במעבדה שלנו אנו חוקרים העברת אלקטרונים חוץ-תאית, או EET, בחיידקים כמו lactiplantibacillus plantarum, שהוא חיידק מותסס קריטי בתעשיות המזון. ב-EET, התא מעביר אלקטרונים לשרביט אלקטרוני חוץ-תאי, כמו אלקטרודה במערכת כימית ביואלקטרית. אנו רוצים להבין ולהנדס EET עבור יישומים בביו-חישה, ביוקטליזה ותסיסת מזון.
גילינו כי מנהרה אלפינית יכולה לרכוש זרם דרך EET בנוכחות קינון כגון DHNA. תהליך זה מחדש את NAD פלוס, מאיץ את האובדן הכולל של מסלולי התסיסה העיקריים ומגביר את צמיחת התאים. יתר על כן, אנו מוצאים כי נגזרות קינון מגוונות, מלבד DHNA, יכולות גם לתווך EET ב L plantarum.
חקירת EET מתווך דורשת הקמות ביוכימיות מיוחדות. באופן ספציפי, אנו משתמשים במערכת ביואלקטרוכימית בעלת שלוש אלקטרודות, שני תאים, כדי למנוע הצלבה בין התגובה האנודית לתגובה הקתודית. אנו משתמשים גם בשדה פחמן, אלקטרודה עובדת בעלת שטח פנים גדול כדי לשפר את העברת האלקטרונים ממתווכי אלקטרונים.
העבודה שלנו לחקור מסלולי EET ב L plantarum וכיצד מסלולים אלה אינטראקציה עם מטבוליזם תוסס יכול להיות יישומים שימושיים בתעשיות מזון. אנו יודעים ש-EET ו-L plantarum משנים שטף מטבולי באמצעות תסיסה, וניתן לתפעל זאת ליישומים שימושיים ולשינוי טעמי מזון ולייצור כימיקלים יקרי ערך בתסיסה אלקטרו. בעתיד, נמשיך להרחיב את הידע הבסיסי שלנו על EET ולהמשיך ביישומי EET חדשניים באורגניזמים כמו L plantarum.
אנו מתכננים להנדס חלבונים במסלול EET, מה שיאפשר לנו להמשיך לשלוט ב-EET עבור יישומים בתסיסה אלקטרו וביו-חישה. כדי להתחיל, חול מראש לחתוך חוטי טיטניום בקוטר מילימטר אחד לעבודה אלקטרודות מונה, עם נייר זכוכית תחמוצת אלומיניום עד מבריק באופן שווה. בעזרת צבת, כופפו קצה אחד של כל חוט אלקטרודה עובד לתוך וו קטן.
החליקו כדור פחמן עגול בגודל 16 סנטימטרים רבועים על כל חוט אלקטרודה עובד, ארגו את החוט פנימה והחוצה מהפחמן העגול פעם אחת ומשכו את העיגול במורד החוט עד שהוא מאובטח על הוו. אבטחו את אלקטרודות מפגש העבודה לתוך כובעי GL 45 על ידי ניקוב מחיצת הגומי עם החוט ומשיכת אותו דרך כמה סנטימטרים. כדי לבנות כורים זוגיים, הרכיבו את טבעת ה-O והניחו קרום חילופי קטיונים חתוך מראש, ספוג מראש במים לתוך טבעת ה-O שהורכבה.
מניחים את טבעת ה-O עם הממברנה בין הפתחים התחתונים הגדולים של שני בקבוקי כור זוגיים. אבטחו את זוג בקבוקי הכור וטבעת עם הממברנה בעזרת מהדק מפרק. יש להכניס מוט ערבוב מגנטי לכל תא אנודי לפני סגירת כל הפתחים הקטנים בחלק העליון של כל בקבוק עם פקקי GL14, המצוידים במחיצה מגומי.
מלאו כל בקבוק כור ב-110 מיליליטר מים שעברו דה-יוניזציה. הכנס את הכובעים המצוידים באלקטרודת עבודה עגולה מפחמן ולחץ בעדינות על החלק העליון של סיבוב הלבד כדי לשמור אותו מאובטח על הוו. סגור את הבקבוקים עם מכסה GL45 המתאים המצויד באלקטרודה.
כורים אוטוקלאביים מלאים במים ומכסי אלקטרודות GL14. בתנאים סטריליים, יש לגרד את תרבית צמח הלקטופלנט abasilisk plantarum מראש מלאי גליצרול, ולחסן בשלושה מיליליטר של ביקוש מסחרי rugosa sharp, או MRS medium. לדגור על התרבית למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, מבלי לרעוד.
כדי להתחיל, בארון בטיחות ביולוגית סטרילי, יש להשליך את המים האוטוקלאביים מהכורים של המערכת האלקטרוכימית הביו-אלקטרוכימית. מלאו את התאים הקתודיים ב -110 מיליליטר של תאים בינוניים ואנודיים M9 אוטוקלאביים עם 110 מיליליטר של MCDM טרי. יש להחליף מכסה GL14 אחד מהתא האנודי בכובע אוטוקלאבה GL14 עם טבעת סיליקון לתקרה.
רססו את אלקטרודות הייחוס המוכנות באתנול 70% לפני הכנסתן דרך מכסה האלקטרודה לכל תא אנודי. הדקו את כל המכסות והמלחציים כדי למנוע דליפה. כדי לחבר את הכורים למערכת משאבת המים, ראשית, הניחו כל כור על משטח מוט הערבוב המתאים.
לאחר מכן חבר את ברזי מעיל המים של כל כור למשנהו באמצעות צינורות גומי, וחבר את כורי הקצה לצינורות הזרימה והזרימה של משאבת המים. מלאו את המשאבה במים והוסיפו ארבע עד שש טיפות של מזגן. הפעל את מערכת המשאבה והגדר את הטמפרטורה ל -30 מעלות צלזיוס.
הפעל את המשאבה והתבונן בזרימת המים דרך כל מעילי המים של הכור, וודא שאין דליפות. הפעל את פלטפורמות הערבוב והגדר אותן לערבוב רציף במהירות 220 סל"ד. כדי לחבר את הכורים לקווי הגז החוסך בחנקן, ראשית, חברו מסנן אוויר למחט 22 מד והכניסו את המחט דרך המחיצה העליונה של תא אנודי של כור לתקשורת.
הכנס מחט 18 מד במחיצה העליונה של תא אנודי של כור, ולאחר מכן חבר את צינור הגז ממקור חנקן למסנן האוויר ופתח את השסתום כדי לאפשר לגז לבעבע בעדינות דרך הכור. כדי לחבר את הביוריאקטורים למוליכי הפוטנציאוסטט, חברו את מונה העבודה ותפס התנין של אלקטרודות הייחוס מוליכים מהפוטנציוסטט לאלקטרודות התואמות שלהם. לאחר הזנת כל הפרמטרים, לחץ על משולש ההתחלה הירוק כדי להתחיל בריצה.
התבונן בעקבות מתח המעגל הפתוח במשך מספר דקות כדי לוודא שכל הכורים קוראים באופן חיובי. וקרובים זה לזה באות יציב. בתנאים סטריליים, תת-תרבית את תרבית L plantarum שגודלה בעבר אחד עד 200 ב-50 מיליליטר MMRS.
לגדל את התאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס, ללא רעד. בתור התחלה, הוציאו את תרבית L plantarum שגדלה ב-MMRS מהאינקובטור. מעבירים את התרבית לצינור חרוטי 50 מיליליטר בתנאים סטריליים ומניחים את הצינור על קרח.
צנטריפוגה התרבות ב 4, 000 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את supernatant לפני resuspending את הגלולה ב 50 מיליליטר של PBS. לאחר השטיפה השנייה, השהה מחדש את התאים ב- PBS קר לצפיפות אופטית של 600 ננומטר של 11.
לטעון שני מיליליטר של תאים resuspended לתוך מזרק שלושה מיליליטר, מצויד מחט. בתחנת הכור, ערפו את ראשו של מזרק התא והכניסו את המחט לחלק העליון של תא אנודי של כור. ברגע שכל המזרקים נמצאים במקומם, לחץ על הבוכנות כדי להזריק את התאים.
רשום את זמן ההזרקה ממעקב הכרונואמפרומטריה. אפשר לזרם להתייצב על העקבות למשך שעתיים עד ארבע שעות. במערכת הביואלקטרוכימית, תייגו את כורי הניסוי כפלוס DHNA, ואת כורי בקרת הממס כמינוס DHNA.
יש לערוף מזרק טעון ב-110 מיקרוליטר של 20 מיליגרם למיליליטר DHNA, ולהכניס אותו לחלק העליון של התא האנודי, המוגדר כ-Plus DHNA. הכנס מזרק עמוס ב -110 מיקרוליטר DMSO לתא האנודי, המיועד כמינוס DHNA. באמצעות מזרק של שלושה מיליליטר המצויד במחט של 21 מד, הסר שני מיליליטר של מדיה מכל תא אנודי דרך מחיצת הפקק הקטן שאינה בשימוש.
העבירו את הדגימות לצלחת באר עמוקה 24 כדי למדוד pH לנקודת הזמן של שעת האפס. לחץ על הבוכנות של מזרקי DHNA ו- DMSO כדי להזריק לכורים. רשום את זמן ההזרקה ממעקב הכרונואמפרומטריה.
השליכו את כל המזרקים והמחטים. לאחר 24 שעות, הסר שני מיליליטר של מדיה מכל תא אנודי כפי שתואר קודם לכן, והעבר אותו לצלחת באר עמוקה 24 למדידות pH של 24 שעות. הפעל את הוולטמטריה המחזורית עבור נקודת הזמן של 24 שעות.
מדוד ורשום את רמת החומציות עבור דגימות של 24 שעות מכל כור. צפיפות הזרם כתוצאה ממעבר אלקטרונים חוץ-תאיים הגיעה לשיא של כ-132 מיקרו-אמפר לסמ"ר, שמונה שעות לאחר הזרקת ה-DHNA. לעומת זאת, הזרקת DMSO הביאה לצפיפות זרם זניחה.
נתוני הוולטמטריה המחזורית הראו עלייה מובהקת בזרם החמצוני ב-50 מיליוולט בנוכחות L plantarum עם DHNA, בהשוואה ל-L plantarum עם DMSO ועלייה של 256% בצפיפות הזרם ב-300 מיליוולט, בהשוואה לעקבות DHNA אביוטיות. העברת אלקטרונים חוץ-תאיים הביאה לירידה ניכרת ב-pH לממוצע של 3.33 במשך 24 שעות בדגימות עם L plantarum ו-DHNA, בעוד שבדגימות עם L plantarum ו-DMSO היה pH ממוצע של 6.50.
