Мы стремимся изучить механизм слияния внутриклеточных мембран. В этом протоколе мы стремимся реализовать конформационную динамику белка атластина при слиянии мембраны эндоплазматического ретикулума во время цикла гидролиза ГТФ с помощью smFRET. Атластин может существовать в виде мономера или димера в цикле гидролиза ГТФ.
В экспериментах с одиночными молекулами сложно найти подходящие стратегии маркировки и иммобилизации белков, и ниже представлена конформационная динамика атластина на протяжении всего цикла гидролиза ГТФ. По сравнению с объемным FRET, smFRET может точно контролировать конформацию белка при различных состояниях загрузки нуклеотидов, тем самым обеспечивая прямое понимание поведения молекул-модуляторов. Мы использовали smFRET для полного разрешения цикла гидролиза ГТФ атластина при различных стратегиях позиционирования.
Мы считаем, что наши результаты будут способствовать большей конформационной динамике в изучении белков гидролиза ГТФ и обеспечат новые интерпретации редких биологических процессов. Чтобы очистить поверхность покровного стекла, с помощью пинцета возьмите восемь покровных листочков и поместите их в баночку для окрашивания. Добавьте 50 миллилитров ацетона, чтобы покрыть покровные листы, и поместите баночку для окрашивания в ультразвуковой очиститель на 30 минут.
Промойте покровные стекла трижды дважды дистиллированной водой, а затем промойте метанолом в ультразвуковом очистителе. Далее добавьте раствор пираньи в баночку для окрашивания, и нагрейте ее на водяной бане при температуре 95 градусов Цельсия в течение двух часов. Охладив банку до комнатной температуры, промойте покровные стекла шесть раз водой двойной дистилляции.
Добавьте раствор метоксида натрия в баночку для окрашивания и поместите ее в ультразвуковой очиститель на 15 минут. Промыв покровные стекла водой, добавьте в баночку для окрашивания дважды дистиллированную воду и поместите ее в ультразвуковой очиститель на 15 минут. Зажмите покровные стекла в банке для окрашивания и обсушите их азотом.
Переложите высушенные покровные листы в другую банку для окрашивания, и запекайте банку в сушильной духовке при температуре 120 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем охладите банку до комнатной температуры в эксикаторе. Добавьте в стакан 47,5 миллилитров метанола, 2,5 миллилитра уксусной кислоты и 0,5 миллилитров триэтоксисилана и равномерно перемешайте.
Переложите смесь в банку для окрашивания и выдерживайте 10 минут. Промойте покровные стекла три раза водой двойной дистилляции в банке для окрашивания и проработайте ультразвуком в течение пяти минут. Промыв покровные стекла водой и высушив их азотом, как показано на рисунке, поместите покровные стекла в чашку Петри диаметром 10 сантиметров.
Растворите SVA-mPEG и SVA-mPEG-биотин в растворе с высоким содержанием соли в соотношении 1:100. Насыпьте приготовленную смесь на покровное стекло и накройте его другим покровным стеклом. Инкубируйте покровные стекла с соответствующей влажностью в течение двух часов или на ночь.
После модификации отделите покровные стекла, промойте их деионизированной водой, высушите феном с азотом. Аккуратно поместите модифицированный покровный листик в 50-миллилитровую трубку. После очистки домена ГТФазы динаминоподобного белка атластина или ATL, экспрессируемого в клетках Rosetta E.coli, замените белковый буфер на буфер биотинилирования белка с помощью центробежного фильтра мощностью 10 килодальтон.
Для биотинилирования белка смешайте по 100 микролитров 100-миллимолярной АТФ, 100-миллимолярного ацетата магния и 500-микролярного D-биотина, 10 микролитров 100-микролярной биотиновой лигазы BirA и 50 микромолей белка до конечного объема одного миллилитра. Инкубируйте смесь в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день удалите свободный D-биотин с помощью центробежного фильтра с молекулярной массой 10 килодальтон.
Инкубируйте 20 микролитров биотинилированного белка с 20 микролитрами 15-микромолярного стрептавидина в течение 20 минут на льду. Определите эффективность биотинилирования белка с помощью SDS-PAGE. Растворите флуорофоры LD555 и LD655 в диметилсульфоксиде до конечной концентрации пять миллимоляров.
Чтобы приготовить меченый буфер, смешайте 25 миллимоляров HEPES, 150 миллимоляров хлорида калия и пять миллимоляров хлорида магния. Замените белковый буфер на меченый с помощью центробежного фильтра мощностью 10 килодальтон. Для внутримолекулярных анализов smFRET смешивают ATL1cyto-TK с LD555 и LD655 в соотношении 1:1,2:1,2 до конечного объема 100 микролитров.
Выдерживайте смесь в течение пяти часов при температуре четыре градуса Цельсия. Для межмолекулярных анализов smFRET инкубируют ATL1cyto-K с LD555 и биотинилированный ATL1cyto-K с LD655 в течение пяти часов при четырех градусах Цельсия. Чтобы подготовить камеру иммобилизации белка, тщательно приклейте модифицированный покровный стекло и предметное стекло микроскопа с помощью специальной двусторонней ленты.
Установите шланги и наконечники, чтобы сформировать микрофлюидную камеру с шестью каналами. Для картирования поправок добавьте 10 микролитров 10% частиц полистирола на предметное стекло микроскопа и накройте его покровным стеклом. Затем под флуоресцентным микроскопом с полным внутренним отражением выбрать поле зрения, содержащее частицы полистирола, и снять видео в режиме яркого поля.
Используйте пользовательский скрипт для выравнивания центрального расположения одной и той же частицы полистирола в каналах донора и акцептора. Сохраните файл карты в формате TXT. Для межмолекулярных экспериментов с smFRET смешивают меченый LD555 ATL1cyto-K с меченым LD655 ATL1cyto-K-биотином в соотношении один к одному с конечной концентрацией одного миллимоляра GTP-гамма-S.
Инкубируйте смесь на льду в течение одного часа, чтобы димеризовать белки. Смешайте меченый LD555 ATL1cyto-T с меченым LD655 ATL1cyto-K-биотином в соотношении один к одному с одним миллимоляром GTP-гамма-S для межмолекулярных экспериментов с ATL1cyto-T и ATL1cyto-K smFRET. Инкубируйте смесь на льду в течение одного часа до получения димеризованных белков.
Затем, для внутримолекулярного анализа smFRET, инкубируйте LD555 и LD655, меченные ATL1cyto-TK, с одним миллимоляром GDP на льду в течение одного часа. Для межмолекулярных экспериментов инкубируйте 10 микрограммов стрептавидина на миллилитр в течение 10 минут, чтобы обездвижить белки. Для внутримолекулярных анализов добавьте 10 микрограммов на миллилитр биотинилированных антител против His и инкубируйте в течение 10 минут для иммобилизации белков.
После инкубации добавьте разведенный димер ATL1 к белку в канале и дайте ему обездвижиться в течение 10 минут. Дважды промойте канал инкубационным буфером. Добавьте в канал бензойную кислоту и ПХД в конечной концентрации 2,5 миллимоляра.
Выберите лазер с яркостью 532 нанометра в качестве возбуждающего источника света. Настройте камеру EMCCD на запись данных с интервалом кадров 30 миллисекунд. Сохраняйте записанные видеоролики в 16-битном формате TIFF.
После сбора данных извлеките треки FRET из записанных видеороликов. Выберите и сохраните треки FRET в формате TXT. Извлеките данные из файлов TXT и рассчитайте значения FRET с помощью самодельных скриптов в MATLAB.
Подгонка данных smFRET от GaussAmp в Origin для получения гистограммы распределения.
