אנו מציגים גישה ניסויית רבת ערך לחקירת הקינטיקה של הפעלה פתאומית של נוירונים אוטונומיים פנימיים בלבבות מפוצצים והאינטראקציה בין פעילות קטכולמינרגית וכולינרגית לבבית. לבבות עכברים מעוגלים יכולים להיות רגישים מאוד לשינויים בסביבה, כגון טמפרטורה, חמצון וריכוז פרפוזט. הם דורשים ניטור הדוק יותר מאשר מודלים של בעלי חיים גדולים יותר.
בנוסף, המיקרו-LED יכול לקחת קצת ניסוי וטעייה בהתחלה כדי לקבל תוצאות עקביות. אנו פועלים כדי להבין מה קורה בלב כאשר המערכת הסימפתטית והפאראסימפתטית מופעלות בו זמנית. מה שחדש הוא שאנו חוקרים את הנושא הזה באמצעות אופטוגנטיקה כדי לעורר את גרעיני הלב והנוירונים בתוך הלב עצמו.
המיקרו-LED המוצג כאן הוא בעלות נמוכה ופשוט יחסית לשכפול. בשל גודלו, המיקרו LED ניתן לתמרון ויכול לכוון לאזורי לב בצורה מדויקת יותר ממקורות אור גדולים יותר. כדי להתחיל, תחת מיקרוסקופ מנתח באזור מאוורר היטב, הלחמו את הקצוות המופשטים של שני חוטי נחושת מבודדים לנקודות המגע של מיקרו-LED בגודל 465 ננומטר.
חבר את המיקרו-LED למקור חשמל, והפעל אותו כדי לבדוק את ההלחמה. חותכים את החלק התחתון של סנטימטר אחד של קצה פיפטה מסונן של 200 מיקרוליטר. דחוף את המסנן החוצה באמצעות מוט בקוטר קטן.
הכנס את המיקרו-LED עם חוטים מחוברים לקצה הפיפטה כך שהנורית תהיה צמודה לקצה הקצה. החזר את המסנן בחלק העליון של קצה הפיפטה כדי לאבטח את הנורית והחוטים. לאחר מכן הדביקו את שולי הנורית לקצה הפיפטה.
הניחו לדבק-העל להתייבש. להכנת אלסטומר סיליקון, מערבבים את הבסיס וחומר הריפוי עד שהתמיסה הופכת אחידה. הסר את כל הבועות מהתערובת באמצעות תא ואקום.
לאחר מכן, קח צינור צנטריפוגה של 0.5 מיליליטר וציין את הצדדים כדי להקל על הסרת LED. הדביקו את החלק החיצוני של צינור הצנטריפוגה כדי למנוע דליפה. שופכים כ- 0.2 מיליליטר מאלסטומר הסיליקון לצינור.
הנח את קצה הפיפטה של המיקרו-LED לתוך הצינור, והבטיח לפחות מילימטר אחד של רווח בין ה-LED לתחתית הצינור. הכניסו את צינור הצנטריפוגה מיקרו-LED זקוף לתנור של 50 מעלות צלזיוס למשך שמונה שעות או למשך הלילה. לאחר שהאלסטומר מתקשה, הסר את הנורית מהצינור.
לאחר הריפוי, חתוך את כל האלסטומר העודף מקצה ה-LED בעזרת סכין שירות מדויקת ולא משאיר יותר ממילימטר אחד. כדי להתחיל, הוסף 175 מיליליטר של תמיסת Krebs-Henseleit או KH למערכת הזלוף. הנח מסנן ממברנה של 10 מיקרומטר במערכת הזילוף של לנגנדורף.
ואז התחל במחזור. הפעל את אמבטיות המים והגדר אותן כך שישמרו על טמפרטורת הפרפוזה על 37 מעלות צלזיוס. כדי לכייל את מד הזרימה, עצור את הזרימה במערכת הזלוף באמצעות תא עצירה.
לאחר מכן לחץ על כפתור האפס במד הזרימה כדי לבצע את הכיול. פתח את התוכנה לרכישת נתונים של LabChart. הגדר את התוכנה כך שתכלול 12 ערוצים.
הגדר ערוצים לטמפרטורת אמבט הלב, טמפרטורת פרפוזה אבי העורקים, א.ק.ג מוביל אחד עד שלושה עבור מובילים ממוחשבים נוספים, חישוב דופק, קצב זרימה ופלט מחולל פונקציות למעקב אחר פולסי LED. לאחר מכן, השתמש בערוץ המיועד לדופק כדי לחשב דופק. הפעל את תכונת המדידות המחזוריות, והגדר אותה לזהות א.ק.ג של עכבר בעופרת אחת.
השתמש בהרחבת Cardio Access של LabChart כדי לחשב שלושה מוליכים aVR, aVL ו-aVF על סמך מוליכים 1 ו-2. לאחר הרדמה והמתת חסד של העכבר, החזק את תהליך ה-xiphoid עם זוג מלקחיים, וחתוך לתוך חלל הבטן בעזרת מספריים כירורגיים. חותכים בזהירות את הסרעפת כדי לפתוח את חלל בית החזה.
לאחר מכן חותכים את הצלעות כדי לחשוף את הלב והריאות. תפסו בעדינות את הריאות והוציאו את הלב והריאות. מניחים את הלב בכלי המכיל תמיסת KH הפריניזציה.
הסר את הריאות ואת כל משקעי השומן הגדולים. תחת מיקרוסקופ מנתח, הגדר להגדלה פי 2. מעבירים את הלב הנקי לצלחת שנייה של תמיסת KH הפריניזציה.
אתר את אבי העורקים והחלק אותו על הצינורית בעזרת מלקחיים עדינים. אבטח את הלב לצינורית עם תפר משי 4-0. לאחר מכן, שטפו את הצינורית עם בולוס של KH הפריני כדי להסיר דם מכלי הדם הכליליים.
חבר את הלב המשונן למערכת הזלוף והנח אותו בצלחת PDMS מלאה בפרפוזה. הנח אלקטרודות מחט א.ק.ג בצלחת ה-PDMS לפי המשולש של איינטהובן. סובב את הלב כך שהאטריום השמאלי יהיה נגיש.
השתמש במספריים מיקרו לפתיחה עצמית כדי ליצור חתך של מילימטר אחד באטריום השמאלי. הכנס צינור בקוטר מילימטר אחד לחתך כדי לאפשר לפרפוזה הכלואה בחדר השמאלי להתנקז. לאחר מכן, סובב את הלב כך שהפרוזדור הימני פונה כלפי מעלה והצומת הסינו-פרוזדורי נגיש להארה.
כוונן את אלקטרודות האק"ג לפי הצורך על ידי קירובן ללב כדי לשפר את יחס האות לרעש. להפעלה אופטוגנטית, חבר את מכשיר המיקרו-LED למחולל פונקציות והגדר אותו לייצור גלי דופק בתדר של 10 הרץ, רוחב דופק של 30 אלפיות השנייה ומשרעת של 10 וולט שיא לשיא. הנח את המיקרו-LED בעדינות על הצומת הסינו-פרוזדור.
לאחר מכן הפעל את מחולל הפונקציות וצפה בשינויים בקצב הלב כתוצאה מגירוי אור. שינויים מיידיים בקצב הלב מצביעים על הפעלה יעילה. כבה את מחולל הפונקציות.
אפשר לדופק לחזור לרמות שלפני ההפעלה. אם הפעלה אופטוגנטית גורמת לשינוי דופק של פחות מ-100 פעימות לדקה, מקם מחדש את המיקרו-LED כדי להאיר את הנוירונים בפרוזדור הימני. גירוי אופטוגנטי של נוירוני ChAT הפחית את קצב הלב ביותר מ-100 פעימות לדקה במהלך גירוי אור ללא נוראדרנלין ששמר על ההפחתה לאורך כל הגירוי.
עם 2,000 ננומול של נוראדרנלין, קצב הלב ירד ב-40 פעימות לדקה והחל להתאושש לפני כיבוי האור. דיכוי אופטוגנטי של קצב הלב על ידי גירוי נוירולוגי ChAT היה פחות יעיל בהתגברות על עליות קצב הלב שנגרמו על ידי מינונים גבוהים של נוראדרנלין, וכתוצאה מכך זמני דיכוי קצרים יותר וירידות קטנות יותר בקצב הלב.
