В нашей лаборатории мы исследуем внеклеточный перенос электронов, или ЭОТ, у таких бактерий, как lactiplantibacillus plantarum, которые являются ферментативными бактериями, имеющими решающее значение в пищевой промышленности. При ЭЭТ клетка передает электроны внеклеточному электронному скипетру, подобно электроду в биоэлектрической химической системе. Мы хотим понять и спроектировать ЭЭТ для применения в биосенсорике, биокатализе и ферментации пищевых продуктов.
Мы обнаружили, что альпийский туннель может поглощать ток через ЭЭТ в присутствии хинона, такого как ДГНК. Этот процесс регенерирует NAD plus, ускоряет общую потерю первичных путей ферментации и стимулирует рост клеток. Более того, мы обнаружили, что различные производные хинона, отличные от ДГНК, также могут опосредуть ЭЭТ в L. plantarum.
Исследование опосредованной ЭЭТ требует специализированных биохимических установок. В частности, мы используем трехэлектродную двухкамерную биоэлектрохимическую систему для предотвращения перекрестных помех между анодной и катодной реакциями. Мы также используем углеродное поле, рабочий электрод, который имеет большую площадь поверхности для улучшения переноса электронов от электронных медиаторов.
Наша работа по изучению путей ЭЭТ в L. plantarum и того, как эти пути взаимодействуют с ферментативным метаболизмом, может иметь полезное применение в пищевой промышленности. Мы знаем, что EET и L. plantarum изменяют метаболический поток посредством ферментации, и этим можно манипулировать для полезных применений, изменения вкуса пищи и производства ценных химических веществ в электроферментации. В будущем мы продолжим расширять наши фундаментальные знания о ЭЭТ и искать новые приложения ЭЭТ у таких организмов, как L. plantarum.
Мы планируем разрабатывать белки в пути ЭЭТ, что позволит нам в дальнейшем контролировать ЭЭТ для применения в электроферментации и биосенсорике. Для начала предварительно отшлифуйте титановые проволоки диаметром один миллиметр для работы в противоэлектродах, с наждачной бумагой из оксида алюминия до равномерного блеска. С помощью плоскогубцев согните по одному концу каждого рабочего электродного провода в небольшой крючок.
Наденьте круглую проволоку из углеродного войлока площадью 16 квадратных сантиметров на каждую рабочую электродную проволоку, по одному разу вплетая проволоку внутрь и наружу из нее и потянув круг вниз по проволоке, пока она не закрепится на крючке. Закрепите рабочие контактные электроды в колпачках GL 45, проткнув проволокой резиновую перегородку и протянув ее на несколько сантиметров. Чтобы построить парные реакторы, соберите уплотнительное кольцо и поместите в собранное уплотнительное кольцо предварительно разрезанную катионообменную мембрану, предварительно смоченную в воде.
Поместите уплотнительное кольцо с мембраной между большими нижними отверстиями двух спаренных бутылок реактора. Закрепите реакторную пару бутылок и кольцо с мембраной с помощью зажима для кастета. Опустите магнитную мешалку в каждую анодную камеру, прежде чем закрыть все маленькие отверстия в верхней части каждой бутылки крышками GL14, оснащенными резиновыми перегородками.
Наполните каждую бутылку реактора 110 миллилитрами деионизированной воды. Вставьте колпачки, оснащенные круглым рабочим электродом из углеродного войлока, и осторожно нажмите на верхнюю часть войлочного круга, чтобы он был закреплен на крючке. Закройте флаконы соответствующей крышкой GL45 с электродом.
Автоклавные водонаполненные реакторы и электродные колпачки GL14. В стерильных условиях соскребите культуру лакторастения василискового плантарума с верхушки глицеринового подвоя и инокулируйте в три миллилитра коммерческого спроса ругоза острый, или MRS medium. Инкубируйте культуру в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия, не встряхивая.
Для начала в стерильном шкафу биобезопасности выбросьте автоклавную воду из реакторов биоэлектрохимической системы. Заполните катодные камеры 110 миллилитров автоклавного среднего М9, а анодные камеры — 110 миллилитров свежеприготовленного MCDM. Замените один колпачок GL14 из анодной камеры на автоклавный колпачок GL14 с силиконовым потолочным кольцом.
Распылите на подготовленные электроды сравнения 70% этанола перед тем, как поместить его через электродный колпачок в каждую анодную камеру. Затяните все колпачки и зажимы, чтобы избежать протечек. Чтобы прикрепить реакторы к системе водяного насоса, сначала поместите каждый реактор на соответствующую платформу для перемешивания.
Затем соедините патрубки водяной рубашки каждого реактора с другим резиновыми трубками, соединив концевые реакторы с входной и выходной трубками водяного насоса. Наполните насос водой и добавьте от четырех до шести капель кондиционера для воды. Включите насосную систему и установите температуру на 30 градусов Цельсия.
Запустите насос и наблюдайте за потоком воды через все водяные рубашки реактора, подтверждая отсутствие утечек. Включите платформы для перемешивания и установите их на непрерывное перемешивание при 220 об/мин. Чтобы прикрепить реакторы к азотосберегающим газопроводам, сначала прикрепите воздушный фильтр к игле 22 калибра и вставьте иглу через верхнюю перегородку анодной камеры реактора в фильтрующий материал.
Вставьте иглу 18 калибра в верхнюю перегородку анодной камеры реактора, затем подсоедините газопровод от источника азота к воздушному фильтру и откройте клапан, чтобы газ мог мягко пузыриться через реактор. Чтобы прикрепить биореакторы к проводам потенциостата, подсоедините рабочие выводы счетчика и электрода сравнения из кожи аллигатора от потенциостата к соответствующим электродам. После ввода всех параметров нажмите зеленый стартовый треугольник, чтобы начать забег.
Наблюдайте за кривыми напряжения холостого хода в течение нескольких минут, чтобы убедиться, что все реакторы показывают положительные результаты. и сомкнуться вместе с постоянным сигналом. В стерильных условиях субкультуру из ранее выращенной культуры L. плантарума составляют от одного до 200 в 50 миллилитров MMRS.
Выращивайте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию, не встряхивая. Для начала извлеките из инкубатора культуру L, выращенную в MMRS. Переложите культуру в коническую пробирку объемом 50 миллилитров в стерильных условиях и поместите пробирку на лед.
Центрифугируйте культуру при 4000 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Удалите надосадочную жидкость перед повторной суспензией гранулы в 50 миллилитрах PBS. После второй промывки ресуспендируйте клетки в холодном PBS до оптической плотности при 600 нанометрах 11.
Загрузите два миллилитра ресуспендированных клеток в трехмиллилитровый шприц, снабженный иглой. На реакторной станции снимите крышку с клеточного шприца и вставьте иглу в верхнюю часть анодной камеры реактора. Когда все шприцы будут на месте, нажмите на поршни, чтобы ввести клетки.
Запишите время инъекции по трассе хроноамперометрии. Дайте течению стабилизироваться на трассе в течение двух-четырех часов. В биоэлектрохимической системе обозначьте экспериментальные реакторы как плюс ДГНК, а реакторы контроля растворителей — как минус ДГНК.
Снимите крышку со шприца, загруженного 110 микролитрами 20 мг на миллилитр ДГНК, и вставьте его в верхнюю часть анодной камеры, обозначенную как плюс ДГНК. Вставьте шприц со 110 микролитрами ДМСО в анодную камеру, обозначенную как минус ДГНК. С помощью трехмиллилитрового шприца, оснащенного иглой 21 калибра, удалите по два миллилитра среды из каждой анодной камеры через неиспользуемую перегородку малого колпачка.
Перенесите образцы в планшет глубиной 24 лунки, чтобы измерить pH в момент нулевого часа. Нажмите на поршни шприцев ДГНК и ДМСО для впрыска в реакторы. Запишите время инъекции по трассе хроноамперометрии.
Выбросьте все шприцы и иглы. Через 24 часа удалите два миллилитра среды из каждой анодной камеры, как описано выше, и перенесите его в 24-луночный планшет для измерения pH в течение 24 часов. Запустите циклическую вольтамперометрию для 24-часового временного интервала.
Измерьте и запишите pH для 24-часовых проб из каждого реактора. Плотность тока из-за внеклеточного переноса электронов достигла пика примерно в 132 микроампера на квадратный сантиметр через восемь часов после инъекции ДГНК. Напротив, инжекция ДМСО привела к незначительной плотности тока.
Данные циклической вольтамперометрии показали отчетливое увеличение окислительного тока при 50 мВ в присутствии L. plantarum с ДГНК по сравнению с L. plantarum с ДМСО и увеличение плотности тока на 256% при 300 мВ по сравнению с абиотическим следом ДГНК. Внеклеточный перенос электронов привел к заметному снижению pH в среднем до 3,33 в течение 24 часов в образцах с L. plantarum и DHNA, в то время как образцы с L. plantarum и ДМСО имели средний pH 6,50.
