אנו מחויבים לחקור את מנגנון ההיתוך של ממברנות תוך-תאיות. בפרוטוקול זה, אנו שואפים לממש את הדינמיקה הקונפורמציונלית של חלבון היתוך קרום הרשתית האנדופלזמית אטלסטין במהלך מחזור ההידרוליזה של GTP על ידי smFRET. אטלסטין עשוי להתקיים כמונומר או דימר במחזור ההידרוליזה של GTP.
בניסויים של מולקולה בודדת, זה מאתגר למצוא אסטרטגיות תיוג ואימוביליזציה מתאימות של חלבונים, והדברים הבאים מציגים את הדינמיקה הקונפורמציונית של אטלסטין לאורך מחזור ההידרוליזה של GTP. בהשוואה ל-FRET בתפזורת, smFRET יכול לנטר במדויק קונפורמציות חלבון במצבי טעינת נוקלאוטידים שונים, ובכך לספק תובנה ישירה לגבי ההתנהגות של מולקולות מודולטור. השתמשנו ב-smFRET כדי לפתור באופן מלא את מחזור ההידרוליזה של GTP של אטלסטין במהלך אסטרטגיות מיקום שונות.
אנו מאמינים שהממצאים שלנו יקדמו דינמיקה קונפורמציונלית יותר בחקר חלבוני הידרוליזה של GTP, ויספקו פרשנויות חדשות לתהליך ביולוגי נדיר. כדי לנקות את פני הכיסוי, השתמש בפינצטה כדי להרים שמונה כיסויים, ולהניח אותם בצנצנת מכתים. הוסף 50 מיליליטר אצטון כדי לכסות את הכיסויים, והניח את צנצנת הצביעה בחומר ניקוי קולי למשך 30 דקות.
שטפו את הכיסויים שלוש פעמים במים מזוקקים כפולים, ושטפו אותם עם מתנול בחומר ניקוי קולי. לאחר מכן, הוסיפו תמיסת פיראנה לצנצנת הצביעה, וחממו אותה בקומקום אמבט מים בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר קירור הצנצנת לטמפרטורת החדר, שטפו את הכיסויים שש פעמים במים מזוקקים כפולים.
הוסף תמיסת נתרן מתוקסיד לצנצנת הצביעה, והניח אותה במנקה האולטראסוני למשך 15 דקות. לאחר שטיפת הכיסויים במים, הוסיפו מים מזוקקים כפולים לצנצנת הצביעה, והניחו אותם במנקה האולטראסוני למשך 15 דקות. מהדקים את הכיסויים בצנצנת הצביעה ומייבשים אותם בחנקן.
מעבירים את הכיסויים המיובשים לצנצנת מכתים אחרת, ואופים את הצנצנת בתנור ייבוש בחום של 120 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, מצננים את הצנצנת לטמפרטורת החדר במייבש. מוסיפים לכוס 47.5 מיליליטר מתנול, 2.5 מיליליטר חומצה אצטית ו -0.5 מיליליטר טריאתוקסילאן ומערבבים באופן שווה.
מעבירים את התערובת לצנצנת הצביעה ודוגרים למשך 10 דקות. שוטפים את הכיסויים שלוש פעמים במים מזוקקים כפולים בצנצנת הצביעה, וסוניקציה למשך חמש דקות. לאחר שטיפת הכיסויים במים וייבושם בחנקן כפי שהודגם, הנח את הכיסויים בצלחת פטרי בקוטר 10 סנטימטרים.
ממיסים SVA-mPEG ו-SVA-mPEG-ביוטין בתמיסת המלח הגבוהה ביחס של 1:100. זרוק את התערובת המוכנה על כיסוי וכסה אותה בכיסוי נוסף. דגרו את הכיסויים בלחות מתאימה למשך שעתיים או למשך הלילה.
לאחר השינוי, הפרד את הכיסויים, שטוף אותם במים נטולי יונים וייבש בחנקן. הנח בזהירות את הכיסוי שהשתנה בצינור של 50 מיליליטר. לאחר טיהור תחום ה-GTPase של חלבון דמוי דינמין אטלסטין או ATL המתבטא בתאי רוזטה E.coli, שנה את מאגר החלבון למאגר הביוטינילציה של החלבון באמצעות מסנן צנטריפוגלי של 10 קילודלטון.
לביוטינילציה של חלבון, מערבבים 100 מיקרוליטר כל אחד של ATP של 100 מילי-מולרי, מגנזיום אצטט של 100 מילי-מולרי ו-500 מיקרו-מולרי D-ביוטין, 10 מיקרוליטר של 100 מיקרו-מולרי ביוטין ליגאז ו-50 מיקרו-מולרי של חלבון לנפח סופי של מיליליטר אחד. דוגרים את התערובת למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, הסר D-ביוטין חופשי באמצעות מסנן צנטריפוגלי במשקל מולקולרי של 10 קילו-דלטון.
דגרו 20 מיקרוליטר של חלבון ביוטיניל עם 20 מיקרוליטר של סטרפטווידין 15 מיקרומולרית למשך 20 דקות על קרח. זהה את היעילות של ביוטינילציה של חלבון באמצעות SDS-PAGE. ממיסים פלואורופורים LD555 ו-LD655 בדימתיל סולפוקסיד לריכוז סופי של חמש מילי-מולר.
להכנת מאגר התיוג, ערבבו 25 מילי-מולרי HEPES, 150 מילי-מולרי אשלגן כלורי ו-5 מילי-מולרי מגנזיום כלוריד. שנה את מאגר החלבון למאגר התיוג באמצעות מסנן צנטריפוגלי של 10 קילודלטון. עבור מבחני smFRET תוך-מולקולריים, מערבבים ATL1cyto-TK עם LD555 ו-LD655 ביחס של 1:1.2:1.2 לנפח סופי של 100 מיקרוליטר.
דגרו על התערובת במשך חמש שעות בחום של ארבע מעלות צלזיוס. עבור מבחני smFRET בין-מולקולריים, דגרו ATL1cyto-K עם LD555 ו-ATL1cyto-K ביוטינילציה עם LD655 למשך חמש שעות בארבע מעלות צלזיוס. כדי להכין את תא הקיבוע של החלבון, הדביקו בזהירות את שקופית הכיסוי והמיקרוסקופ ששונתה עם סרט דו צדדי מותאם אישית.
התקן צינורות וטיפים ליצירת תא מיקרופלואידית עם שישה ערוצים. לצורך תיקוני מיפוי, הוסף 10 מיקרוליטר של חלקיקי פוליסטירן 10% על שקופית מיקרוסקופ וכסה אותה בכיסוי. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת, בחר שדה ראייה המכיל חלקיקי פוליסטירן וצלם סרטון במצב שדה בהיר.
השתמש בסקריפט מותאם אישית כדי ליישר את המיקום המרכזי של אותו חלקיק פוליסטירן הן בערוץ התורם והן בערוץ המקבל. שמור את קובץ המפה כקובץ TXT. עבור ניסויי smFRET בין-מולקולריים, ערבבו LD555 המסומן ATL1cyto-K עם LD655 המסומן ATL1cyto-K-biotin ביחס של אחד לאחד עם ריכוז סופי של מילימולר אחד של GTP-gamma-S.
דגרו את התערובת על קרח למשך שעה כדי לעמעם את החלבונים. Mix LD555 שכותרתו ATL1cyto-T עם LD655 שכותרתו ATL1cyto-K-biotin ביחס של אחד לאחד עם מילי-מולר אחד של GTP-gamma-S עבור ניסויי SMFRET בין-מולקולריים של ATL1cyto-T ו-ATL1cyto-K. דגרו את התערובת על קרח למשך שעה לקבלת חלבונים מעומעמים.
לאחר מכן, עבור בדיקות smFRET תוך-מולקולריות, דגרו LD555 ו-LD655 המסומנים ATL1cyto-TK עם מילי-מולרית אחת של תמ"ג על קרח למשך שעה. לניסויים בין-מולקולריים, דגרו 10 מיקרוגרם למיליליטר של סטרפטווידין למשך 10 דקות כדי לשתק חלבונים. לבדיקות תוך-מולקולריות, הוסף 10 מיקרוגרם למיליליטר של נוגדן אנטי-His ביוטינילי ודגר למשך 10 דקות כדי לשתק חלבונים.
לאחר הדגירה, הוסף את דימר ATL1 המדולל לחלבון בתעלה ואפשר לו לשתק למשך 10 דקות. שטפו את התעלה פעמיים עם מאגר דגירה. הוסף חומצה בנזואית ו- PCD לתעלה בריכוז סופי של 2.5 מילימולר.
בחר בלייזר 532 ננומטר כמקור אור העירור. הגדר את מצלמת EMCCD להקליט נתונים במרווח פריימים של 30 אלפיות השנייה. שמור את הסרטים המוקלטים בפורמט TIFF של 16 סיביות.
לאחר רכישת נתונים, חלץ רצועות FRET מהסרטים המוקלטים. בחר ושמור רצועות FRET בפורמט TXT. חלץ את הנתונים מקבצי TXT, וחשב את ערכי ה-FRET באמצעות סקריפטים תוצרת בית ב-MATLAB.
התאם את נתוני ה-smFRET של GaussAmp ב-Origin כדי לקבל את היסטוגרמה של ההתפלגות.
