מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82090013).

הפרוטוקול הכולל דורש 44 ימים, כולל יום אחד להכנת תאי אפיתל בדרכי הנשימה שבודדו מקנה הנשימה של מורין, 15 יום להתרבות תאים, ו-28 ימים לגירוי CSE בממשק אוויר-נוזל. כל חיות הניסוי שוכנות בחדר בעלי החיים SPF Barrier של מרכז הניסויים בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית קפיטל ונבדקו ואושרו על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים וחיות מעבדה של האוניברסיטה הרפואית קפיטל (AEEI-2020-100) כדי לעמוד בדרישות הנחיות ARRIVE7.
1. בידוד תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה של מורין מקנה הנשימה של מורין
<ol><li>הכנה<ol><li>הכן מדיום הרחבה מלא על ידי שילוב של 1 מ"ל של תוסף 50x ו- 0.05 מ"ל של מלאי הידרוקורטיזון עם מדיום בסיס הרחבה של 48.95 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C ולהשתמש תוך 4 שבועות.</li>
		<li>להמיס 7.5 מ"ג של פרוטאינאז ו 5 מ"ג של deoxyribonuclease I ב 5 מ"ל של F-12 של Ham כדי להכין פתרון proteinase. יש לסנן אותו כדי לעקר ולאחסן בטמפרטורה של 4°C ולהשתמש תוך 4 שבועות.</li>
		<li>הכינו תמיסות אנטיביוטיות על ידי הוספת 0.05 מ"ל של 100x פניצילין/סטרפטומיצין ו-0.01 מ"ל של 500x גנטמיצין/אמפוטריצין ל-5 מ"ל של תמיסת התפשטות מלאה, PBS ופרוטאינאז (100 U/mL פניצילין, 100 U/mL סטרפטומיצין, 10 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין ו-0.25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B). יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C ולהשתמש תוך 4 שבועות.</li>
		<li>לעקר מכשירי ניתוח ולהכין את ארון הבטיחות הביולוגי לבידוד תאים. במקביל, ודא שהציוד הסטנדרטי לתרביות תאים מוכן לשימוש.</li>
		<li>הכינו כלים מצופים קולגן בזנב חולדה על ידי הוספת קולגן זנב חולדה (100 מיקרוגרם/מ"ל ב-0.02 N חומצה אצטית) לצלחות תרבית בקוטר 100 מ"מ ולטרנסוולים בקוטר 24 מ"מ (0.05 מ"ל/ס"מ2). יש להשאיר פתוח למשך הלילה תחת אור UV לצורך עיקור.</li>
	</ol></li>
	<li>בידוד תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה<ol><li>יש להשתמש בעכברי C57BL/6 (בני 6-8 שבועות, זכרים, בעלי SPF) לבידוד תאי אפיתל קנה הנשימה. המתת חסד עם מנת יתר של תמיסת נתרן פנטוברביטלית 1% (כ-200 מ"ג/ק"ג). השתמש בחמישה עכברים לתפוקת תאים מספקת.</li>
		<li>לעקר את העכבר על ידי טבילה בתמיסת אתנול 75%, לא לטבול את האף והפה באלכוהול כדי למנוע אלכוהול לזרום לתוך קנה הנשימה.</li>
		<li>נתח את העכבר.<ol><li>השתמש להבים כירורגיים ומלקחיים, קבוצה אחת של מכשירים לחיתוך ופתיחת האפידרמיס מהלסת התחתונה לחלל הבטן של העכבר.</li>
			<li>השתמש קבוצה נוספת של כלי ניתוח כדי לקרוע את בלוטות התריס משני הצדדים ולהסיר את הקשרים בין קנה הנשימה, רקמת השריר שמסביב, ואת הוושט.</li>
			<li>לאחר מכן, בזהירות לחתוך לתוך החזה, להשתמש מלקחיים להתעמק לתוך חלל החזה, להוציא את הריאה כולה, ולמצוא את קצה קנה הנשימה.</li>
		</ol></li>
		<li>לעבד את קנה הנשימה.<ol><li>חותכים את קנה הנשימה מסחוס בלוטת התריס לענף קנה הנשימה-סימפונות ומכניסים אותו למדיום הרחבה טרום קר המכיל ארבע אנטיביוטיקה.</li>
			<li>נער את הצינור כדי לשטוף כמה שיותר דם מפני השטח של קנה הנשימה, לשמור אותו על קרח, ולאחר מכן להתחיל את הניתוח עבור העכבר הבא.</li>
		</ol></li>
		<li>העבירו את כל קנה הנשימה שנאספו למאגר PBS טרום קר המכיל ארבע תרופות אנטיביוטיות (200 U/mL פניצילין, 200 U/mL סטרפטומיצין, 20 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין ו-0.5 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B) לטיפול מקדים לפני העיכול.</li>
		<li>השתמש קבוצה של כלי ניתוח כדי להסיר קרישי דם ורקמות אחרות מן פני השטח של קנה הנשימה, ולאחר מכן לחתוך אותם לתוך 1 ס"מ2 גודל.</li>
		<li>לדגור על רקמת קנה הנשימה בתמיסת פרוטאינאז בטמפרטורה של 37°C למשך 40 דקות.</li>
		<li>לאחר 40 דקות, נענעו את הצינור מספר פעמים והשתמשו במסננת תאים של 40 מיקרומטר כדי להסיר את הרקמות הנותרות. שוטפים את קנה הנשימה הקצוץ על מסננת עם 5 מ"ל של תווך הרחבה, צנטריפוגות את תרחיף התא ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, ומשליכים את supernatant.</li>
		<li>להשעות מחדש את התאים המתקבלים ב 8 מ"ל של מדיום הרחבה.</li>
		<li>ספור את התאים קיימא באמצעות כחול טריפאן המוציטומטר.</li>
		<li>תרחיף תאי צלחת P0 על צלחות 100 מ"מ (1 x 104 תאים חיים / ס"מ2) מצופה מראש בקולגן זנב חולדה, ותרבית את התאים באינקובטור ב 37 ° C, 5% CO2.</li>
	</ol></li>
</ol>2. תרבית הרחבה ומעבר של תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה
<ol><li>החלף את המדיום עבור תרבית תאי P0 כל 3 ימים עד שהתאים מגיעים למפגש של 70%-80%, בדרך כלל תוך 6 ימים. בנקודה זו, תאי אפיתל קנה הנשימה יכולים ליצור שכבה חד-שכבתית שלמה עם מראה מרוצף אבן (איור 1A-D).</li>
	<li>חימום מראש של נפחים מספיקים של PBS, מדיום הרחבה מלא וערכת דיסוציאציה של תאים ללא רכיבים מן החי (ACF) ל-37°C.</li>
	<li>לשטוף בעדינות את התאים עם 3 מ"ל של PBS.</li>
	<li>בצע דיסוציאציה אנזימטית.<ol><li>הוסיפו 3 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה אנזימטית ACF לצלחת ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות. לאחר הפיפט, יש לעקור את התאים בעדינות ולהעביר את תרחיף התא ל-3 מ"ל של תמיסת עיכוב אנזים ACF.</li>
		<li>חזור על תוספת של 3 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה אנזימטית ACF ודגור שוב במשך 5 דקות כדי להבטיח ניתוק תאים מרבי.</li>
	</ol></li>
	<li>סובב את מתלה התא ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנטנט.</li>
	<li>להשעות את התאים ב 1 מ"ל של מדיום הרחבה.</li>
	<li>ספור את התאים קיימא באמצעות כחול טריפאן המוציטומטר.</li>
	<li>לוח P1 תרחיף תאים על מספר צלחות 100 מ"מ (5 x 104 תאים חיים / ס"מ2) מצופה מראש בקולגן זנב חולדה, ותרבית את התאים באינקובטור ב 37 ° C, 5% CO2.</li>
</ol>3. התמיינות וגירוי CSE של תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה בממשק אוויר-נוזל
<ol><li>אשר את סוג התא.<ol><li>אמת את מקור האפיתל של תאים מבודדים באמצעות בדיקת immunofluorescence (IFA) עם נוגדנים נגד cytokeratins. תאי זרעים על שקופיות זכוכית המצופים בקולגן זנב חולדה ומשתמשים בפרפורמלדהיד כדי לקבע אותם לפחות 12 שעות לאחר שהתאים מגיעים למפגש של 80%.</li>
		<li>שטפו שקופיות 3 פעמים עם תמיסת PBS למשך 5 דקות ודגרו עליהן עם 3% BSA ו-0.1% טריטון X-100 בתמיסת PBS בטמפרטורת החדר (RT) למשך שעה אחת.</li>
		<li>יש לדגור על מגלשות לילה בטמפרטורה של 4°C עם נוגדן מסחרי נגד פאן ציטוקרטין בדילול של 1:500.</li>
		<li>למחרת, שטפו מחליקים 3 פעמים עם תמיסת PBS למשך 5 דקות ודגרו עליהם עם חיץ נוגדנים משני בדילול של 1:1000 ב- RT למשך שעתיים בחושך.</li>
		<li>לאחר הדגירה, יש לשטוף את המגלשות 3 פעמים עם PBS (5 דקות לכל כביסה), ולהוסיף להן DAPI בדילול של 1:1000. לאחר הדגירה ב-RT במשך 15 דקות, שטפו את המגלשות פעם אחת עם PBS למשך 5 דקות.</li>
		<li>צפו בשקופיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי והשוו דפוסי ביטוי לבקרה חיובית (קו תאים A549) ולבקרה שלילית (קו תאים Raw264.7) (איור 2).</li>
	</ol></li>
	<li>זרעו את התאים להתמיינות.<ol><li>נתק וצנטריפוגה תאי P2 כפי שתואר קודם לכן, והשהה מחדש את כדורית התא בנפח מתאים של אמצעי התפשטות כדי להקל על ציפוי של 1 x 104 תאים חיים / ס"מ2.</li>
		<li>פיפטה 1 מ"ל של תרחיף התא על התא האפי של קרום פוליקרבונט transwell להחדיר. לתא הבסיסי של הטרנסוול, הוסף 1.5 מ"ל של אמצעי התפשטות.</li>
	</ol></li>
	<li>יש לדגור על התאים בטמפרטורה של 37°C ולשנות באופן מלא את כל התווך בתאי הבסיס והאפיק כל 3 ימים באמצעות מדיום התפשטות עד למפגש ביניהם. פעולה זו נמשכת בדרך כלל 3-6 ימים.</li>
	<li>הכינו 50 מ"ל של מדיום בידול מלא על ידי הוספת 5 מ"ל של תוסף ALI 10x, 500 מיקרוליטר של תוסף תחזוקה ALI, 100 מיקרוליטר של תמיסת הפרין ו-250 מיקרוליטר של תמיסת מלאי הידרוקורטיזון ל-44.15 מ"ל של מדיום בסיסי ALI.</li>
	<li>הכינו CSE.<ol><li>מבעבעים סיגריה אחת דרך 12.5 מ"ל של מדיום בידול ולאחר מכן מסננים אותה דרך מסנן נקבוביות 0.22 מיקרומטר כדי להכין CSE. כדי להבטיח סטנדרטיזציה בין ניסויים ואצוות של CSE, למדוד את הספיגה ב 320 ננומטר על ספקטרופוטומטר ולהגדיר צפיפות אופטית (OD) של 1 כמו 100%8.</li>
	</ol></li>
	<li>השתמש במדיום התמיינות המכיל ריכוז מתאים של CSE כדי לעורר תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה כדי לזהות השפעות על התמיינות התאים.</li>
	<li>לאפשר לתאים להתמיין במשך 28 ימים, שבמהלכם משתנה המדיה התאית הבסיסית, והצד האפי נשטף פעמיים בשבוע על ידי הסרת המדיה התאית האפיקלית והחלפת המדיה התאית הבסיסית במדיום ההתמיינות המכיל את הריכוז המתאים של CSE.</li>
	<li>נתח את התאים לאחר החשיפה.<ol><li>לאחר חשיפה למדיום התמיינות המכיל CSE, יש לקצור את התאים ואת הסופרנאטנטים של התרבית בכל נקודת זמן (כלומר, 0-28 ימים) לגילוי שינויים מורפולוגיים (כלומר, בדיקת אימונופלואורסנציה (IFA) או צביעת המטוקסילין-אאוסין (HE) או עבור הליכים אנליטיים ביואינפורמטיים (כלומר, תעתוק, פרוטאומיקה, מטבולומיקה וכו ').</li>
	</ol></li>
</ol>

מודל במבחנה של תאי אפיתל בדרכי הנשימה של מורין וחשיפה כרונית לעשן

<ol>
	<li>Ritchie, A. I., Martinez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenges+of+defining+early+chronic+obstructive+pulmonary+disease+in+the+general+population.">The challenges of defining early chronic obstructive pulmonary disease in the general population.</a> Am J Respir Crit Care Med. 203 (10), 1209-1210 (2021).</li><li>Caramori, G., Kirkham, P., Barczyk, A., Di Stefano, A., Adcock, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+cigarette+smoking-induced+stable+COPD.">Molecular pathogenesis of cigarette smoking-induced stable COPD.</a> Ann N Y Acad Sci. 1340, 55-64 (2015).</li><li>Leino, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+disrupting+effects+of+alternaria+alternata+extract+on+bronchial+epithelium+from+asthmatic+donors.">Barrier disrupting effects of alternaria alternata extract on bronchial epithelium from asthmatic donors.</a> PLoS One. 8 (8), e71278 (2013).</li><li>Benediktsd&#243;ttir, B. E., Arason, A. J., Halld&#243;rsson, S., Gudj&#243;nsson, T., M&#225;sson, M., Baldursson, &. #. 2. 1. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+delivery+characteristics+of+the+progenitor+bronchial+epithelial+cell+line+VA10.">Drug delivery characteristics of the progenitor bronchial epithelial cell line VA10.</a> Pharm Res. 30 (3), 781-791 (2013).</li><li>Walters, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+human+airway+epithelium+derived+basal+cell+line+with+multipotent+differentiation+capacity.">Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity.</a> Respir Res. 14 (1), 135 (2013).</li><li>Prytherch, Z., Job, C., Marshall, H., Oreffo, V., Foster, M., B&#233;ruB&#233;, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+stem+cell+differentiation+in+an+in+vitro+airway+model.">Tissue-specific stem cell differentiation in an in vitro airway model.</a> Macromol Biosc. 11 (11), 1467-1477 (2011).</li><li>Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+research:+Reporting+in+vivo+experiments:+The+ARRIVE+guidelines.">Animal research: Reporting in vivo experiments: The ARRIVE guidelines.</a> Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).</li><li>Brekman, A., Walters, M. S., Tilley, A. E., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXJ1+prevents+cilia+growth+inhibition+by+cigarette+smoke+in+human+airway+epithelium+in+vitro.">FOXJ1 prevents cilia growth inhibition by cigarette smoke in human airway epithelium in vitro.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (5), 688-700 (2014).</li><li>Bajic, M., Maher, K. A., Deal, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+open+chromatin+regions+in+plant+genomes+using+ATAC-seq.">Identification of open chromatin regions in plant genomes using ATAC-seq.</a> Methods Mol Biol. 1675, 183-201 (2018).</li><li>Shaykhiev, R., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+events+in+the+pathogenesis+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease.+Smoking-induced+reprogramming+of+airway+epithelial+basal+progenitor+cells.">Early events in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Smoking-induced reprogramming of airway epithelial basal progenitor cells.</a> Ann Am Thorac Soc. 11 Suppl 5 (Suppl 5), S252-S258 (2014).</li><li>Raby, K. L., Michaeloudes, C., Tonkin, J., Chung, K. F., Bhavsar, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+airway+epithelial+injury+and+abnormal+repair+in+asthma+and+COPD.">Mechanisms of airway epithelial injury and abnormal repair in asthma and COPD.</a> Front Immunol. 14, 1201658 (2023).</li><li>Zhou, J. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke-initiated+autoimmunity+facilitates+sensitisation+to+elastin-induced+COPD-like+pathologies+in+mice.">Cigarette smoke-initiated autoimmunity facilitates sensitisation to elastin-induced COPD-like pathologies in mice.</a> Eur Respir J. 56 (3), 2000404 (2020).</li><li>Lam, H. C., Choi, A. M. K., Ryter, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+respiratory+epithelial+cells+and+exposure+to+experimental+cigarette+smoke+at+air-liquid+interface.">Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air-liquid interface.</a> J Vis Exp. 48, 2513 (2011).</li><li>You, Y., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells.">Culture and differentiation of mouse tracheal epithelial cells.</a> Methods Mol Biol. 945, 123-143 (2012).</li><li>Wandalsen, G. F., Lanza, F. d. e. C., Nogueira, M. C. P., Sol&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+chloral+hydrate+sedation+in+infants+for+pulmonary+function+tests.">Efficacy and safety of chloral hydrate sedation in infants for pulmonary function tests.</a> Rev Paul Pediatr. 34 (4), 408-411 (2016).</li><li>Jiang, D., Schaefer, N., Chu, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air-liquid+interface+culture+of+human+and+mouse+airway+epithelial+cells.">Air-liquid interface culture of human and mouse airway epithelial cells.</a> Methods Mol Biol. 1809, 91-109 (2018).</li><li>Takagi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+prevent+contamination+with+Candida+albicans+during+the+fabrication+of+transplantable+oral+mucosal+epithelial+cell+sheets.">How to prevent contamination with Candida albicans during the fabrication of transplantable oral mucosal epithelial cell sheets.</a> Regen Ther. 1, 1-4 (2015).</li><li>Culp, D. J., Latchney, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucinlike+glycoproteins+from+cat+tracheal+gland+cells+in+primary+culture.">Mucinlike glycoproteins from cat tracheal gland cells in primary culture.</a> Am J Physiol. 265 (3 Pt 1), L260-L269 (1993).</li><li>Cao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+review:+human+air-liquid-interface+organotypic+airway+tissue+models+derived+from+primary+tracheobronchial+epithelial+cells-overview+and+perspectives.">Invited review: human air-liquid-interface organotypic airway tissue models derived from primary tracheobronchial epithelial cells-overview and perspectives.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 57 (2), 104-132 (2021).</li><li>Beb&#246;k, Z., Tousson, A., Schwiebert, L. M., Venglarik, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+oxygenation+promotes+CFTR+maturation+and+trafficking+in+MDCK+monolayers.">Improved oxygenation promotes CFTR maturation and trafficking in MDCK monolayers.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C135-C145 (2001).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

COPD היא מחלה דלקתית כרונית נפוצה בדרכי הנשימה. חשיפה לעשן טבק מובילה לדלקת כרונית בדרכי הנשימה, לעיצוב מחדש של דרכי הנשימה ולהרס מבני של הריאות, שהוא תוצאה של אינטראקציה בין תאים מבניים שונים לבין תאי מערכת החיסון10. כקו הקדמי של מערכת החיסון המולדת בריאה, תאי אפיתל בדרכי הנשימה...

מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) היא מחלת ריאות הטרוגנית עם מאפיינים מורכבים, בעוד חולים עם COPD נוטים בהדרגה להיות צעיריםיותר 1. לעישון, גורם סיכון עיקרי ל- COPD2, יש השפעה עמוקה על תאי אפיתל בדרכי הנשימה, המשמשים כמחסום הראשוני מפני עשן טבק. למרות הקשר הידוע הזה, המנגנונים המפורטים שבאמצעותם עשן טבק גורם לשינויים בתאי אפיתל בדרכי הנשימה עדיין לא נחקרו כראוי. הבנה מעמיקה של שינויים מולקולריים אלה חיונית לזיהוי סמנים אבחוניים מוקדמים ומטרות טיפוליות ל- COPD.
כדי להתמודד עם הפער הזה, פיתחנו מודל חדשני במבחנה באמצעות תאי אפיתל של דרכי הנשימה. תאים אלה היו נתונים לגירוי ארוך טווח באמצעות תמצית עשן סיגריות (CSE), מה שאיפשר לנו לעקוב אחר שינויים תאיים דינמיים ולחקור את השינויים בתאי אפיתל בדרכי הנשימה תחת גירוי טבק ארוך טווח והמנגנון הבסיסי. במודל זה, Transwell שימש כדי לספק את ממשק אוויר-נוזל של תאי אפיתל דרכי הנשימה, ותמצית עשן סיגריות היה מגורה בשלב המוקדם של התמיינות תאי אפיתל עד סוף התמיינות לאחר 28 ימים. מחקרים קודמים בדקו רק התמיינות וגירוי לטווח קצר של תאי אפיתל בדרכי הנשימה (דומיננטיות קו התא). הם הוגבלו למסלול רגולטורי יחיד 3,4,5,6. עם זאת, הפרוטוקול המוצג כאן משתמש בתאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה של עכברים ומייעל את תהליך מיצוי התאים לפעילות תאים טובה יותר מאשר שיטות קודמות של תרבית תאי אפיתל בדרכי הנשימה. מודל זה מתמקד בשינויים בהתמיינות התא לצד אנליזות שעתוק מקיפות, פרוטאומיות, מטבוליות ואפיגנומיות. תוך שימוש באימונופלואורסנציה ובטכניקות מולטי-אומיקה מתקדמות, מטרתנו הייתה להבהיר את התגובות התאיות של תאי אפיתל בדרכי הנשימה לחשיפה כרונית לעשן טבק, ובכך לתרום להבנה עמוקה יותר של פתוגנזה של COPD. מודל זה יכול לשמש לחקר השינויים בדפוס התמיינות תאי אפיתל בדרכי הנשימה והמנגנון שלו הנגרם על ידי גירוי ארוך טווח של מזהמים שונים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x Penicillin/Streptomycin solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Transwell with 0.4 &#181;m Pore Polyester Membrane Insert, Sterile</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCS016012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500x Gentamicin/Amphotericin Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R01510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetylated &#945;-Tubulin</td>
			<td>CST</td>
			<td>#5335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-&#945;-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb&#160;</td>
			<td>cellsignal</td>
			<td>#5335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Component Free Cell Dissociation Kit</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>05426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-pan Cytokeratin antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab7753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cigarette</td>
			<td>Marlboro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Claudin3</td>
			<td>immunoway</td>
			<td>YT0949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclase I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclase I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F-12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Solution&#160;</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>07980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone Stock Solution</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>07925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucin 5AC</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab212636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin</td>
			<td>proteintech</td>
			<td>27260-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Cytosci</td>
			<td>CBS004S-BR500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI 
			Basal Medium</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>05002&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI 10x Supplement</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>05003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Maintenance Supplement</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>05006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-Ex Plus 50x Supplement</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>05042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-Ex Plus Basal Medium</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>05041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase E</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat tail collagen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>07050&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model for studying differentiation and changes of multi-omics on murine airway epithelial cells stimulated with cigarette smoke extract

מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) מיוחסת במידה רבה לחשיפה לעשן טבק. חקירת האופן שבו תאי אפיתל בדרכי הנשימה מסתגלים באופן פונקציונלי לעשן טבק חיונית להבנת הפתוגנזה של COPD. המחקר הנוכחי נועד להקים מודל במבחנה המשתמש בתאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה כדי לחקות את ההשפעה בחיים האמיתיים של עשן טבק. שלא כמו קווי תאים מבוססים, תאים ראשוניים שומרים יותר על תכונות דמויות vivo, כולל דפוסי גדילה, הזדקנות והתמיינות. תאים אלה מפגינים תגובה דלקתית רגישה והתמיינות יעילה, ובכך מייצגים באופן הדוק מצבים פיזיולוגיים. במודל זה, תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה של מורין גודלו בתרבית במשך 28 יום תחת ממשק אוויר-נוזל עם ריכוז אופטימלי של תמצית עשן סיגריות (CSE), מה שהוביל להפיכת שכבה אחת של תאים לא ממוינים לאפיתל עמודתי פסאודוסטרטי, המעיד על אקלום CSE. לאחר מכן יושמו ניתוחים מולטי-אומיים מקיפים כדי להבהיר את המנגנונים שבאמצעותם CSE משפיע על ההתמיינות של תאי דרכי הנשימה הבסיסיים. תובנות אלה מספקות הבנה עמוקה יותר של התהליכים התאיים העומדים בבסיס התקדמות COPD בתגובה לחשיפה לעשן טבק.

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is a heterogeneous lung condition with complex characteristics, while patients with COPD gradually tend to be younger1. Smoking, a primary risk factor for COPD2, has a profound impact on airway epithelial cells, which serve as the initial barrier against tobacco smoke. Despite this known association, the detailed mechanisms through which tobacco smoke induces changes in airway epithelial cells remain inadequately explored. A thorough understanding of these molecular alterations is essential for identifying early diagnostic markers and therapeutic targets for COPD.
To address this gap, we developed a novel in vitro model using murine airway epithelial cells. These cells were subjected to long-term stimulation with cigarette smoke extract (CSE), enabling us to monitor dynamic cellular changes and explore the changes in airway epithelial cells under long-term tobacco stimulation and the underlying mechanism. In this model, transwell was used to provide the air-liquid interface of airway epithelial cells, and cigarette smoke extract was stimulated in the early stage of epithelial cell differentiation until the end of differentiation at 28 days. Previous studies investigated only the differentiation and short-term stimulation of airway epithelial cells (cell line dominance). They were limited to a single regulatory pathway3,4,5,6. However, the protocol presented here uses primary mouse airway epithelial cells and optimizes the cell extraction process for better cell activity than previous airway epithelial cell culture methods. This model focuses on alterations in cellular differentiation alongside comprehensive transcriptomic, proteomic, metabolomic, and epigenomic analyses. Employing immunofluorescence and advanced multi-omics techniques, we aimed to elucidate the cellular responses of airway epithelial cells to chronic tobacco smoke exposure, thereby contributing to a deeper understanding of COPD pathogenesis. This model can be used to explore the changes in airway epithelial cell differentiation pattern and its mechanism caused by long-term stimulation of various pollutants.

מחבר זרקור: פיתוח ואפיון מודל במבחנה לחקר חשיפה כרונית לעשן סיגריות והשפעתה על תאי אפיתל בדרכי הנשימה במחקר COPD

מודל In Vitro לחקר התמיינות ושינויים של מולטי-אומיקה בתאי אפיתל של דרכי הנשימה של מורין המגורות באמצעות תמצית עשן סיגריות

The scope of our research is to develop and characterize an in vitro model using airway epithelial cells to study the effects of chronic CSC exposure. We aimed to understand the cellular response that occurred in airway epithelial cells under long-term cigarette smoke exposure, which is relevant to the pathogenesis of COPD. The recognition of intricate epithelium immune cell interaction in COPD is considered a pivotal recent development in COPD research.We have established a novel in vitro model that mimic chronic CSC exposure in airway epithelial cells. Our findings open up new avenue of investigating the long-term effect of chronic cigarette smoke exposure on airway epithelial cells and their role in COPD progression. In the future, our laboratory will focus on exploring specific pathway that regulate epithelial cells differentiation and the role of airway epithelial cells heterogenetic in COPD treatment response.

בידול תאי אפיתל של דרכי הנשימה התמינו בהצלחה לאחר תרבית בממשק אוויר-נוזל עם מדיום התמיינות במשך 28 ימים. נוכחותם של תאי ריסון וגביע הודגמה על ידי בדיקת אימונופלואורסנציה של סמן ריסונים אצטילאט α-טובולין (ירוק; איור 3A) וסמן תא הגביע Mucin5AC, בהתאמה6 (אדום; א?...

במאמר זה אנו מתארים מודל במבחנה לבידוד והתמיינות של תאי אפיתל בדרכי הנשימה, תוך התמקדות בהתאקלמותם לתמצית עשן סיגריות כרונית (CSE). ניתן להשתמש במודל כדי לאפיין באופן מקיף את ההשפעה הרב-אומית של CSE, מה שעשוי לספק תובנות לגבי התגובות התאיות תחת חשיפה כרונית לעשן.

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is largely attributed to tobacco smoke exposure. Investigating how airway epithelial cells functionally adapt ...

in-vitro-model-for-studying-differentiation-changes-multi-omics-on

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Model for Studying Differentiation and Changes of Multi-Omics on Murine Airway Epithelial Cells Stimulated with Cigarette Smoke Extract

473 Views.  Capital Medical University. היקף המחקר שלנו הוא לפתח ולאפיין מודל במבחנה באמצעות תאי אפיתל של דרכי הנשימה כדי לחקור את ההשפעות של חשיפה כרונית ל-CSC. מטרתנו הייתה להבין את התגובה התאית שהתרחשה בתאי אפיתל בדרכי הנשימה תחת חשיפה ארוכת טווח לעשן סיגריות, הרלוונטית לפתוגנזה של COPD. ההכרה ב...

Video: מחבר זרקור: פיתוח ואפיון מודל במבחנה לחקר חשיפה כרונית לעשן סיגריות והשפעתה על תאי אפיתל בדרכי הנשימה במחקר COPD

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is largely attributed to tobacco smoke exposure. Investigating how airway epithelial cells functionally adapt to tobacco smoke is crucial for understanding the pathogenesis of COPD. The present study was to set up an in vitro model using primary murine airway epithelial cells to mimic the real-life impact of tobacco smoke. Unlike established cell lines, primary cells retain more in vivo-like properties, including growth patterns, aging, and differentiation. These cells exhibit a sensitive inflammatory response and efficient differentiation, thus closely representing physiological conditions. In this model, primary murine airway epithelial cells were cultured for 28 days under an air-liquid interface with an optimal concentration of cigarette smoke extract (CSE), which led to the transformation of a monolayer of undifferentiated cells into a pseudostratified columnar epithelium, indicative of CSE acclimation. Comprehensive multi-omics analyses were then applied to elucidate the mechanisms by which CSE influences the differentiation of basal airway cells. These insights provide a deeper understanding of the cellular processes underpinning COPD progression in response to tobacco smoke exposure.

Here, we describe an in vitro model for isolating and differentiating murine airway epithelial cells, focusing on their acclimation to chronic cigarette smoke extract (CSE). The model could be utilized to comprehensively characterize the multi-omics impact of CSE, which possibly provides insights into the cellular responses under chronic smoke exposure.

Isolation of Primary Murine Airway Epithelial Cells from Murine Tracheas

To begin, arrange freshly prepared expansion medium, filter sterilized proteinase and antibiotic solutions, and sterilized surgical instruments on the working platform of the biosafety cabinet. Add rat tail collagen into 100-millimeter culture dishes and 24-millimeter trans wells. Leave the dishes open overnight under ultraviolet light for sterilization.Immerse the euthanized mouse in 75%ethanol for sterilization. Do not immerse the nose and mouth. Using surgical scissors and forceps, cut and open the epidermis from the lower jaw to the abdominal cavity of the mouse.Using another set of surgical scissors and forceps, tear apart the thyroid glands on both sides and remove the connections between the trachea, the surrounding muscle tissue, and the esophagus. Next, carefully cut into the chest, and use forceps to delve deeper into the chest cavity. Remove the entire lung and find the end of the trachea.Cut out the trachea from the thyroid cartilage to the tracheal bronchial branch, and put it in a pre cold expansion medium containing four antibiotics. Shake the tube to rinse as much blood as possible off the surface of the trachea before placing it on ice. Now transfer the trachea to pre cold PBS containing four antibiotics.Using surgical scissors and forceps, remove clots and other tissue from the surface of the trachea and cut them into one square centimeter size. Incubate tracheal tissue in proteinase solution at 37 degrees Celsius. After 40 minutes, rock the tube several times and use a 40-micron cell strainer to remove the remaining tissues.Rinse the chopped trachea on a strainer with five milliliters of expansion medium. Centrifuge the tracheal suspension at 400 G for five minutes at four degrees Celsius, and resuspend the pellet in eight milliliters of expansion medium. Count the viable cells using trypan blue and the hemocytometer.Plate P0 cell suspension on a 100-millimeter dish, precoated with rat tail collagen. Culture the cells at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide.

בידוד תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה של מורין מקנה הנשימה של מורין

Expansion Culture and Passage of Primary Murine Airway Epithelial Cells

Once the murine tracheal epithelial cells form an intact monolayer with a cobblestone appearance, gently rinse the cells with three milliliters of prewarmed PBS. Add three milliliters of animal component-free enzymatic dissociation solution to the dish and incubate at 37 degrees Celsius for five minutes. Gently pipette to dislodge the cells and transfer the suspension to three milliliters of animal component-free enzyme inhibition solution.Centrifuge the cell suspension at 400 G for five minutes at four degrees Celsius and resuspend the pellet in one milliliter of expansion medium. Count the viable cells using trypan blue and a hemocytometer. Plate P1 cell suspension on a 100 millimeter dish pre-coated with rat tail collagen.Culture the cells at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide.

תרבית הרחבה ומעבר תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה

Differentiation and Cigarette Smoke Extract (CSE) Stimulation of Primary Murine Airway Epithelial Cells at Air-Liquid Interface

Once the primary murine airway epithelial cells reach 80%confluency, seat cells on a glass slide coated with rat tail collagen. Then, add paraformaldehyde to fix the cells for 12 hours. Wash the slide three times with PBS for five minutes each, and incubate it with 3%bovine serum albumin and 0.1%Triton X-100 in PBS for one hour.Add anti-pan cytokeratin antibody at a dilution of one to 500 onto the slide, and incubate overnight at four degrees Celsius. The next day, wash the slide three times with PBS solution for five minutes each before incubating with secondary antibody at a dilution of one to 1, 000 for two hours in the dark. After washing the slide with PBS, add DAPI at a dilution of one to 1, 000 and incubate for 15 minutes.Wash the slide once with PBS for five minutes. Observe the slide under a fluorescence microscope to compare expression patterns to a positive control and a negative control After detachment and centrifugation, re-suspend the P2 phase cells in an appropriate volume of expansion medium. Pipette one milliliter of cell suspension onto the apical chamber of the Transwell polycarbonate membrane insert.Add 1.5 milliliters of proliferation media to the basal compartment of the Transwell. Incubate the cells at 37 degrees Celsius until confluence is reached. Prepare 50 milliliters of complete differentiation medium using the following components.Bubble one cigarette through 12.5 milliliters of differentiation medium, and then filter it through a 0.22 micron pour filter to prepare cigarette smoke extract or CSE. To ensure standardization between experiments and batches of CSE, measure the absorbance at 320 nanometers on a spectrophotometer. Next, remove the expansion medium from the apical and basal chamber of Transwells.Add a differentiation medium containing an appropriate concentration of CSE to stimulate primary murine airway epithelial cells for 28 days. During incubation, wash the apical chamber twice a week with PBS and replace the medium in the basal chamber with freshly prepared differentiation medium containing CSE. Murine airway epithelial cells successfully differentiated at an air liquid interface in 28 days.The presence of ciliated and goblet cells was demonstrated by immunofluorescence assay of cilia marker, acetylated alpha tubulin, and the goblet cell marker mucin 5AC respectively. Cell viability at 24 hours with varying CSE concentrations demonstrated that epithelial cells declined when the concentration was higher than 6%Cell activity under long-term stimulation showed no significant cell death with 2%4%and 6%CSE concentrations. But changes in transmembrane resistance and exfoliated cells were noted.In addition, an overall reduction in differentiated cells and ciliated cells was noted when murine airway epithelial cell cultures were chronically exposed to CSE.