灌流された心臓における突然の内因性自律神経ニューロン活性化の動力学と、心臓カテコール作動性ニューロンとコリン作動性活性の間の相互作用を調査するための貴重な実験的アプローチを提示します。灌流マウスの心臓は、温度、酸素化、灌流液濃度などの環境の変化に非常に敏感です。大型の動物モデルよりも綿密なモニタリングが必要です。
さらに、マイクロLEDは、一貫した結果を得るために、最初は試行錯誤が必要な場合があります。私たちは、交感神経系と副交感神経系が同時に活性化すると心臓で何が起こるかを理解するために取り組んでいます。新しいのは、光遺伝学を使用して、心臓自体の心臓神経節とニューロンを光刺激するために、このトピックを研究していることです。
ここに示すマイクロLEDは低コストで、比較的簡単に複製できます。そのサイズにより、マイクロLEDは操作性が高く、大きな光源よりも正確に心臓の領域をターゲットにすることができます。まず、換気の良い場所で解剖顕微鏡で、絶縁された2本の銅線の剥がれた端を465ナノメートルのマイクロLEDの接点にはんだ付けします。
マイクロLEDを電源に接続し、電源を入れてはんだ付けをテストします。200マイクロリットルのフィルター付きピペットチップの底を1センチカットします。小径ロッドでフィルターを押し出します。
ワイヤーが取り付けられたマイクロLEDをピペットチップに挿入して、LEDがチップの端と同じ高さになるようにします。ピペットチップの上部にあるフィルターを元に戻し、LEDとワイヤーを固定します。次に、LEDの端をピペットの先端に瞬間接着します。
瞬間接着剤を乾かします。シリコーンエラストマーを調製するには、溶液が均一になるまでベースと硬化剤を混合します。真空チャンバーを使用して混合物から気泡を取り除きます。
次に、0.5ミリリットルの遠心分離管を取り、LEDの取り外しを容易にするために側面に切り込みを入れます。漏れを防ぐために、遠心分離管の外側をテープで留めます。約0.2ミリリットルのシリコーンエラストマーをチューブに注ぎます。
マイクロLEDピペットの先端をチューブに入れ、LEDとチューブの底との間に少なくとも1ミリメートルのスペースを確保します。遠心分離管のマイクロLEDを直立させて摂氏50度のオーブンに8時間または一晩置きます。エラストマーが硬化したら、LEDをチューブから取り外します。
硬化したら、LED先端から余分なエラストマーを精密な万能ナイフで切り取り、1mm以下にします。まず、175ミリリットルのKrebs-HenseleitまたはKH溶液を灌流システムに追加します。10マイクロメートルのメンブレンフィルターをランゲンドルフ灌流システムに配置します。
その後、循環を開始します。ウォーターバスの電源を入れ、灌流液の温度を摂氏37度に維持するように設定します。流量計を校正するには、ストップコックを使用して灌流システムの流れを停止します。
次に、流量計のゼロボタンを押してキャリブレーションを実行します。LabChartデータ集録ソフトウェアを開きます。12 チャネルを含むようにソフトウェアを構成します。
心槽温度、大動脈灌流温度、ECGリード1〜3のチャンネルを設定し、追加の計算リード、心拍数の計算、流量、およびLEDパルスを追跡するための関数発生器出力を設定します。次に、心拍数に指定されたチャネルを使用して心拍数を計算します。周期測定機能を有効にし、リード1のマウスECGを検出するように設定します。
LabChartのCardiac Access拡張機能を使用して、リード1と2に基づいてリード3のaVR、aVL、およびaVFを計算します。マウスに麻酔をかけ、安楽死させた後、一対の鉗子で剣状突起を保持し、手術用ハサミを使用して腹腔内に切り込みます。ダイヤフラムを慎重に切り込み、胸腔を開きます。
次に、肋骨を切り裂いて心臓と肺を露出させます。肺をそっとつかみ、心臓と肺を切除します。ヘパリン化KH溶液が入った皿に心臓を入れます。
肺と大きな脂肪沈着物を取り除きます。解剖顕微鏡で、倍率2倍に設定します。洗浄した心臓をヘパリン処理されたKH溶液の2番目の皿に移します。
大動脈の位置を特定し、細い鉗子を使用してカニューレの上にスライドさせます。4-0シルク縫合糸で心臓をカニューレに固定します。次に、カニューレをヘパリン化KHのボーラスで洗い流し、冠状血管から血液を取り除きます。
カニューレを装着した心臓を灌流システムに接続し、灌流液を充填したPDMSディッシュに入れます。ECG針電極をアイントホーフェンの三角形に従ってPDMSディッシュに配置します。左心房にアクセスできるように心臓を回転させます。
マイクロセルフオープンハサミを使用して、左心房に1ミリメートルの切開を作成します。直径1mmのチューブを切開部に挿入し、左心室に閉じ込められた灌流液を排出します。次に、心臓を回転させて、右心房が上を向き、洞房結節が照明にアクセスできるようにします。
必要に応じてECG電極を心臓に近づけて調整し、S/N比を改善します。光遺伝学的活性化のためには、マイクロLEDデバイスを関数発生器に接続し、周波数10ヘルツ、パルス幅30ミリ秒、振幅10ボルトのピークツーピークのパルス波を生成するように構成します。マイクロLEDを洞房結節にそっと置きます。
次に、関数発生器をオンにして、光刺激による心拍数の変化を観察します。心拍数の即時の変化は、効果的な活性化を示します。関数ジェネレータをオフにします。
心拍数がアクティベーション前のレベルに戻るのを待ちます。光遺伝学的活性化の結果、心拍数の変化が100BPM未満の場合は、マイクロLEDの位置を変更して、右心房のニューロンを照らします。ChATニューロンの光遺伝学的刺激は、光刺激中に心拍数を100BPM以上減少させましたが、ノルエピネフリンは刺激全体を通じて減少を維持しませんでした。
ノルエピネフリンが2, 000ナノモルの場合、心拍数は40 BPM低下し、ライトが消灯する前に回復し始めました。ChATニューロン光刺激による心拍数の光遺伝学的抑制は、高ノルエピネフリン用量によって引き起こされる心拍数増加の克服にあまり効果がなかったため、抑制時間が短縮され、心拍数の低下が小さかった。
