אנו מודים ז'אן-בפטיסט Sibarita, דניאל Choquet (IINS, CNRS/אוניברסיטת בורדו) על תמיכתם די עם הניתוח מולקולה בודדת. במיוחד תודה ניק Valmas, ג'סיקה Mcgaw (QBI, אוניברסיטת קווינסלנד) על עזרתם עם הווידאו מקליט, קריינות, כמו גם איור עיצוב גרפי. עבודה זו נתמכה על ידי הפרויקט גילוי המועצה מחקר אוסטרלי (AR) (DP170100125 ל- F.A.M.), המועצה למחקר אוסטרלי (ליף גרנט LE0882864 ל- F.A.M.), מלגת העתיד מועצת המחקר האוסטרלי (גרנט ליף (FT100100725 B.V.S.), LE130100078 כדי F.A.M.) NHMRC הפרוייקט הענק (APP1103923 כדי B.V.S.). F.A.M. הוא עמית מחקר בכיר NHMRC (ONT1060075).

1. עיצוב של הטרנסגניים דרוזופילה המבטאים חלבונים מתויג mEos2
<ol><li>בחר את החלבון כדי להיות מתויג עם החלבון mEos2. כדי להגדיל את שיעור ההצלחה הדמיה, בחר חלבונים עם תחום transmembrane קרום פלזמה עצביים14 (למשל, Syntaxin-1A), חלבונים הסינפטיות או autophagosomes26,27 (למשל, Synaptobrevin-2), או חלבונים cytosolic עם אינטרקציה קרובה עם קרום פלזמה עצביים חלבונים (למשל, Munc18-1).</li>
	<li>לבנות transgenes קידוד החלבון מתויג mEos2 (איור 1). לעצב את ואחורה צבעי יסוד חלבונים ו- mEos2. הערה: רצף קידוד mEos2 יכול הגברה מן פלסמיד pmEos2-N1, אשר נועדה הפתיל קצה קרבוקסילי של החלבון עניין. שיבוט לדוגמה ניתן לבצע על ידי ויוו רקומבינציה ב האפייה בעזרת את pFL44S-attB-MCS-w + וקטור14,28, לסירוגין שיטות השיבוט אחרות יכול לשמש כמו גיבסון הרכבה פרוטוקול29.<ol>
<li>Linearize וקטור עם BamHI, XbaI, שותף להפוך ura3 - תאי שמרים עם השברים PCR קידוד mEos2 ו החלבון עניין. מזריקים עוברי דרוזופילה הבונה כדי ליצור קו לטוס הטרנסגניים30.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אחורי התרבויות לטוס הטרנסגניים בינוני שמרים ומולסה רגיל או איזה תחליף מתאים אחרים הכלולים צלוחיות פלסטיק. כדי להבטיח גדולים למדי ובריאה עם העיתון ons סינפטית31, למנוע זבובים, צפיפות הבקבוקונים והפיכה של זבובים כדי בקבוקונים חדשים לאחר לכל יום להטלת ביצים; פעולה זו מבטיחה השלישי לחלל הזחלים ניזונים היטב ולהגיע בגובה המתאים עד שהם התחילו לנדוד על בינוני. הרימו את הזבוב הטרנסגניים בטמפרטורת החדר (25 ° C). הערה: עם העיתון ons סינפטית גדולים נוטים להניב כמות גדולה יותר של חלבונים דמיינו במהלך דימות.</li>
</ol>2. ניתוח של זחל לחלל השלישי
<ol><li>להפוך ≤20 הבסיס של polydimethylsiloxane בצורת גליל או semicylindrical (PDMS) מ מ קוטר, ≤20 מ מ, גובה באמצעות ערכת elastomer הסיליקון המתאימים (איור 2 א). מערבבים elastomer סיליקון עם סיליקון התקשות הסוכן ביחס של 10:1.<ol>
<li>מערבבים את התערובת היטב עבור 5 דק לשפוך התערובת לתוך תבנית עם dimsensions המפורטים לעיל. . תן לזה להקשיח בתנור ב 100 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. הבסיס PDMS יהווה הבסיס שעליו לבצע את ניתוח. להבטיח הבסיס PDMS משתלב הבדידות מאכל תת תרבות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בחר זחל נודד לחלל השלישי מהקיר המבחנה. השתמש סטריאו-במיקרוסקופ אופטי בהגדלה 4.5 להמחיש הזחל להציב בבסיס גלילי PDMS עם הצד הגבי למעלה.</li>
	<li>השימוש מעוקל, בזווית פינצטה לתקוע סיכות minutien על הראש מעל הפה ווים, בין השניים הרחבת spiracles הקדמי, ו על הזנב מעל פי הטבעת, בין spiracles האחורי שני. הוסף µL 40 של שניידר חרקים בינוני בטמפרטורת החדר אל הזחל קיבוע. הערה: פתרונות, כמו Hemolyph (HL3 או HL6) עשוי לשמש גם במקום של שניידר-פתרון-32,-33.</li>
	<li>מספקים גישה דרך הצד הגבי של קיר הגוף בטן של הזחל על ידי שימוש minutien pin כדי פצעים וחתכים לתוך האמצע של הקיר.</li>
	<li>שימוש מעיין מספריים כדי לגזור את הקיר הגוף תפתח נקודת החיתוך. חתך לאורך הקו האמצעי ב- הקדמי-את ישבנה לכיוון34.</li>
	<li>השתמש בסדר מלקחיים ואביב מספריים את המעיים הזחל: להסיר את האיברים הפנימיים, כולל בלוטות הרוק, קנה הנשימה, הבטן. לשטוף את הזחל פעמיים עם בינוני חרקים של שניידר.</li>
	<li>עם מלקחיים בסדר, תחזיק את המדפים קיר הגוף שני למתוח אותם החוצה ובעדינות לתקוע שני פינים minutien בכל צד. זה צריך לייצר תכשיר בצורת משושה (איור 2 א).</li>
	<li>לנתק את המוח של חוט עצבי הגחון באמצעות מספריים האביב כדי להקטין את האפשרות של תנועת השרירים במהלך דימות; זה משמש גם להחזיק את ההכנה שווידאתם המנה הדמיה. השתמש את הפינצטה מעוקלים כדי לדחוף את כל הפינים minutien שש לתוך הבסיס PDMS. הערה: רק חלק קטן של הפינים צריך להיות מוטבע בתוך קיר הבטן.</li>
	<li>כדי לאשר כי הזחל שרדה את ההליך לנתיחה, מעט לתקוע את חוט עצבי הגחון, זה צריך להפיק התכווצות סחרור לקיר הבטן זחל.</li>
</ol>3. מעט אלכסונית תאורה יחיד-חלקיקים מעקב מיקרוסקופ
<ol><li>היפוך הבסיס זחל גזור-PDMS על גבי צלחת תת תרבות. למלא את הצלחת הדמיה 2 מיליליטר חרקים בינוני של טמפרטורת החדר שניידר (איור 2B).</li>
	<li>לאתר מוטורי לגלוקוז בקטעים השני והשלישי עם הסינפסות על שרירי הבטן 6 ו-735 באמצעות ה-x 63 / 1.2 נה טבילה במי המטרה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי גמורה קרינה פלואורסצנטית (TIRF).</li>
	<li>השתמש את עיניות במיקרוסקופ כדי לאתר הזחל גזור; לזהות שריר 6 על-ידי שימוש שדה בהיר תאורה.</li>
	<li>השתמש בתוכנת רכישה של מיקרוסקופ (ראה טבלה של חומרים), בתצורת TIRF; החליקו את זווית המצלמה קולימטור 1° כדי להגדיל את עומק החדירה, אחרת תעבור זווית קריטית TIRF כדי להשיג תאורה עקיפה.</li>
	<li>. הפעילי את 488 ננומטר לייזר לדמיין mEos2 בירוק השתמש כוח לייזר נמוך (פחות מ- 5% של 22.8 mW) כדי למנוע הלבנת את קרינה פלואורסצנטית ירוק. לאתר את צמתי neuromuscular (אשר נראים כמו חרוזים על חוט) ולרכוש תמונה ברזולוציה נמוכה TIRF.</li>
	<li>לעבור בו זמנית על 405 ננומטר לייזר (photoconverts mEos2 מירוק מינים אדומים) ו לייזר nm (תמונה mEos2 photoconverted אדום) 561 למקם stochastically חלבונים פלורסנט mEos2 יחיד. הערה: מומלץ השימוש 405 ננומטר לייזר צריכת חשמל נמוכה (0.005% 0.9 4.78 mW) כמו זה מאפשר קצב photoconversion קבועים יחסית במהלך הסרט. שימוש בין 50 ל- 75% ננומטר לייזר 561 (20.1 mW), כמו זה מספיק כדי לרכוש פלורסצנטיות מן המין mEos2 אדום מבלי להשפיע לרעה על המורפולוגיה של רקמות השרירים המקיפים את צומת עצב-שריר.</li>
	<li>עבור כל שרשרת צומת עצב-שריר, רוכשים פעם סדרה מורכבת של מסגרות 15,000 או יותר ב 33 הרץ. שמור תבנית as.czi על מנת לשמר את המטה-נתונים הנלווה לעיון אפשרי.</li>
	<li>השתמש ImageJ כדי להמיר קבצי סרט '.czi' '.tiff'.</li>
	<li>לנתח את הסרטים רכשה עם מולקולה בודדת מתאים ומעקב אחר תוכנה אנליטית11,14,36 כגון TrackMate פיג ' י/ImageJ37 (ראה טבלה של חומרים). מאתרת את 'x' ו- 'y' נקודות הציון של כל לוקליזציה מאת התאם גאוסיאני של נקודת העוצמה להפיץ את הפונקציה (PSF). הערה: פתרון בעיות: אם קרינה פלואורסצנטית ירוק לא נצפית או עמום מדי באזור צומת עצב-שריר בתגובה לחשיפה 488 ננומטר לייזר, לעבור בקצרה על לייזרים photoconverting את והדמיה (405 ננומטר ו-561 nm), כמו זה עוזר לייצר יותר של האדום מינים של mEos2. ולאחר מכן לעבור בחזרה אל 488 ננומטר לייזר ולקחת תמונה TIRF.</li>
</ol>4. מולקולה בודדת לוקליזציה של הזחלים קבוע
<ol><li>כדי למדוד את הגודל nanocluster חלבון באמצעות כף, החלף בינוני חרקים של שניידר לאחר ניתוח עם מקבע - paraformaldehyde 4% מעורבבת עם פוספט buffered תמיסת מלח (PBS).</li>
	<li>דגירה הזחל למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הסר הקרע פינס ולמקם הזחל קבוע mL 1.7 נקה צינור microcentrifuge snap-lock.</li>
	<li>לנתח ולפתור כמו רבים הזחלים אחרים לפי הצורך, ואז לשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS.</li>
	<li>החלף את PBS בלוק מאגר (פתרון של PBS, 0.1% טריטון X-100 ו- 3% סרום עז נורמלי).</li>
	<li>לשטוף את הזחלים עם PBS שלוש פעמים ולאחר מכן דגירה עם נוגדן ראשוני הכרחי (מדולל בפתרון מאגר בלוק).</li>
	<li>דגירה ללון בבית 4 oC.</li>
	<li>לשטוף את הזחלים 3 פעמים עם PBS ולאחר מכן דגירה עם הנוגדן משניים הדרושים (מדולל בפתרון מאגר בלוק).</li>
	<li>לשטוף את הזחלים 3 פעמים עם PBS, לצרף הזחל חזרה על בסיס PDMS, ותמונה תיאר כאמור לצורך מעקב מולקולה בודדת.</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר מולקולה בודדת מעקב של חלבונים מתויג mEos2 בצומת עצב-שריר של הזחל לחלל השלישי דרוזופילה . כדי למנוע ביטוי יתר של חלבון מהונדס, ביטוי Syntaxin-1A-mEos2 היה מונע על ידי יזם Syntaxin-1A אנדוגני. מחקרים של חלבונים סינפטיים ניידות בעיקר היה מוגבל במבחנה לחקירות של תאים בתרבית, נוירונים בקליפת המוח9,11,12,13. אם חלבונים אלה שהפגינו חתימות ניידות דומה-חיים אינו ידוע בעיקר. כדי להמחיש יחיד-חלבון ניידות ויוו, מגבלות כגון שקיפות אופטית, נגישות ועומק חדירה צריך להתגבר. לנתח ההכנה זחל והצגה של צמתי neuromuscular מוטבע על פני השטח של השריר, לנו למנוע את סוגיית אופטי שקיפות ונגישות. ניסיונות התמונה ניידות יחיד-המולקולה בתצורה רגילה של TIRF עלו בתוהו. עם זאת, השימוש תאורה עקיפה מעט מאפשר לייזר עירור מוגברת חודר לעומק. יתר על כן, סיכות minutien להשתמש כדי לשתק את הזחל עזר כדי למנוע כל השפעה שלילית אפשרי השימוש הרדמה על חלבון ניידות. זה אפשרי להשתמש מטרות הגדלה גבוהה יותר, כגון ה-100 x שמן טבילה מטרות, כדי להמחיש מולקולות יחיד בתוך vivo. עם זאת, ההגדלה מוגברת עשוי להגביר את occurance של נשתל בפוקוס. בנוסף, השתמשנו בעוצמה נמוכה יותר (~ 30%) 561 ננומטר לייזר בהצלחה את התמונה מולקולות יחיד-מסופי עצבים מוטוריים. בדיקות נוספות עשויים להידרש לשימוש עוצמת הלייזר נמוך יותר.
פרוטוקול זה מתאים להמחיש את הניידות של חלבונים סינפטיים תוך הקרבה של קרום פלזמה עצביים. באמצעות גישה זו, הניידות של החלבון מוקש - Syntaxin-1A ואת autophagosome מאוגדים חלבון Atg18a - כבר בהצלחה שבעורך vivo בתוך14,26. הניידות של חלבונים על נוירון מוטורי אקסונים ניתן גם חקר27. עם זאת, חקירת הניידות של חלבונים על מוח או בחוט הגחון עצב יכול להתברר כקשה להעריך עקב האות רקע המיוצר על ידי הרקמה הבסיסית; בנוסף, להמחיש חלבון ניידות על מבנה המוח באותו ידרוש fluorescently תיוג את מבנה המוח (כדי לוודא replicability), יהיה צורך להשתמש הדמיה כפולה-מצלמה.
השיטות הקיימות זמינים עבור סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה ב דרוזופילה מוגבלות בעיקר עוברי הדמיה, ולא יותר פיתחו השלישי לחלל זחל38,39. הבעיה העיקרית עם פרוטוקולים אלה היא כי הם תשואה מספר נמוך של מסלולים באזור עם תמונה, ומכאן למנוע ניתוח מעמיק של ניידות הברית22,40. שלנו אין ויוו מולקולה בודדת מעקב פרוטוקול יש את היכולת לייצר מספר רב של מסלולים, ולכן ניתן להשתמש במודלים של בעלי חיים אחרים כגון Caenorhabiditis elegans דג זברה. אכן, כל שרשרת NMJ שנוצר מסלולים ~ 2,400 שהופך אותו מתאים לניתוח מצבים ניידים שונים של מעברים בין מדינות אלה,14,27. בנוסף, אין ויוו מולקולה בודדת הדמיה אסטרטגיות רבות מסתמכים על השימוש בהרדמה כדי לשתק את חיות20,22, אשר עלולה לשנות את הפונקציה הפיזיולוגיות תחת אשר הסתיימה ההדמיה. כאן אנחנו אופטימיזציה פרוטוקול "ללא הרדמה" לשתק את הזחלים באמצעות סיכות minutien.
שימוש פוטנציאלי של פרוטוקול זה ייתכן המדגימה את הניידות של חלבונים בשלושה ממדים. התפתחויות אחרונות סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה לאפשר ניידות חלבון מטמיעים במבחנה ב- 'x', 'y' ו- 'z' מידות41,42. השיטה הנוכחית שלנו אינו חשבון לניידות של חלבונים בציר 'z'. עדיין העצב המוטוריים דרוזופילה מסוף הוא מבנה כדורי, בגישה בעתיד יקר יהיה לכמת חלבון ניידות ב- נפח תלת מימדי43. הדמיה ב z-המימד הוא ריאלי באמצעות עדשת אסטיגמטי. לחלופין, במצב TIRF44,45, z-הרזולוציה הוא גם גדל. עם זאת, בניסויים שלנו, השתמשנו תאורה עקיפה מעט להמחיש מולקולות יחיד של syntaxin1A-mEos2 ללא העדשה אסטיגמטי.
לסיכום, זמינות של שני הטרנסגניים דרוזופילה לטוס מלאי המבטאים חלבונים מתויג עם חלבון photoconvertible, PDMS בסיס לנתח הזחל מהונדס, וכן מיקרוסקופ TIRF מצויד עם האפשרות של שינוי זווית תאורה הם הכלים החשובים ביותר הדרוש כדי להמחיש חלבונים יחיד כפי שמתואר פרוטוקול זה.

תקשורת עצביים מסתמך על שחרור נוירוטרנסמיטר, אשר מתרחשת באמצעות היתוך גרעיני מוסדר של המכילים נוירוטרנסמיטר הסינפטיות עם קרום פלזמה1. זה תהליך הנקרא אקסוציטוזה2,3,4,5,6 הוא דינמי מאוד והוא יכול להיות למעלה או למטה-מוסדר על פי תנודות בשיעור של גירוי7. החלבונים המעורבים בתהליכים אלה כפופים תנועה בראונית ולהציג ולכן nanoscopic הארגון לשמר מגוון של איגוד פעולות לחזק אלה פונקציות פיזיולוגיים. קרום פלזמה חלבונים הם מאוד דינמי, המאפשר רוחבי השמנה של מולקולות אל תוך nanoclusters קרום פלזמה7,8,9,10,11, 12. ככזה, חוקרים את הניידות של חלבונים אלה מסייעת להבהיר שלהם למצב של פעולה8. חלבונים סינפטיים כגון מסיסים N-ethylmaleimide פקטור רגיש מצורף חלבון הקולטנים (מלכודות), לדוגמה Syntaxin-1A, ידועים כעת שהפגינו ניידות מהירה רוחבית, כמו גם לרוחב השמנה nanoclusters שיכול לשרת כמו מולקולרית מחסני ואתרי שלפוחית פיוז'ן9,13,14,15.
ההתפתחות האחרונה של חלבונים פלורסנט photoconvertible, כגון monomeric (ז)16,Eos17 קאךה18, אפשרה את הרזולוציה nanoscopic של קרום פלזמה עצביים חלבונים באמצעות גישות כאלה לוקליזציה מופעל צילום מיקרוסקופ (דקל), שחזור אופטי סטוכסטי מיקרוסקופ (סערה)14,15,19. התפתחויות אלה אפשרו חקירות לתוך הניידות ואת nanoclustering של חלבונים ביולוגי בתרבית תאים חיים, נוירונים. לאחרונה, מחקרים בוצעו להבהיר (ברזולוציות דומה גבוהה) הדינמיקה והארגון של חלבונים אלה ממברנה בתוך הנוירונים של אורגניזמים חיים שלמים כזה . מאסכאלאס, Caenorhabditis elegans, ו- דרוזופילה melanogaster14,20,21,22.
חוקרים את הדינמיקה והארגון של יישום חלבון ויוו דורשת לא רק שימוש הכלים שפותחו לאחרונה סופר-רזולוציה הדמיה (כגון דקל, סערה, photoconvertible fluorophores), אלא גם את היכולת להתגבר על מכשולים כאלה כמו נגישות של החלבון ואת עומק החדירה של הלייזר הדמיה. הדמיה חלבונים תאיים על חיים שלמים הוא מטבעו מאתגר כמו זה הדמיה חלבונים על מבנים מוטבע עמוק בתוך רקמות החיים של החיה ללא פגע, כגון ההיפוקמפוס עכבר ללא פגע. לפיכך, חלבונים או קרוב לפני השטח של הרקמה הם צילמו בקלות רבה יותר. קושי נוסף עם דימות in vivo הוא הבטחת הפארמצבטית מעבר בעלי חיים. כפי האנטומיה עלולות להיות שונות דוגמא אחת לאחרת, בחירת מבנה בקלות של שכפול בדגימות שונות בבעלי חיים שלמים גם להוכיח מאתגר. השימוש של מבנים סטריאוטיפית, כגון synapses, לעזור עם התגברות על קשיים אלה.
מחקרים שנעשו לאחרונה יש תמונה חלבון ניידות בבעלי חיים עם האפידרמיס שקוף אופטית כגון Caenorhabditis elegans22, בזמן חקירות אחרות יש תמונה ארגון החלבונים על פני השטח של איבר/רקמות, לדוגמה הדמיה אקטין בנוירונים בקליפת המוח דרך הגולגולת של העכבר חי21. במקרים מסוימים, הרדמה שימשו כדי לשמור את החיה משותק; עם זאת, הרדמה מסוים עשוי להשפיע לרעה החלבון עניין. לפיכך לבחון אמצעים חלופיים כדי לשמור על חיות משותק במהלך דימות ויוו כדי למזער את השגיאה.
אזהרה נוספת כדי סופר-רזולוציה הדמיה ויוו היא לייזרים המשמש כדי להאיר את החלבונים עניין עלול להשפיע לרעה את הרקמה שמסביב, ולכן שמירה על עוצמת עירור נמוך ככל האפשר מומלץ. תאורה של הרקמה שמסביב על ידי הלייזר גם נוטה להגביר את האות רקע. השימוש בעוצמה נמוכה עירור מסייעת להפחית את הרקע, לפרסמה להיות זה עלול להוביל לירידה התשואה פוטון חלבון פלואורסצנטי. רקע חיסור במהלך ניתוח יכול לשמש אלטרנטיבה אומר להפחית את האות רקע לפני ניתוח תמונות.
דרוזופילה מציג אורגניזם אידיאלי ויוו הדמיה כפי שהיא מספקת כלים גנטיים ומבוססת על חקירת פונקציה של חלבונים ספציפיים. הרצף הפעלת נגד הזרם (UAS)-מערכת Gal4 מאפשרת הבעה טמפורלית המרחבי של חלבונים, ולכן ניתן לתמרן עצבית23, כך התרמו-גנטית גירוי באמצעות דרוזופילה ארעית המשפחה תת פוטנציאלי קולטן A1 (dTRPA1)24 או באופטו-גנטית גירוי באמצעות far-red-העביר CsChrimson25 יכול להיות משולב עם הדמיה14. אנו היה להתגבר על הרבה סיבוכים של ביצוע ויוו מולקולה בודדת הדמיה במערכת זו, תאר איך מעקב יחיד-חלקיק יכול להתבצע בהזחלים לחלל השלישי melanogaster דרוזופילה .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">PDMS (Sylgard 184 silicone elastomer kit)</td>
			<td style="width:163px;">Dow Corning Corporation</td>
			<td colspan="2" style="width:253px;">000000000001064291</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass-bottomed Culture Dish</td>
			<td>In Vitro Scientific</td>
			<td>D29-20-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Optical Stereo-microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Curved Tweezers (Style 5/45)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0208-5AC-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Minutien Pins (0.1mm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Schneider&#39;s Insect Medium</td>
			<td>Sigma, Life Sciences</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fine Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ELYRA PS.1 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>PS.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-515Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Normal Goat Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Maxyclear snaplock microcentrifuge Tube (1.7 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Zen Black acquisition software</td>
			<td>Carl Zeiss, 2012</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Metamorph software</td>
			<td style="width:163px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:87px;">7.7.8</td>
			<td>PALM Tracer Plugin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fly strain</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">w1118; HA-Sx1A-mEos2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo single-molecule tracking at the drosophila presynaptic motor nerve terminal

מספר גדל והולך של טכניקות במיקרוסקופ סופר רזולוציה מסייעים לחשוף את המנגנונים המפקחים על העולם הסלולרי ננו. מולקולה בודדת הדמיה הוא צובר תאוצה כפי שהיא מספקת גישה יוצאת דופן הפריט החזותי של מולקולות בודדות בתאים חיים. כאן, אנו מתארים את הטכניקה שפיתחנו כדי לבצע מעקב יחיד-חלקיקים לוקליזציה מופעל צילום מיקרוסקופ (sptPALM) בהזחלים דרוזופילה . סינפטית תקשורת מסתמך על חלבונים presynaptic מפתח שפועלים על ידי עגינה, הטרמה, קידום הפיוז'ן של המכילים נוירוטרנסמיטר שלפוחית עם קרום פלזמה. מגוון רחב של אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-ליפיד בחוזקה מווסת תהליכים אלה ולהציג החלבונים presynaptic ולכן שינויים הניידות המשויכים כל אחד המאורעות מפתח. חוקרים כמה ניידות של חלבונים אלה להרכב שלהם תפקיד פיזיולוגי, חיה חיים שלמים חיוני להבנת מנגנון הפעולה המדויק שלהם. חילוץ חלבון ניידות עם רזולוציה גבוהה ב- vivo דורשת התגברות על מגבלות כגון שקיפות אופטית, נגישות, עומק החדירה. נתאר כמה חלבונים פלורסנט photoconvertible מתויג כדי החלבון presynaptic Syntaxin-1A ניתן דמיינו באמצעות תאורה עקיפה קלה, מעקב אחר בתחנה עצבים מוטוריים או לאורך האקסון של נוירון מוטורי השלישית של instar דרוזופילה זחל.

באמצעות פרוטוקול מהונדס, המפורטים לעיל, Syntaxin-1A-mEos2 Drosophilamelanogaster היו שנוצר (איור 1). הטרנסגניים השלישי instar דרוזופילה הזחלים היו גזור על הבסיס גלילי PDMS (איור 2 א-F). כדי להמחיש מולקולות יחיד של Syntaxin-1A, השתמשנו דקל על מיקרוסקופ TIRF עם תאורה לייזר מעט אלכסונית14.
מולקולות יחיד של Syntaxin-1A שהיו תחת מעקב על המסופים presynaptic עצבים מוטוריים על שריר 6 של המקטע השני בטן. ידי קרינה פלואורסצנטית הירוק של mEos2 יכול להתגלות כפי שמוצג בתמונה ברזולוציה נמוכה של Syntaxin-1A-mEos2 על סוג 1b עם העיתון ons כשהוא מתרגש באמצעות 488 ננומטר לייזר (איור 3 א). בניסויים הדמיה, כביש 405 ננומטר, 561 nm עירור לייזר במעמקי הדמיה היו 133.5 nm ו- 165.6 nm, בהתאמה. התמונה ירוק נרכשה כמו ממוצע של 16 מסגרות בודדות. הדימוי הירוק הזה נעשה שימוש כדי ליצור את האזור של ריבית המשמשת להגבלת ניתוח של localizations בסרט photoconverted אל המסופים עצבים מוטוריים presynaptic לבד.
הניתוח של סרטים sptPALM photoconverted רכשה שנוצר על עוצמת סופר-נפתרה, מקדם דיפוזיה, וממפה מסלול (איור 3 א). Syntaxin-1A-mEos2 ניידות היה עוד יותר לכמת על ידי ניתוח של העקירה ממוצע הריבועים (MSD) של מסלולים בודדים (איור 3B). השוואות סטטיסטי יכול להיעשות באמצעות השטח מתחת לעקומה MSD (איור 3B). ניתוח נוסף של ניידות מניב התפלגות מקדם דיפוזיה של Syntaxin-1A-mEos2, זה יכול להיות מוערך סטטיסטית על ידי השוואה של הנייד לאוכלוסיות משותק (איור 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig1.jpg"> איור 1 : יצירת מבנים מתויג mEos2. PFL44S-attB-MCS-w + וקטור הוא לליניארית עם BamHI ו- XbaI. קטעים חופפים תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) קידוד החלבון עניין (פוי), mEos2, בהתאמה, יכול להיות משובטים, לדוגמה, ויוו רקומבינציה בתאים שמרים ura3 - או על ידי הרכבה גיבסון. הערה כדי ליצור את transgene Syntaxin-1A-mEos2, שיבטנו הבונה ולצדו יזם Syntaxin-1A אנדוגני של שליחות קטלנית רצפים. הבונה הנוצרת כתוצאה מכך יכול להיות מוזרק לתוך עוברי דרוזופילה כדי ליצור קו לטוס הטרנסגניים לבטא את החלבון עניין (פוי) דבוקה mEos2. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig2.jpg"> איור 2 : דרוזופילה זחל לנתיחה, תאורה עקיפה. (א) הסכימה מציג ניתוח זחל דרוזופילה בוצעו על בסיס PDMS חצי-גלילי. זחל שפרוסה נערך על גבי PDMS ג'ל על ידי שימוש minutien סיכות. (בג) ההכנות זחל-PDMS הונח בתוך תבשיל שיש תת תרבות חרקים בינוני של שניידר. מיקרוסקופ TIRF בתצורה של תאורה עקיפה מעט שימש להציג באופן חזותי Syntaxin-1A-mEos2 המסופים עצבים מוטוריים. (D-F) בסיס PDMS חצי-גלילי עם זחל דרוזופילה גזור. הכנת זחל-PDMS הונח בתוך צלחת הדמיה מלאה בינוני של שניידר, הזחל צולמה על המיקרוסקופ דקל סופר רזולוציה. סולם בר, 10 מ מ. (איור זה שונה מ-14). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig3.jpg"> איור 3 : אין ויוו מעקב Syntaxin-1A-mEos2-presynaptic עצבים מוטוריים מסוף. (א) A ברזולוציה נמוכה TIRF תמונה של Syntaxin-1A-mEos2 על 1b סוג המסוף מנוע עצב. ניתוח של photoconversion סרטים עם תמונה-הרץ 33 שנוצר בעוצמה סופר-נפתרה sptPALM מקדם דיפוזיה, מסלול מפות. מסלולים בודדים 5,309 היו רכישת הסרט יותר מ-16,000 מסגרות תמונה. סולם בר, 3 μm. (בג) ממוצע הריבועים תזוזה (MSD) של Syntaxin-1A-mEos2 סומן מהתחנות עצבים מוטוריים שונים 6; השטח מתחת לעקומה MSD (AUC) נעשה שימוש כדי לכמת את רמת ניידות. התפלגות מקדם דיפוזיה חושף אוכלוסיות Syntaxin-1A ניידים, משותק ניתן לכמת כמו יחסי אחד מהשני; ממוצע של מסלולים ~ 2,400 התקבלו לכל עצבים מוטוריים מסוף (n = 3 הזחלים). הנתונים שהוצגו רשע לשגיאה הסטנדרטית של ממוצע. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal at JoVE.com

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

אין ויוו מעקב אחר בתחנת האוטובוסים Presynaptic עצבים מוטוריים דרוזופילה מולקולה בודדת

כאן אנחנו מדגימים כיצד מולקולה בודדת לוקליזציה מופעל צילום מיקרוסקופ יכול להתבצע על הטרמינל עצבים מוטוריים של חיים דרוזופילה melanogaster השלישי instar זחל.

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

in-vivo-single-molecule-tracking-at-drosophila-presynaptic-motor

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

8.4K Views.  The University of Queensland. כאן אנחנו מדגימים כיצד מולקולה בודדת לוקליזציה מופעל צילום מיקרוסקופ יכול להתבצע על הטרמינל עצבים מוטוריים של חיים דרוזופילה melanogaster השלישי instar זחל.

Video: In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

ויזואליזציה של מערכת העצבים כולה עובריים-Mount תסיסנית עוברים

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

בשנת vivo ויזואליזציה של שלפוחית ​​Synaptic בתוך האקסונים תסיסנית המגזרי הזחל

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of primary afferent fibers mediated by GABAergic axo-axonal synapses (primary afferent depolarization). The strength of primary afferent depolarization can be measured by recording of volume-conducted potentials at the dorsal root (dorsal root potentials, DRP). Pathological changes of presynaptic inhibition are crucial in the abnormal central processing of certain pain conditions and in some disorders of motor hyperexcitability. Here, we describe a method of recording DRP in vivo in mice. The preparation of spinal cord dorsal roots in the anesthetized animal and the recording procedure using suction electrodes are explained. This method allows measuring GABAergic DRP and thereby estimating spinal presynaptic inhibition in the living mouse. In combination with transgenic mouse models, DRP recording may serve as a powerful tool to investigate disease-associated spinal pathophysiology. In vivo recording has several advantages compared to ex vivo isolated spinal cord preparations, e.g. the possibility of simultaneous recording or manipulation of supraspinal networks and induction of DRP by stimulation of peripheral nerves.

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

GABAergic presynaptic inhibition is a powerful inhibitory mechanism in the spinal cord important for motor and sensory signal integration in spinal cord networks. Underlying primary afferent depolarization can be measured by recording of dorsal root potentials (DRP). Here we demonstrate a method of in vivo recording of DRP in mice.

מדידת השדרה Presynaptic עיכוב בעכברים על ידי הקלטה פוטנציאלית הגבי רוט<em&gt; בVivo</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

למה כימות Matters: אפיון פנוטיפים בבית<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחל Neuromuscular צומת

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles in the skin of the mouse pinna. The preparation is simple and relatively fast, reliably yielding extensive regions of multiple labeled units of living nerve terminals to study uptake and release of styryl pyridinium dyes extensively used in studies of vesicle recycling. Subdividing the preparations before labeling allows test vs. control comparisons in the same ear from a single individual. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the labeling and the imaging parameters. This new system is suitable for assaying pharmacologically and mechanically-induced uptake and release of these vital dyes in lanceolate terminals in both wild-type and genetically modified animals. Examples of modulatory influences on labeling intensity are given.

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

ניטור אופטי של תיוג מסוף העצב חיים זקיק השיער אזמלי Endings של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עור אוזן עכבר

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

התנהגויות חוש הריח assayed ידי מעקב ממוחשב של<em&gt; תסיסנית</em&gt; בתוך אולפקטומטר ארבעה-רביע

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

In vivo ג&#39;ין העברה בתאי שוואן בעצב מכרסמים Sciatic ידי Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

ויזואליזציה של דפוס היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים ב<em&gt; תסיסנית</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...