparison of multiple strains (e.g. knockout mutants of a gene) and conditions (e.g. cells in different media or treated with different concentrations of inhibitor) in parallel and simplifies time-courses.

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Macropinocytosis, large-scale non-specific fluid uptake, is important in many areas of clinical biology including immunology, infection, cancer, and neurodegenerative diseases. Here, existing techniques have been adapted to allow high-throughput, single-cell resolution measurement of macropinocytosis in the macropinocytosis model organism Dictyostelium discoideum using flow cytometry.

מדידת תפוקה גבוהה Dictyostelium discoideum Macropinocytosis על ידי Cytometry זרימה

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.

גילוי ואפיון הרכבה עצמית של חלבון בVivo על-ידי הזרמת הקיטומטל

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

מדידת מיסת מיטוכונדריאלי ופוטנציאל ממברנה בתאי גזע ותאי T-תאים על ידי זרימה Cy,

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...