Wir haben es uns zur Aufgabe gemacht, den Fusionsmechanismus intrazellulärer Membranen zu untersuchen. In diesem Protokoll versuchen wir, die Konformationsdynamik des endoplasmatischen Retikulummembran-Fusionsproteins Atlastin während seines GTP-Hydrolysezyklus mit smFRET zu realisieren. Atlastin kann als Monomer oder Dimer im GTP-Hydrolysezyklus vorliegen.
In Einzelmolekülexperimenten ist es schwierig, geeignete Strategien zur Proteinmarkierung und Immobilisierung zu finden, und im Folgenden wird die Konformationsdynamik von Atlastin während des gesamten GTP-Hydrolysezyklus dargestellt. Im Vergleich zu Bulk-FRET kann smFRET Proteinkonformationen unter verschiedenen Nukleotidbeladungszuständen genau überwachen und so einen direkten Einblick in das Verhalten von Modulatormolekülen geben. Wir verwendeten das smFRET, um den GTP-Hydrolysezyklus von Atlastin während verschiedener Positionsstrategien vollständig aufzulösen.
Wir glauben, dass unsere Ergebnisse eine stärkere Konformationsdynamik bei der Untersuchung von GTP-Hydrolyseproteinen fördern und neue Interpretationen seltener biologischer Prozesse ermöglichen werden. Um die Oberfläche des Deckglases zu reinigen, nehmen Sie mit einer Pinzette acht Deckgläser auf und legen Sie sie in ein Beizglas. Fügen Sie 50 Milliliter Aceton hinzu, um die Deckgläser zu bedecken, und stellen Sie das Färbeglas für 30 Minuten in einen Ultraschallreiniger.
Spülen Sie die Deckgläser dreimal mit doppelt destilliertem Wasser ab und waschen Sie sie mit Methanol in einem Ultraschallreiniger. Geben Sie dann Piranha-Lösung in das Färbeglas und erhitzen Sie sie in einem Wasserkocher im Wasserbad bei 95 Grad Celsius für zwei Stunden. Nachdem Sie das Glas auf Raumtemperatur abgekühlt haben, spülen Sie die Deckgläser sechsmal mit doppelt destilliertem Wasser aus.
Geben Sie die Natriummethoxidlösung in das Färbeglas und legen Sie sie 15 Minuten lang in den Ultraschallreiniger. Nachdem Sie die Deckgläser mit Wasser abgespült haben, geben Sie doppelt destilliertes Wasser in das Färbeglas und legen Sie es für 15 Minuten in den Ultraschallreiniger. Klemmen Sie die Deckgläser in den Färbebehälter und trocknen Sie sie mit Stickstoff ab.
Übertragen Sie die getrockneten Deckgläser in ein anderes Färbeglas und backen Sie das Glas im Trockenofen bei 120 Grad Celsius für 30 Minuten. Kühle das Glas dann in einem Exsikkator auf Raumtemperatur ab. 47,5 Milliliter Methanol, 2,5 Milliliter Essigsäure und 0,5 Milliliter Triethoxysilan in ein Becherglas geben und gleichmäßig mischen.
Die Mischung in das Färbeglas geben und 10 Minuten inkubieren. Spülen Sie die Deckgläser dreimal mit doppelt destilliertem Wasser im Färbeglas ab und beschallen Sie sie fünf Minuten lang. Nachdem Sie die Deckgläser mit Wasser gespült und wie gezeigt mit Stickstoff getrocknet haben, legen Sie die Deckgläser in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 10 Zentimetern.
SVA-mPEG und SVA-mPEG-Biotin werden in der salzreichen Lösung im Verhältnis 1:100 gelöst. Lassen Sie die vorbereitete Mischung auf ein Deckglas fallen und bedecken Sie es mit einem weiteren Deckglas. Inkubieren Sie die Deckgläser zwei Stunden lang oder über Nacht bei entsprechender Luftfeuchtigkeit.
Trennen Sie nach der Modifikation die Deckgläser, spülen Sie sie mit entionisiertem Wasser ab und föhnen Sie sie mit Stickstoff. Legen Sie das modifizierte Deckglas vorsichtig in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Nach der Reinigung der GTPase-Domäne des Dynamin-ähnlichen Proteins Atlastin oder ATL, das in Rosetta E.coli-Zellen exprimiert wird, wird der Proteinpuffer mit einem 10-Kilodalton-Zentrifugalfilter in den Protein-Biotinylierungspuffer umgewandelt.
Für die Proteinbiotinylierung mischen Sie jeweils 100 Mikroliter 100 Millimolar ATP, 100 Millimolar Magnesiumacetat und 500 Mikromolar D-Biotin, 10 Mikroliter 100 Mikromolare BirA-Biotin-Ligase und 50 Mikromolar Protein zu einem Endvolumen von einem Milliliter. Inkubieren Sie die Mischung über Nacht bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie am nächsten Tag das freie D-Biotin mit einem 10-Kilodalton-Zentrifugalfilter mit Molekulargewicht.
Inkubieren Sie 20 Mikroliter biotinyliertes Protein mit 20 Mikrolitern 15-mikromolarem Streptavidin für 20 Minuten auf Eis. Nachweis der Effizienz der Proteinbiotinylierung mit SDS-PAGE. Die Fluorophore LD555 und LD655 werden in Dimethylsulfoxid bis zu einer Endkonzentration von fünf Millimolar gelöst.
Zur Herstellung des Markierungspuffers mischen Sie 25 Millimolare HEPES, 150 Millimolare Kaliumchlorid und fünf Millimolare Magnesiumchloride. Tauschen Sie den Proteinpuffer mit einem 10-Kilodalton-Zentrifugalfilter gegen einen Markierungspuffer aus. Mischen Sie für intramolekulare smFRET-Assays ATL1cyto-TK mit LD555 und LD655 in einem Verhältnis von 1:1,2:1,2 auf ein Endvolumen von 100 Mikrolitern.
Inkubieren Sie die Mischung fünf Stunden lang bei vier Grad Celsius. Für intermolekulare smFRET-Assays inkubieren Sie ATL1cyto-K mit LD555 und biotinyliertes ATL1cyto-K mit LD655 für fünf Stunden bei vier Grad Celsius. Um die Proteinimmobilisierungskammer vorzubereiten, kleben Sie das modifizierte Deckglas und den Objektträger vorsichtig mit einem kundenspezifischen doppelseitigen Klebeband fest.
Installieren Sie Schläuche und Spitzen, um eine mikrofluidische Kammer mit sechs Kanälen zu bilden. Für Mapping-Korrekturen geben Sie 10 Mikroliter 10%ige Polystyrolpartikel auf einen Objektträger und decken Sie ihn mit einem Deckglas ab. Wählen Sie dann unter einem Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskop ein Sichtfeld mit Polystyrolpartikeln aus und nehmen Sie ein Video im Hellfeldmodus auf.
Verwenden Sie ein benutzerdefiniertes Skript, um die Mittelposition desselben Polystyrolpartikels sowohl im Donor- als auch im Akzeptorkanal auszurichten. Speichern Sie die Zuordnungsdatei als TXT-Datei. Für intermolekulare smFRET-Experimente mischen Sie LD555 markiertes ATL1cyto-K mit LD655 markiertem ATL1cyto-K-biotin in einem Eins-zu-Eins-Verhältnis mit einer Endkonzentration von einem Millimolar GTP-gamma-S.
Inkubieren Sie die Mischung eine Stunde lang auf Eis, um die Proteine zu dimerisieren. Mischen Sie LD555-markiertes ATL1cyto-T mit LD655-markiertem ATL1cyto-K-biotin in einem Eins-zu-Eins-Verhältnis mit einem Millimolar GTP-gamma-S für intermolekulare smFRET-Experimente mit ATL1cyto-T und ATL1cyto-K. Inkubieren Sie die Mischung eine Stunde lang auf Eis, um dimerisierte Proteine zu erhalten.
Für intramolekulare smFRET-Assays inkubieren Sie dann LD555 und LD655 markiertes ATL1cyto-TK mit einem Millimolar GDP eine Stunde lang auf Eis. Für intermolekulare Experimente inkubieren Sie 10 Mikrogramm pro Milliliter Streptavidin für 10 Minuten, um Proteine zu immobilisieren. Für intramolekulare Assays fügen Sie 10 Mikrogramm pro Milliliter biotinylierten Anti-His-Antikörper hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang, um Proteine zu immobilisieren.
Geben Sie nach der Inkubation das verdünnte ATL1-Dimer zu dem Protein im Kanal und lassen Sie es 10 Minuten lang immobilisieren. Spülen Sie den Kanal zweimal mit einem Inkubationspuffer. Geben Sie Benzoesäure und PCD in einer Endkonzentration von 2,5 Millimolar in den Kanal.
Wählen Sie den 532-Nanometer-Laser als Anregungslichtquelle. Stellen Sie die EMCCD-Kamera so ein, dass Daten in einem Bildintervall von 30 Millisekunden aufgezeichnet werden. Speichern Sie die aufgenommenen Filme im 16-Bit-TIFF-Format.
Extrahieren Sie nach der Datenerfassung FRET-Spuren aus den aufgenommenen Filmen. Wählen Sie FRET-Spuren im TXT-Format aus und speichern Sie sie. Extrahieren Sie die Daten aus den TXT-Dateien und berechnen Sie die FRET-Werte mit hausgemachten Skripten in MATLAB.
Passen Sie die smFRET-Daten mit GaussAmp in Origin an, um das Verteilungshistogramm zu erhalten.
